何春梅 曾柔 林進龍 項文懿 張悌吉 王松清 莊明珠 葉乃興 金珊

關(guān)鍵詞：龍團鳳餅；品質(zhì)成分；點茶沫餑；代謝物；廣泛靶向代謝組學

北苑貢茶產(chǎn)于福建省建甌市，始現(xiàn)于南唐，興盛于宋元，極具盛名[1-3]。當前，建甌市按照茶文化、茶產(chǎn)業(yè)、茶科技“三茶”統(tǒng)籌的要求，加快茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量步伐，將當?shù)貧v史名茶龍團鳳餅、南路水仙、矮腳烏龍等統(tǒng)一到“北苑貢茶”公共品牌下，重振建甌“北苑貢茶”品牌，大力促進北苑貢茶的文化、產(chǎn)業(yè)和科技的融合發(fā)展[4-5]。北苑貢茶中最著名的當數(shù)龍團鳳餅。龍團鳳餅是以帶有龍鳳圖案的模具壓制成的茶餅，在北宋期間深受帝王喜愛[6]。點茶則是以龍團鳳餅為原料，將其碾磨成粉，經(jīng)茶羅篩出茶粉，注水擊拂，形成極具觀賞性的沫餑（湯花）的技藝[7]。北苑貢茶和點茶技藝作為中華傳統(tǒng)文化的載體，承載著經(jīng)濟與文化雙重價值，是我國的優(yōu)秀文化遺產(chǎn)[8]。

然而，前人關(guān)于龍團鳳餅茶的研究大多著重于其歷史發(fā)展、工藝溯源和文化意義的解讀[9-11]，鮮有對其化學品質(zhì)及點茶沫餑成分的研究。目前關(guān)于龍團鳳餅的各類研究報道均屬于文史類論文。雖然黃鑒舜等[12]在1993年概述了形成茶沫的主要物質(zhì)以及憎水性固體粉末，并討論了點茶“湯花”形成與穩(wěn)定的影響因素。但是，該綜述性論文主要通過茶葉中的基礎物質(zhì)來推斷“湯花”的物質(zhì)組成，并未對點茶沫餑的生化成分進行測定。梁爽等[13]研究了紅茶汁液態(tài)發(fā)酵時生成的泡沫組成成分，研究得出產(chǎn)生的泡沫會帶走茶葉中較多的品質(zhì)成分，雖然該論文能側(cè)面反映茶葉沫餑中的物質(zhì)組成，但是，其試驗材料為茶葉鮮葉經(jīng)萎凋后的勻漿液通氣發(fā)酵過程中收集的泡沫，跟龍團鳳餅點茶技藝制備的沫餑截然不同。

為探索龍團鳳餅的品質(zhì)化學特點，了解點茶沫餑中的組成成分，本研究以建甌市水仙茶樹品種為原料，以北苑貢茶研膏茶傳統(tǒng)工藝制得團餅茶（龍團鳳餅），以建甌現(xiàn)代閩北烏龍茶加工工藝制得條形散茶（南路水仙）；以團餅茶為原料，經(jīng)點茶技藝獲得點茶沫餑與茶湯，測定和比較龍團鳳餅和南路水仙的主要品質(zhì)化學成分，并利用廣泛靶向代謝組學技術(shù)檢測和對比點茶沫餑和茶湯中的代謝物，解析點茶沫餑中的功能成分，以期為北苑貢茶文化和茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學支撐。

1材料與方法

1.1材料

團餅茶（又稱研膏茶）以福建省建甌市南雅鎮(zhèn)閩北烏龍茶科技小院示范基地松清茶業(yè)茶園的水仙茶樹品種的新梢為原料，經(jīng)采茶、揀芽、泉水濯芽、蒸芽、杵磨研碾、壓片去膏、烘焙成型等工序制得，制作時間為2021年4月，地點為福建省建甌市南雅鎮(zhèn)閩北烏龍茶科技小院示范基地松清茶業(yè)茶廠。取得樣品后用食品級自封袋避光密封保存于4℃冰箱內(nèi)。散茶為同一時期同一茶園相同茶樹品種鮮葉，以閩北烏龍茶制作工藝制得的建甌水仙，具體加工過程包括茶葉采摘、萎凋、做青、殺青、揉捻和烘焙。

生化成分測定所用化學試劑均購自福州美利莎生物科技有限公司。代謝組試驗所用試劑為甲醇、乙腈，色譜純（德國Merck公司）。標準品，色譜純（美國BioBioPha/Sigma-Aldrich公司）。

點茶所用建盞與茶筅由福建農(nóng)林大學茶學重點實驗室提供。生化成分測定所用UV-2700紫外可見分光光度計（日本島津公司）。代謝組實驗所用儀器設備：凍干機（Scientz-100F），研磨儀（MM400，Retsch），超高效液相色譜儀（日本島津公司），串聯(lián)質(zhì)譜（美國賽默飛世爾科技公司），SB-C18色譜柱（1.8μm，2.1mm×100mm，美國安捷倫公司）。

1.2方法

1.2.1團餅茶和散茶品質(zhì)相關(guān)成分的測定磨碎茶樣制備：將團餅茶和散茶磨碎并過40目篩。

茶葉含水量測定：參照120℃快速法[14]測定，每個重復用3g（精確到0.001g）茶樣。

茶葉水浸出物含量測定：稱取1g（精確到0.001g）磨碎茶樣于500mL錐形瓶中，加入300mL煮沸蒸餾水，搖勻。100℃水浴浸提30min，每10min搖動1次。趁熱減壓過濾。其余步驟和計算方法參照GB/T8305—2013[15]。

茶多酚總量、游離氨基酸總量、咖啡堿含量測定：分別參照GB/T8313—2002[16]、GB/T8314—2013[17]、GB/T8312—2013[18]中的方法。

茶黃素、茶紅素和茶褐素含量測定：參照系統(tǒng)分析法[19]。稱取3g（精確到0.001g）茶樣，計算結(jié)果以干態(tài)質(zhì)量分數(shù)表示。

1.2.2沫餑和茶湯制備將團餅茶磨碎，過200目篩，用100℃沸水燙建盞，取3g（精確到0.01g）茶粉，加入熱水共75mL，以點茶法擊拂茶湯制得沫餑，取盡沫餑后過濾取得茶湯（圖1）。本研究以茶湯（tealiquid，TL）和沫餑（teafoam，TF）為材料。取上層沫餑和剩余茶湯分別加入50mL離心管，于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩V泛靶向代謝組檢測由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。設置3個重復，沫餑樣品分別標TF-1、TF-2、TF-3，茶湯樣品分別標為TL-1、TL-2、TL-3。

1.2.3樣品前處理將沫餑和茶湯樣品真空冷凍干燥后，于研磨儀中均勻研磨至粉末狀。參考林潔鑫等[20]的樣品制備方法制得樣本提取物，將樣本提取物保存于2.0mL棕色進樣瓶中，于?80℃冰箱保存，用于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahighperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometrytandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS）分析。

1.2.4超高效液相色譜條件采用AgilentSB-C18色譜柱，規(guī)格為1.8μm，2.1mm×100mm，流動相洗脫梯度設置如表1所示。流速設置為0.35mL/min，柱溫設置為40℃，進樣量為4μL。

1.2.5質(zhì)譜條件儀器的參數(shù)設置參照林潔鑫等[20]的質(zhì)譜條件，使用MRM模式進行QQQ掃描，碰撞氣體參數(shù)中等，去簇電壓（declusteringpotential，DP）和碰撞能（cellexitpotential，CE）優(yōu)化，完成各個MRM離子對的DP和CE[21]。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，監(jiān)測特定的MRM離子對。

1.2.6樣本質(zhì)控質(zhì)控樣本（qualitycontrol，QC）由均勻混合的茶湯和沫餑樣本的提取物制備而成，用于分析實驗樣品的重復性。在整個儀器分析的過程中，每3個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測儀器分析過程的重復性。

1.3數(shù)據(jù)處理

運用MicrosoftExcel軟件對生化成分測定所得數(shù)據(jù)進行初步計算與統(tǒng)計處理，用IBMSPSSStatistics26軟件進行單因素方差分析，利用Analyst1.6.3軟件處理儀器分析所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，基于武漢邁特維爾生物科技有限公司的自建數(shù)據(jù)庫（metwaredatabase，MWDB）進行茶湯和沫餑樣本的代謝物質(zhì)譜的定性與定量分析，用MultiaQuant軟件進行色譜峰的積分和色譜峰校正，代謝組學數(shù)據(jù)分析軟件以及版本信息如表2所示，所用軟件為R軟件。

2結(jié)果與分析

2.1團餅茶和散茶品質(zhì)相關(guān)生化成分比較

對團餅茶和散茶主要品質(zhì)相關(guān)生化成分進行測定，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，龍團鳳餅茶的含水量、水浸出物含量和游離氨基酸總量略高于散茶，但均無顯著差異。鮮葉原料均產(chǎn)自同一片茶園、采自同一時期、于同一生產(chǎn)廠加工制作而成，水浸出物含量和游離氨基酸總量無顯著差異是合理的。另外，團餅茶中茶多酚總量與咖啡堿含量顯著高于散茶，而團餅茶中茶黃素、茶紅素、茶褐素的含量顯著低于散茶。這可能是加工工藝不同造成的。散茶制作工藝為烏龍茶加工工藝，做青工序會使茶葉中的多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶等的作用下發(fā)生部分氧化，生成茶黃素、茶紅素、茶褐素等新的物質(zhì)，導致未被氧化的多酚類物質(zhì)減少。而團餅茶加工過程中，蒸青工序的高溫使茶葉中多酚氧化酶等氧化酶迅速失活，使茶多酚物質(zhì)較少發(fā)生氧化反應而被大量保留下來，最終導致團餅茶的茶多酚總量顯著高于散茶。因此，團餅茶中茶黃素、茶紅素和茶褐素等茶色素的含量顯著低于散茶。而咖啡堿在團餅茶和散茶之間的差異可能也與不同的加工工藝有關(guān)。

2.2沫餑和茶湯代謝組測定分析

2.2.1樣本質(zhì)控及統(tǒng)計分析對質(zhì)控樣本進行檢測分析，質(zhì)控樣本質(zhì)譜結(jié)果表明，儀器分析過程中儀器穩(wěn)定，實驗過程具有較好的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果可靠。

基于UPLC-MS/MS檢測，對全部樣本進行主成分分析。主成分分析得分圖（圖3）顯示，沫餑和茶湯2組樣本有明顯的分離趨勢，2組樣本間存在明顯差異。沫餑（TF）和茶湯（TL）組內(nèi)樣品聚集在一起，組內(nèi)生物學重復較好。

通過對沫餑和茶湯所有樣品進行相關(guān)性分析，觀察沫餑（TF）和茶湯（TL）組內(nèi)樣品之間的生物學重復。樣本組內(nèi)的相關(guān)性系數(shù)均大于0.95，表明試驗材料沫餑（TF）和茶湯（TL）組內(nèi)樣本相關(guān)性極強，重復性較好。測得的代謝組數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)差異代謝物分析。

2.2.2沫餑和茶湯代謝物種類及數(shù)量從沫餑（TF）和茶湯（TL）樣本各3個重復中均檢測分析出12大類1245個代謝物質(zhì)，2組樣品無特有物質(zhì)檢出。其中黃酮類物質(zhì)248個、酚酸類代謝物質(zhì)225個、脂質(zhì)163個、有機酸107個、生物堿94個、氨基酸及其衍生物91個、核苷酸及其衍生物67個、萜類物質(zhì)44個、木脂素和香豆素類40個、鞣質(zhì)30個、醌類物質(zhì)13個、其他類代謝物質(zhì)123個。進一步對檢測到的1245個代謝物質(zhì)進行歸類，即歸類為41個二級分類。代謝物種類及數(shù)量如圖4所示。

2.2.3沫餑和茶湯物質(zhì)差異分析（1）差異代謝物質(zhì)篩選?；诔咝б合嗌V質(zhì)譜串聯(lián)檢測技術(shù)，通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法，將主成分分析中不相關(guān)的差異信息進一步摒棄，然后進行差異代謝物質(zhì)的篩選。如圖5，沫餑和茶湯在第一主成分上具有明顯分離。可根據(jù)變量重要性投影值（variableimportanceintheprojection，VIP）篩選沫餑和茶湯中的差異代謝物。

根據(jù)OPLS-DA結(jié)果，依據(jù)VIP值，判定每個代謝物對樣品差異的貢獻度。初步篩選出沫餑（TF）和茶湯（TL）樣本中的差異代謝物質(zhì)，如圖6A，紅色點表示VIP≥1的代謝物，差異貢獻率高；綠色點表示VIP＜1的代謝物，差異貢獻度不顯著。同時結(jié)合差異倍數(shù)值（foldchange，F(xiàn)C）對沫餑和茶湯樣本的差異代謝物進一步篩選，篩選標準為FC≥2或FC≤0.5，如圖6B，紅色點表示茶湯vs沫餑上調(diào)的差異代謝物，綠色點表示茶湯vs沫餑下調(diào)的差異代謝物，灰色點表示差異不顯著的代謝物。本試驗主要依據(jù)FC值篩選沫餑和茶湯樣本中的差異代謝物質(zhì)。

（2）沫餑和茶湯差異代謝物質(zhì)。將所篩出的茶湯（TL）vs沫餑（TF）差異代謝物數(shù)據(jù)歸一化處理，繪制成聚類熱圖（圖7），以便觀察篩選出的差異代謝物的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，從沫餑與茶湯中共篩選出5大類26個差異代謝物，其中25個差異代謝物質(zhì)在沫餑中多于茶湯，1個差異代謝物質(zhì)在茶湯中多于沫餑。各類差異代謝物數(shù)量由多到少分別為脂質(zhì)類代謝物（16個）、萜類代謝物（6個）、其他類代謝物（2個）、黃酮類代謝物（1個，落新婦苷，在茶湯中含量高于沫餑）、酚酸類代謝物（1個）。

由圖8和表3可以看出，上調(diào)幅度排在前20的差異代謝物中，脂質(zhì)類物質(zhì)溶血磷脂酰膽堿19：0、溶血磷脂酰膽堿20：4，萜類物質(zhì)2α-羥基熊果酸，脂質(zhì)類物質(zhì)溶血磷脂酰膽堿19：2、正二十醇、13-羥基十八烷基-9，11-二烯酸*、9S-羥基-10E，12Z-十八碳二烯酸*、石榴酸、13-氧代十八碳-9，11-二烯酸*、溶血磷脂酰膽堿19：3、蓖麻油酸、2-羥基齊墩果酸在沫餑中的含量極顯著高于茶湯中含量，這些物質(zhì)可區(qū)別沫餑和茶湯的主要差異代謝物。其他類物質(zhì)2-十五烷酮，脂質(zhì)類溶血磷脂酰膽堿18：0，萜類物質(zhì)圓柚酮，脂質(zhì)類溶血磷脂酰乙醇胺18：0，酚酸類物質(zhì)甲基-4，6-二-O-沒食子酰-D-葡萄糖，脂質(zhì)類溶血磷脂酰乙醇胺17：0等在沫餑中的含量顯著高于茶湯。綜上，差異代謝物中脂質(zhì)類物質(zhì)含量大部分表現(xiàn)為在沫餑中極顯著或顯著高于茶湯；糖及醇類物質(zhì)D-葡萄糖醛酸*，脂質(zhì)類溶血磷脂酰甘油16：0等在沫餑與茶湯中的含量差異不顯著。上調(diào)幅度前10的差異代謝物中有4種LPC類代謝物質(zhì)，3種游離脂肪酸類代謝物質(zhì)，1種三萜類代謝物質(zhì)，1種糖及醇類物質(zhì)，1種其他類代謝物質(zhì)。由此可見，差異代謝物中的主要是落新婦苷在茶湯里的含量高于沫餑。落新婦苷具有強抗氧化性，可抑制脂質(zhì)類物質(zhì)氧化，間接增強沫餑持久性。而在沫餑中含量高于茶湯的差異代謝物種類較多，以脂質(zhì)類物質(zhì)為主，主要是溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)和游離脂肪酸物質(zhì)。

3討論

目前，南路水仙和龍團鳳餅是福建省建甌市主推的兩大產(chǎn)品，是北苑貢茶品牌的主要代表。為了適應現(xiàn)代茶葉市場，通常將水仙品種茶樹鮮葉制成2類產(chǎn)品，既按歷史傳承下來的傳統(tǒng)工藝制成團餅茶做為點茶茶藝的原料，又按閩北烏龍茶加工工藝制成條形散茶——南路水仙，以占領(lǐng)巖茶市場。因此，本研究中團餅茶和散茶生化成分上的差異更多地與加工工藝有關(guān)。鮮葉采自同一時期同一片茶園，于同一生產(chǎn)廠加工制作，在含水量、水浸出物含量和游離氨基酸總量上團餅茶與散茶均無顯著差異。團餅茶制作工藝為龍團鳳餅茶的初制工藝，更像是蒸青綠茶，經(jīng)過采茶、揀芽、濯芽、蒸芽、杵磨研碾、壓片去膏、烘焙成型等工序，多酚氧化酶在蒸芽過程中失去活性，使團餅茶的茶多酚大量保留。而散茶制作工藝為閩北烏龍茶的加工工藝，萎凋和做青工序伴隨著多酚類物質(zhì)氧化的過程，從而形成多酚類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素和茶褐素等。團餅茶的茶多酚總量顯著高于散茶，而團餅茶的茶黃素、茶紅素和茶褐素等含量顯著低于散茶。團餅茶的咖啡堿含量顯著高于散茶，這與SOBOLEY等[22]研究中綠茶比烏龍茶含有更多的咖啡堿的結(jié)果相似。

自唐朝起，認為沫餑是一碗茶湯中的精華，在日常品飲或閑時斗茶中經(jīng)常以沫餑的多少來評判茶的優(yōu)劣以及茶藝的高低[23]。本研究應用廣泛靶向代謝組學技術(shù)，以南路水仙茶樹品種新梢經(jīng)龍團鳳餅茶初制工藝制得的團餅茶的點茶沫餑和茶湯作為材料，通過化學計量方法分析二者代謝物質(zhì)的差異，從沫餑和茶湯樣品中篩選出5大類共26個差異代謝物，其中25個差異代謝物質(zhì)在沫餑中多于茶湯，這些差異代謝物的分子結(jié)構(gòu)多為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容易形成穩(wěn)定泡沫[24]；1個差異代謝物（落新婦苷）在茶湯中多于沫餑，落新婦苷具有強抗氧化性，可以抑制脂質(zhì)類物質(zhì)氧化，具有抗炎抗菌、免疫抑制、護肝、鎮(zhèn)痛等藥理活性[25]。各類差異代謝物及其數(shù)量分別為脂質(zhì)類16個、萜類6個、其他類2個、酚酸類1個、黃酮類1個。梁爽等[13]研究紅茶汁液態(tài)發(fā)酵時生成的泡沫組成成分時發(fā)現(xiàn)，泡沫會帶走較多的品質(zhì)成分。本研究篩選出的25個茶湯vs沫餑上調(diào)差異代謝物中，以抗腫瘤、抗炎作用的萜類物質(zhì)，降脂和表面活性劑作用的脂質(zhì)類物質(zhì)為主要成分。游離脂肪酸類物質(zhì)蓖麻油酸和正二十醇具有合成乳化劑、表面活性劑的作用[26]。甘油酯類的溶血磷脂酰甘油16：0也是主要的食品乳化劑、天然表面活性劑[27]。酚酸類物質(zhì)甲基-4，6-二-O-沒食子酰-D-葡萄糖，糖及醇類物質(zhì)D-葡萄糖醛酸*，三萜類物質(zhì)科羅索酸*、2-羥基齊墩果酸和2α-羥基熊果酸等均具有抗腫瘤、抗炎等功效，而且這些物質(zhì)所具有的一端親水基團、另一端疏水基團的結(jié)構(gòu)有利于穩(wěn)定泡沫，使茶湯表面的沫餑不易消散[28-31]。游離脂肪酸類物質(zhì)石榴酸、13-氧代十八碳-9，11-二烯酸*、13-羥基十八烷基-9，11-二烯酸*和9S-羥基-10E，12Z-十八碳二烯酸*等具有調(diào)節(jié)血脂和降脂的功能[32]。這些上調(diào)差異代謝物均有一定的健康功效，研究結(jié)果也印證了“沫悖，湯之華也”的說法，這也從科學的角度說明了古人點茶時主要品飲上層的沫餑的原因。

點茶技藝以沫餑細膩、咬盞持久、觀賞性強為佳。點茶茶湯上層的沫餑又稱為茶沫、湯花。葉寶存等[33]研究了湯花形成的影響因素，推斷茶湯中的大量表面活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、茶皂素、果膠等是形成湯花的物質(zhì)基礎，尤其是氨基酸組分中的脯氨酸和甘氨酸，具有起泡作用和很強的穩(wěn)泡作用。茶湯中一些表面活性物質(zhì)中的基團間能夠形成氫鍵，由于分子間氫鍵的作用，湯花中泡沫之間的膜壁比較牢固穩(wěn)定。茶皂素是一類五環(huán)三萜類皂苷的混合物，是一種天然良好的非離子型表面活性劑，茶皂素基本由3部分結(jié)構(gòu)組成，即皂苷元、糖苷配基和有機酸。茶皂素具有乳化、分散、發(fā)泡、濕潤等功效，并且具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)B透等藥理作用[34-37]。黃鑒舜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素的糖苷一端具有親水性，由皂苷元與另一端有機酸基團連接，這種一端親水另一端疏水的結(jié)構(gòu)，能有效降低茶湯的表面張力，使其具有良好的表面活性作用，因此，認為茶皂素是茶湯起泡的主要影響物質(zhì)。而本研究發(fā)現(xiàn)，茶湯vs沫餑中脂質(zhì)類物質(zhì)的溶血磷脂酰膽堿（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）類物質(zhì)為主要上調(diào)代謝物，這2類物質(zhì)比水輕，易存在于茶湯上層，可能是點茶沫餑主要的起泡劑和穩(wěn)泡劑。而主要下調(diào)差異代謝物落新婦苷具有強抗氧化性，可以抑制脂質(zhì)類物質(zhì)氧化，從而保護起泡和穩(wěn)泡。溶血磷脂是天然的食品添加劑和食品乳化劑[38]。LPC類物質(zhì)由磷脂水解所產(chǎn)生，具有誘導細胞性狀改變、引起溶血和改變細胞的滲透性等多種生物學效應[39-40]。LPC類物質(zhì)由甘油、磷酸、膽堿、長鏈脂肪酸組成，分子間可以形成眾多的氫鍵，因此，溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)既是良好的起泡劑，同時具有較好的泡沫穩(wěn)定性，所以溶血磷脂酸膽堿類和溶血磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)在沫餑中的含量多于茶湯，說明脂質(zhì)類物質(zhì)是龍團鳳餅茶點茶沫餑中的關(guān)鍵物質(zhì)，由此也說明宋代茶文化中斗茶時以沫餑持續(xù)時間長短來評判茶的優(yōu)劣是有科學依據(jù)的。這些脂質(zhì)類物質(zhì)在點茶過程中富集于上層沫餑中，能使泡沫穩(wěn)定持久，這與目前認為茶皂素是引起點茶沫餑的主要物質(zhì)有所不同。研究結(jié)果為進一步研究與利用點茶沫餑提供一定的理論依據(jù)。