王崇 王麗嫻 秦娜 秦云靜 袁茵 趙建宏

連續(xù)計數(shù)法血小板功能檢測(sequential platelet counting method,SPCM)是國內(nèi)于2012年研發(fā)的一種基于庫爾特原理的新型血小板聚集功能評價實驗[2],其檢測原理為:通過連續(xù)動態(tài)測量全血標(biāo)本在添加誘聚劑(Agonist)前后血小板數(shù)量及體積變化,綜合分析血小板最大聚集率(maximum aggregation rate,MAR)、平均聚集率(average aggregation rate,AAR)、最大聚集時間(maximum aggregation time,MAT)、血小板聚集曲線(platelet aggregation curve,PAC)、血小板抑制率(PLT inhibition rate,INH)、血小板平均抑制率(PLT average inhibition rate,A-INH)、紅細(xì)胞最大聚集率(RBC maximum aggregation rate,R-MAR)等參數(shù),對血小板在不同誘聚劑誘導(dǎo)下的聚集功能進(jìn)行較為全面的評價[2,3],進(jìn)而指導(dǎo)臨床選擇患者較為敏感的抗血小板藥物。本文擬對連續(xù)計數(shù)法血小板功能檢測與其他方法進(jìn)行比較,分析各自優(yōu)缺點(diǎn),并對SPCM的影響因素及質(zhì)量改進(jìn)提出建議。

1 方法學(xué)比較

1.1 SPCM與LTA LTA做為一種傳統(tǒng)的血小板聚集功能實驗,最初由Salzman于1960年提出[4],其原理為通過離心將標(biāo)本分為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)和貧血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP),用PPP將PRP的血小板計數(shù)調(diào)整至250×109個/L,在其中加入不同種類的誘聚劑,如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、膠原(Collagen,Col)、腎上腺素(Epinephrine,EPI)等,誘導(dǎo)血小板聚集,引發(fā)血漿濁度變化,通過檢測血漿透光率的動態(tài)變化,計算血小板聚集率。其優(yōu)點(diǎn)是:市場應(yīng)用廣泛,臨床認(rèn)可度高,試劑價格相對較低;檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,血漿濁度變化的檢測為不間斷連續(xù)線性測定,能準(zhǔn)確捕捉到透光率最大、濁度最低、血小板最大聚集的時間點(diǎn)。但亦有明顯的缺點(diǎn),因其檢測血漿濁度變化,一些影響血漿透光度的因素,均會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響;標(biāo)本檢測前需要離心,會誘導(dǎo)血小板活化,且分離血漿,去除紅、白細(xì)胞后,非全血環(huán)境,不能準(zhǔn)確、全面反應(yīng)血小板在體內(nèi)活化、粘附、聚集功能;因?qū)嶒炃靶枰獙?biāo)本進(jìn)行提取貧、富血小板血漿等手工操作,檢測人員操作的熟練程度對結(jié)果會有影響,不利于實驗操作全過程自動化;不同實驗室間、不同實驗操作人員對同一份標(biāo)本的檢測結(jié)果也會有差異。

SPCM與LTA相比較,具有以下優(yōu)勢:標(biāo)本不需要離心,沒有實驗前手工操作步驟,減少了手工操作誤差的干擾,容易實現(xiàn)實驗全過程自動化、批量化,提高檢測效率;不分離血漿,不去除紅、白細(xì)胞,最大程度還原血小板體內(nèi)的全血環(huán)境,真實反映血小板的活化狀態(tài);SPCM通過對加入誘聚集前、后不同時間點(diǎn)的血小板計數(shù)來計算PLT最大聚集率,輕度的溶血、黃疸、脂血、乳糜血對檢測結(jié)果無影響。不足之處是SPCM為固定時間點(diǎn)檢測,即在加誘聚劑前進(jìn)行1～2次血小板計數(shù)檢測,以此次血小板測定結(jié)果或2次測定結(jié)果的平均值為基數(shù);加誘聚劑后300 s、380 s、460 s再進(jìn)行3次血小板計數(shù),以其中血小板數(shù)量最少、聚集程度最大時間點(diǎn)的血小板計數(shù)結(jié)果計算最大聚集率。不同于LTA的不間斷的連續(xù)濁度測定,其所謂的“連續(xù)”其實是抓取5個時間“點(diǎn)”對血小板進(jìn)行測定,不能精確捕捉到血小板“最大聚集”發(fā)生的時間點(diǎn),從實驗設(shè)計原理上來講,重復(fù)性不如LTA穩(wěn)定。尤其對于服用抗血小板藥物過量導(dǎo)致的最大聚集時間延遲的患者,因血小板尚未達(dá)到最大聚集程度便在460 s結(jié)束測定,會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。

吳小利等[2]對以連續(xù)測定法為原理的江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PL-11血小板聚集儀的日間、批內(nèi)、批間的不精密度、準(zhǔn)確性、攜帶污染率及線性性能進(jìn)行了評價,結(jié)果顯示:SPCM法與LTA法有一定相關(guān)性(r=0.62,P<0.01);各項檢測結(jié)果均符合美國《臨床實驗室改進(jìn)修正法案-88》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88,CLIA’88)的要求,結(jié)論為連續(xù)測定法血小板功能檢測是一種較理想的、適用于血栓病早期預(yù)警和診斷實驗方法,值得推廣應(yīng)用,與張有濤等[5,6]的研究結(jié)果一致。

1.2 SPCM與IPA IPA又稱全血電阻抗法,最早于1980年提出[7],標(biāo)本不需要離心,全血測定,其原理為在全血樣本中加入誘聚劑,使血小板活化,粘附聚集于電極,使電阻抗增加、電流減小,通過記錄電流的變化曲線來評價血小板聚集功能[7,8]。與SPCM一樣,二者均直接使用抗凝全血,標(biāo)本不需要離心,避免手工操作干擾,能最大程度反應(yīng)血小板在全血環(huán)境下的功能狀態(tài)[9],不同于SPCM的“固定時間點(diǎn)”檢測,IPA可連續(xù)監(jiān)測因血小板聚集導(dǎo)致的電流減少、電阻抗增加,能準(zhǔn)確捕捉血小板最大聚集率發(fā)生的時間點(diǎn),重復(fù)性優(yōu)于SPCM;但I(xiàn)PA每次實驗都需要清洗電極,日常維護(hù)要求高,且易受血小板數(shù)量及紅細(xì)胞壓積(hematocrit,HCT)影響,血小板及紅細(xì)胞數(shù)量偏低的患者,IPA電流變化不明顯,實驗靈敏度偏低。IPA對微小凝集不敏感,對輕度血小板功能障礙敏感度較低,故IPA多用于實驗研究,臨床應(yīng)用較少[9]。

SPCM日常維護(hù)簡單,實驗環(huán)境要求不高,對實驗前PLT的微小凝集可通過質(zhì)控參數(shù)“原始血小板平均體積MPV-0”進(jìn)行預(yù)警,當(dāng)MPV-0≥11 fl時提示有PLT凝集或小紅細(xì)胞干擾。HCT對SPCM的影響可通過矯正公式進(jìn)行調(diào)整,當(dāng)HCT≤20%或HCT≥55%時,按矯正公式:抗凝劑(ml)=(100-HCT)×血液(ml)×0.00185對抗凝劑進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。PLT數(shù)量明顯減少時,如PLT<50×109/L,會導(dǎo)致SPCM檢測的重復(fù)性變差。

1.3 SPCM與TEG TEG是血栓彈力儀描繪出的凝血動態(tài)過程曲線,能動態(tài)分析血小板、凝血因子、纖維蛋白原等血液成分之間相互作用、血凝塊形成和纖維蛋白溶解全過程的曲線圖[11]。最早由德國人Harret于1948年提出[11],其原理為:體外模擬靜脈血流,全血或血漿復(fù)鈣后,激活凝血系統(tǒng),反應(yīng)杯中的金屬針感應(yīng)血栓形成及溶解過程中的應(yīng)切力,由計算機(jī)繪制血栓形成速度、強(qiáng)度及溶解曲線[12],以此反映凝血及纖溶過程的全貌。一般分普通杯檢測、肝素酶杯檢測和血小板功能杯檢測3種檢測方式。主要參數(shù)包括:反應(yīng)時間(R)、凝固時間(K)、兩側(cè)曲線最寬距離(MA)、血塊穩(wěn)定性(LY30)、預(yù)測纖溶指數(shù)(EPL);MA反應(yīng)血小板功能,MA≥70 mm表示血小板功能較強(qiáng),發(fā)生血栓的風(fēng)險較高;MA≤50 mm表示血小板功能較弱,出血的風(fēng)險較大[12]。但MA除反映血小板功能外,還受纖維蛋白原的影響,反應(yīng)血小板功能特異性方面不如SPCM。對于低纖維蛋白原血癥患者,不能真實反映血小板功能及活化狀態(tài),可能干擾臨床對抗血小板藥物的使用評價。另外,MA與LTA法檢測血小板聚集率的相關(guān)性方面仍存爭議[12]。

TEG的優(yōu)點(diǎn)是可床旁全血檢測,操作簡單,重復(fù)性好,除了可以通過監(jiān)測MA寬度,評價血小板功能及抗血小板藥物的治療效果外,還可全面檢測患者凝血及纖溶系統(tǒng)是否異常,綜合評估出血和血栓風(fēng)險[12]。但正因為TEG反映的是凝血、纖溶的全過程,包括纖維蛋白的形成速度、溶解狀態(tài)、血栓的堅固性及彈力度等。整個反應(yīng)過程除血小板外,還有凝血酶、凝血因子、纖維蛋白原、纖溶酶等參與血栓的形成與溶解過程,影響因素較多[13],且凝血酶形成后是血小板的強(qiáng)激活劑,因此,普通杯MA值不能反映抗血小板藥的用藥效果,只能通過血小板杯MA差值對抗血小板藥效進(jìn)行評估。黃武明[14]比較血栓彈力圖法與比濁法在冠心病患者血小板功能檢測中的應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn),二者相關(guān)性較差,檢測一致性也較弱,僅對高血脂患者兩種方法有較好的相關(guān)性。

SPCM是在全血樣本中加入誘聚劑后,通過比較加入誘聚劑前后血小板數(shù)量的變化來計算血小板最大聚集率,不受凝血因子、纖維蛋白原、凝血酶及纖溶酶等因素影響,在評價血小板功能的特異性方面優(yōu)于TEG;但血小板膜上有多種活化通路受體,SPCM僅適合對AA、ADP、Col、EPI等特定誘聚劑類藥物的治療效果進(jìn)行評價,不能代表PLT整體功能水平,尤其是長期服用抗血小板藥物的患者,因此,在綜合評估患者出血和血栓風(fēng)險方面TEG優(yōu)于SPCM。

1.4 SPCM與VASP VASP為血小板內(nèi)蛋白,在基礎(chǔ)狀態(tài)下處于非磷酸化狀態(tài),當(dāng)P2Y12受體被ADP激活后,VASP被蛋白激酶磷酸化,在對血小板膜通透化處理后,加入抗VASP磷酸化熒光抗體,采用流式細(xì)胞術(shù)對VASP進(jìn)行定量分析[15]。優(yōu)點(diǎn)是P2Y12信號通路特異性強(qiáng),實驗結(jié)果與LTA相關(guān)性較好,但不能檢測其他血小板活化通路;SPCM除可檢測ADP誘導(dǎo)的P2Y12信號通路外,還可對AA、Col、EPI活化的其他通路進(jìn)行檢測;VASP流式法操作較為復(fù)雜,費(fèi)用較高,多用于實驗研究,臨床應(yīng)用較少。

1.5 SPCM與VerifyNow VerifyNow快速血小板功能檢測儀于2006年由美國食品藥品管理局批準(zhǔn),用于血小板功能檢測,由美國Accumetrics公司生產(chǎn),其原理為:反應(yīng)杯中含有血小板激活劑(AA、ADP、凝血酶受體激活肽)及纖維蛋白原包被的微粒,加入全血后,血小板被激活劑活化,其表面的糖蛋白IIb/IIIa受體與微粒表面的纖維蛋白原結(jié)合,血小板吸附于微粒表面,使反應(yīng)杯透光率增加,根據(jù)濁度的下降來評價血小板功能。其優(yōu)點(diǎn)為全血檢測,標(biāo)本用量少,操作簡單,可床旁測定,可評價AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[16],歐美國家應(yīng)用較多。但其以凝血酶作為聚集基線,干擾了血小板其他的聚集通路,不能代表血小板的最大聚集能力。SPCM也是全血檢測,根據(jù)加入誘聚劑前后血小板計數(shù)的減少為依據(jù),來進(jìn)行血小板最大聚集率的計算,不激活凝血系統(tǒng),不受凝血酶的影響,操作也較簡單,更有利于臨床應(yīng)用。

1.6 SPCM與PFA-200 PFA-200是德國SIEMENS公司生產(chǎn)的一款血小板功能分析儀,其檢測原理為:根據(jù)血液動力學(xué)原理,在體外模擬體內(nèi)血管損傷后血小板的粘附與聚集過程,利用小孔閉合時間來反應(yīng)血小板的功能狀態(tài)[17]。具體過程為:將全血標(biāo)本吸入富含膠原纖維、腎上腺素或ADP等血小板誘聚劑的孔隙中,在剪切力的作用下,測定血栓封閉孔隙的時間,以反應(yīng)血小板的最大聚集率,多用于檢測先天性或獲得性血小板聚集、粘附功能障礙性疾病,也可用于抗血小板藥物療效監(jiān)測。其優(yōu)點(diǎn)為標(biāo)本用量少、檢測時間短、可床旁檢測,可檢測血小板的粘附功能[18];但標(biāo)準(zhǔn)化差,對血流動力學(xué)的過度依賴影響檢測的準(zhǔn)確性。

SPCM相對PAF-200更易全流程標(biāo)準(zhǔn)化,標(biāo)本采集后,直接全血上機(jī)檢測,無中間手工操作環(huán)節(jié),不受血流動力學(xué)影響,但僅能對血小板的聚集功能進(jìn)行評價,無法監(jiān)測PLT的粘附功能。

1.7 SPCM與流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)利用熒光標(biāo)記抗體可檢測單個血小板上的不同標(biāo)記物,對全血標(biāo)本中懸浮血小板快速進(jìn)行表型分析[19],相較于其他血小板功能檢測方法有如下優(yōu)點(diǎn):全血檢測、標(biāo)本用量少、可檢測PLT表面不同受體表達(dá)及對PLT反應(yīng)性進(jìn)行測試,尤其對于血小板減少癥患者,檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,明顯優(yōu)于其他血小板功能檢測方法;但溶血產(chǎn)生的RBC碎片會干擾PLT的識別,影響檢測結(jié)果[20]。SPCM同樣是全血檢測,可對不同誘聚劑下血小板功能進(jìn)行檢測,但不能對PLT表面受體進(jìn)行分析,對PLT數(shù)量較少的標(biāo)本,實驗結(jié)果的重復(fù)性差。

2 SPCM檢測影響因素分析

2.1 校準(zhǔn)品與溯源 連續(xù)計數(shù)法血小板功能分析儀生產(chǎn)廠家較少,沒有統(tǒng)一規(guī)范的校準(zhǔn)品生產(chǎn)及使用標(biāo)準(zhǔn),多為各公司專用校準(zhǔn)品,一般分低(≤100×109/L)、中[(130～240)×109/L]、高(≥330×109/L)3種不同濃度水平,無明確溯源鏈,部分生產(chǎn)廠家用美國伯樂公司的全血質(zhì)控品進(jìn)行替代;除新裝機(jī)時要求必須進(jìn)行校準(zhǔn)外,在使用過程中并未規(guī)定校準(zhǔn)周期,只有當(dāng)質(zhì)控結(jié)果發(fā)生明顯偏離時,才進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)的目的也是對儀器的檢測系統(tǒng)、電子系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)正,保證系統(tǒng)精度,而對靶值的偏差要求不高,一般在±10%左右即可接受,這可能與檢驗結(jié)果為“血小板聚集率”,報告以比值形式體現(xiàn)有關(guān),對檢測的準(zhǔn)確度要求不高,而對檢測的穩(wěn)定性要求較高。但對于血小板減少癥患者,血小板絕對數(shù)測量不準(zhǔn)會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

檢驗科血常規(guī)分析儀血小板校準(zhǔn)品多溯源到國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(international council for standardization in heamatology,ICSH),溯源鏈明確,結(jié)果可靠,重復(fù)性好。在日常工作中經(jīng)常遇到連續(xù)計數(shù)法血小板功能分析儀與血常規(guī)分析儀對同一患者的血小板測定結(jié)果不同,給臨床帶來困擾。當(dāng)二者結(jié)果不一致時,建議以血常規(guī)分析儀結(jié)果為準(zhǔn),原因如下:血常規(guī)分析儀血小板校準(zhǔn)品有明確的溯源鏈,每天進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控,按要求參加室間質(zhì)評,檢測結(jié)果有保證;連續(xù)計數(shù)法血小板功能分析儀關(guān)注的是血小板功能,檢測結(jié)果是以最大聚集率來表達(dá),對血小板計數(shù)的絕對值要求并不高。故在日常工作中遇到血小板功能分析儀與血常規(guī)分析儀對同一患者的血小板測定結(jié)果不同時,應(yīng)以血常規(guī)分析儀結(jié)果為準(zhǔn)。血小板校準(zhǔn)品的溯源性是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ),建議生產(chǎn)廠家參考血常規(guī)分析儀,使用有溯源性的校準(zhǔn)品對血小板功能分析儀進(jìn)行校準(zhǔn),減少與血常規(guī)血小板的計數(shù)誤差。

2.2 質(zhì)控品 連續(xù)計數(shù)法血小板功能分析儀質(zhì)控品多為各生產(chǎn)廠家配套質(zhì)控品,非第三方質(zhì)控,一般為經(jīng)特殊處理的動物細(xì)胞顆粒,不同廠家所生產(chǎn)的質(zhì)控品技術(shù)要求、生產(chǎn)工藝、添加物及基質(zhì)效應(yīng)不同,無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),僅供其自身檢測系統(tǒng)使用,決定了不同品牌儀器的血小板最大聚集率檢測結(jié)果只能相互參考,無法互認(rèn)。建議統(tǒng)一使用第三方質(zhì)控品,增加檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性,促進(jìn)不同品牌間檢測結(jié)果互認(rèn)。

2.3 誘聚劑效能對檢測結(jié)果的干擾 要保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確,除血小板計數(shù)穩(wěn)定外,檢測前必須對誘聚劑效能進(jìn)行驗證,即檢測健康志愿者新鮮血漿時,最大聚集率應(yīng)不低于30%,否則誘聚劑失效。但目前尚無廠家在試劑說明書中明確要求每批測定前都要進(jìn)行誘聚劑效能監(jiān)測,在日常工作中,操作人員經(jīng)常不進(jìn)行誘聚劑效能檢測就直接測定患者標(biāo)本。

誘聚劑性質(zhì)不穩(wěn)定或部分失效會導(dǎo)致檢驗結(jié)果偏低[21],最常見的是花生四烯酸復(fù)溶后效能損失,花生四烯酸在復(fù)溶后2～8℃密封存放可穩(wěn)定3 d,但常溫8～30℃僅可穩(wěn)定8 h,超出保存穩(wěn)定期,誘聚劑效能會明顯下降,影響誘聚效果,導(dǎo)致血小板最大聚集率結(jié)果偏低。建議各廠家規(guī)范說明書實驗操作流程,在檢測前對誘聚劑效能進(jìn)行驗證。

2.4 小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片的干擾 連續(xù)監(jiān)測法將MPV-0做為一個質(zhì)控指標(biāo),當(dāng)MPV-0明顯超出正常范圍,如MPV-0≥11 fL時,提示在誘聚劑加入前已經(jīng)發(fā)生血小板聚集,需重新采樣。但在使用過程中發(fā)現(xiàn)部分黃疸患者,紅細(xì)胞膜硬度增大,溶血劑不能完全溶解紅細(xì)胞,儀器對部分未充分溶解的小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片會誤計為血小板,導(dǎo)致MPV-0明顯增大,影響結(jié)果判斷。當(dāng)儀器發(fā)出MPV-0異常提示時,建議檢查患者其他血清或血漿標(biāo)本,查看是否有溶血、黃疸、脂血、乳糜血等干擾,也可查看患者血常規(guī)結(jié)果是否有小紅細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片等異常提示。

2.5 標(biāo)本放置時間 朱遠(yuǎn)等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)本不同放置時間對連續(xù)計數(shù)法血小板功能檢測結(jié)果有影響,以花生四烯酸為誘聚劑時影響較小,但以ADP 或膠原為誘聚劑時,隨著標(biāo)本放置時間的延長,血小板聚集率降低。因此,建議以花生四烯酸為誘聚劑時,血小板功能檢測應(yīng)在采血后4 h內(nèi)完成;以ADP或膠原為誘聚劑時,應(yīng)在采血后 2 h內(nèi)完成檢測。Zhu等[23]以LTA方法檢測血小板功能,建議標(biāo)本檢測時間最好控制在采血后30 min至2 h,不宜超過4 h。程衛(wèi)紅[24]用全自動血細(xì)胞分析儀對70名健康人血小板參數(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)隨著放置時間的延長,血小板的各項參數(shù)隨之升高,采集4 h后影響更加明顯。

2.6 采血不暢和標(biāo)本運(yùn)輸過程中震蕩 無論采血不暢還是標(biāo)本運(yùn)輸過程中震蕩,均可刺激血小板體外激活,導(dǎo)致血小板最大聚集率和平均聚集率測定結(jié)果偏高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義[25]。為避免采血對血小板活化的干擾,應(yīng)合理進(jìn)行采血排序,避免血小板功能檢測排采血第一管。血小板功能檢測結(jié)果是臨床上判斷抗血小板藥物療效的重要指標(biāo),故在標(biāo)本采集及運(yùn)輸過程中應(yīng)保證采集順暢,避免劇烈的震蕩,以免影響臨床對抗血小板藥物療效的評估。

3 小結(jié)與展望

急性血栓性疾病是臨床多發(fā)病,具有突發(fā)性強(qiáng)、致殘率高、致死率高等特點(diǎn)[26]。當(dāng)血管破裂或內(nèi)皮損傷時,內(nèi)皮下膠原蛋白、組織因子、血管性血友病因子(von Willebrand disease factor,vWF)暴露,在激活內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)的同時,也激活靜息狀態(tài)下的血小板,活化的血小板通過vWF粘附到受損的血管內(nèi)皮,實現(xiàn)一期止血?；罨“灞砻尕S富的磷脂提供了催化凝血瀑布級聯(lián)反應(yīng)的場所,導(dǎo)致大量凝血酶生成,水解纖維蛋白原為纖維蛋白,實現(xiàn)二期止血。活化血小板還可釋放血栓烷(TXA2)、二磷酸腺苷(ADP)及炎性因子[27],通過第二信使刺激更多血小板吸附、聚集,促進(jìn)凝血酶的生成,放大凝血作用,形成血栓[28]。因此,臨床及時的抗血小板藥物干預(yù),對抑制及預(yù)防血栓形成有重要意義。

臨床上通常用抗血小板藥物來降低血小板反應(yīng)性,阻止血栓形成,減少和預(yù)防心、腦血管卒中事件的發(fā)生;根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)不同,臨床常用抗血小板藥物分為:環(huán)氧酶抑制劑,代表藥物為阿司匹林、吲哚布芬;二磷酸腺苷受體拮抗藥,代表藥物為氯吡格雷、替格瑞洛;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑,代表藥物為替羅非班[29]?？寡“逅幋嬖趥€體差異,即血小板反應(yīng)多樣性[30],根據(jù)患者服用抗血小板藥物后的反應(yīng),分為血小板高反應(yīng)性(high platelet reactivity,HPR)和血小板低反應(yīng)性(low platelet reactivity,LPR),HPR指患者對該抗血小板藥物不敏感,或用藥量不夠,血小板活性抑制不足,發(fā)生血栓風(fēng)險較高;LPR指患者對該抗血小板藥物敏感,或用藥過量,血小板活性過度抑制,出血風(fēng)險較高[31]。臨床醫(yī)生必須根據(jù)血小板功能檢測結(jié)果進(jìn)行用藥調(diào)整,以減少多種強(qiáng)效抗血小板藥物聯(lián)合使用導(dǎo)致的出血不良事件[32]。2011年美國心臟病學(xué)會基金會(American College of Cardiology Foundation,ACCF)及美國心臟學(xué)會(American Heart Association,AHA)提出對不穩(wěn)定型心絞痛(Unstable angina,UA)及非ST段抬高心肌梗死(Non-st-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)患者在服用抗血小板藥物治療時要進(jìn)行血小板功能檢測的建議[33]。

目前,臨床實驗室血小板功能檢測方法主要包括光電比濁法(light transmittance aggregometry,LTA)、電阻抗法(impedance platelet aggregometry,IPA)、血栓彈力圖法(thromboelastography,TEG)、血管舒張劑刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)測定法、VerifyNow測定法、PAF-200小孔閉合時間測定法、流式細(xì)胞術(shù)測定法等,以LTA法應(yīng)用最為廣泛,被認(rèn)為是血小板功能檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[34]。其他實驗方法的檢驗結(jié)果也多與LTA進(jìn)行比較,但因原理及操作程序不同,不同方法學(xué)測定結(jié)果之間缺乏可比性[35]。如王曦[36]研究了各種方法之間的相關(guān)性,LTA 與血栓彈力圖的相關(guān)系數(shù)為 0.6(P<0.05),LTA 與Verify-Now 的相關(guān)系數(shù)為0.693,血栓彈力圖與 Verify-Now的相關(guān)系數(shù)為 0.564(P<0.05),實驗結(jié)果之間雖有相關(guān)性,但相關(guān)系數(shù)均不高。各種血小板功能檢測方法總體臨床預(yù)測價值不高,各方法的ROC曲線下面積為0.5～0.63,敏感度及特異性均<65%,且不能預(yù)測患者出血風(fēng)險[37]。

綜上所述,盡管血小板功能檢測有多種方法,但因?qū)嶒炘O(shè)計原理不同,各有優(yōu)缺點(diǎn)。LTA應(yīng)用最廣,因排除了RBC干擾,通過動態(tài)監(jiān)測血漿濁度的變化反映PLT聚集功能,實驗結(jié)果重復(fù)性好,但影響血漿透光率的因素,如溶血、脂血、黃疸、乳糜血會干擾檢測結(jié)果,且離心會誘導(dǎo)PLT活化,在非全血環(huán)境下,不能準(zhǔn)確、全面反映PLT在體內(nèi)活化、粘附、聚集、釋放功能;因操作熟練程度的不同,手工提取貧、富血小板血漿也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。IPA具有操作簡單、全血檢測、無需離心、標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn),能最大程度反應(yīng)血小板在全血環(huán)境下的功能狀態(tài),但電極日常維護(hù)要求高,易受PLT數(shù)量及HCT影響,對輕度血小板功能障礙敏感度較低,多用于科研,臨床應(yīng)用較少。TEG通過對凝血纖溶過程曲線分析,可動態(tài)反映血栓形成及溶解整個過程,PLT只是參與因子之一,對PLT功能的評價受其他因素,如纖維蛋白原、凝血因子等的影響[38]。VASP對PLT膜表面P2Y12信號通路特異性強(qiáng)[39],但不能檢測其他PLT活化通路,不能全面、完整反映PLT功能,多用于實驗研究。VerifyNow快速血小板功能檢測儀操作簡單,標(biāo)本用量少,可評價AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[40],但其實驗原理以凝血酶作為聚集基線,檢測結(jié)果受纖維蛋白原及凝血酶影響較大。PAF-200利用小孔閉合時間來反應(yīng)PLT的功能狀態(tài),標(biāo)本用量少、檢測快速、可同時檢測血小板粘附功能,但受血流動力學(xué)的影響較大,重復(fù)性差。流式細(xì)胞術(shù)利用熒光標(biāo)記抗體對PLT進(jìn)行表型分析,干擾因素少,特異性好,特別適用于血小板減少癥患者,但溶血產(chǎn)生的RBC碎片干擾實驗結(jié)果。因此,為臨床提供一種檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,能真實反映體內(nèi)血小板活化狀態(tài)的實驗方法,尤為重要。

連續(xù)計數(shù)法血小板功能檢測是近年來開展的一項評價血小板聚集功能的新技術(shù),操作簡單,易于自動化,與傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”光電比濁法有較好的相關(guān)性。楊雅薇等[41]的研究顯示,SPCM、Verify-Now、血栓彈力圖、VASP檢測的血小板抑制率結(jié)果有一定的相關(guān)性,但SPCM在實驗設(shè)計及質(zhì)量控制方面還需改進(jìn)與完善,比如可以通過增加“固定時間點(diǎn)”檢測次數(shù)提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性;在明確校準(zhǔn)品溯源路徑、在說明書或SOP文件中規(guī)范誘聚集效能評價標(biāo)準(zhǔn)、合理應(yīng)用第三方質(zhì)控品進(jìn)行日常室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測、減小與血常規(guī)分析儀PLT計數(shù)誤差、增強(qiáng)不同實驗室間結(jié)果互認(rèn)等方面,需要進(jìn)一步規(guī)范與完善。除以上影響因素外,血小板聚集功能檢測還受血小板自身不穩(wěn)定的影響,標(biāo)本采血是否順暢、震蕩、存放時間及溫度、臨床用藥等均可導(dǎo)致血小板功能變化,對異常結(jié)果的判讀一定要結(jié)合臨床,與臨床醫(yī)生、采血護(hù)士充分溝通,了解臨床用藥、排除采血干擾后才能正確審核。