陳利軍 張?zhí)烀?第伍丹琲 劉蓓莉 王虹

據(jù)報(bào)道,肺癌的發(fā)病率和死亡率非常高[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見(jiàn)的病理類型,約占肺癌的85%～90%[2]。肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)是非小細(xì)胞肺癌中第二大病理亞型,約占非小細(xì)胞肺癌的20%～30%[3]。晚期LUSC患者的5年生存率不到5%,因此早期診斷和預(yù)后的有效及特異性生物標(biāo)志物對(duì)LUSC的臨床治療非常重要[4]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度約為21～25個(gè)核苷酸[5]。miRNA主要通過(guò)與mRNA的3’UTR結(jié)合直接降解mRNA或抑制其蛋白翻譯負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)[6]。miRNA可參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控,如增殖、凋亡、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)等。研究表明,miRNA的異常表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。因此,本研究旨在利用生物信息學(xué)方法探究關(guān)鍵miRNAs在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中的功能及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 miRNA芯片數(shù)據(jù)來(lái)源 芯片數(shù)據(jù)通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得,篩選到GSE17681數(shù)據(jù)集進(jìn)行后續(xù)分析,該數(shù)據(jù)集包含36個(gè)樣本,其中肺癌樣本17例,對(duì)照樣本19例,芯片平臺(tái)是GPL9040 (febit Homo Sapiens miRBase 13.0),種屬為Homo sapiens。

1.2 差異miRNA篩選 利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geO2r/acc=GSE17681)在線分析工具對(duì)GSE17681數(shù)據(jù)集中肺癌樣本和對(duì)照樣本的miRNA表達(dá)進(jìn)行差異分析,利用SangerBox軟件繪制火山圖,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去重等處理后,按照|logFC|>2,P<0.05的條件篩選出差異miRNAs。

1.3 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè) 利用miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)[8]數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)排在前3位的上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 靶基因GO和KEGG富集分析 利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行富集分析,包括基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用STRING(https://string-db.org/)[10]數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶基因間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)及miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò),以TSV格式導(dǎo)出結(jié)果,然后導(dǎo)入Cytoscape(版本3.6.0)進(jìn)行交互分析,利用插件cytoHubba分析(MCC算法)關(guān)鍵miRNA及其調(diào)控的Hub靶基因。

1.6 關(guān)鍵miRNA及其調(diào)控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達(dá)分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)[11]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵miRNA及其調(diào)控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.7 關(guān)鍵miRNA在肺鱗癌中的表達(dá)情況與預(yù)后分析 利用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background)[12]工具對(duì)差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNA對(duì)肺鱗癌生存狀況的影響進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)(下四分位數(shù),上四分位數(shù))表示,2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線法分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA篩選及靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)對(duì)GSE17681數(shù)據(jù)集分析,共篩選出116個(gè)差異表達(dá)的miRNA,其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有93個(gè),表達(dá)下調(diào)的miRNA有23個(gè)。根據(jù)logFC值,排在前3位的上調(diào)miRNA分別是hsa-miR-19a、hsa-miR-210、hsa-miR-339-5p,預(yù)測(cè)的靶基因共1 040個(gè);排在前3位的下調(diào)miRNA分別是hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-126、hsa-miR-1283,預(yù)測(cè)的靶基因共285個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 差異表達(dá)miRNA火山圖;紅色為上調(diào)的miRNA,綠色為下調(diào)的miRNA

2.2 靶基因GO和KEGG富集分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)miRNA靶基因的生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程、細(xì)胞增殖等;細(xì)胞組分(cellular component,CC)主要涉及核、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞器等;分子功能(molecular function,MF)主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)miRNA靶基因主要涉及癌癥途徑、HTLV-I感染、MAPK信號(hào)通路、胞吞作用、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。見(jiàn)表1、2。

表1 差異表達(dá)miRNA靶基因GO功能富集分析結(jié)果

表2 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG通路富集分析結(jié)果

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分別構(gòu)建了前3位上調(diào)和下調(diào)miRNA靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。然后利用Cytoscape軟件的cytoHubba插件篩選到上調(diào)miRNA前10位Hub靶基因?yàn)門P53、AKT1、MYC、PTEN、MAPK1、CCND1、ESR1、TNF、MDM2、ACTB,下調(diào)miRNA前10位Hub靶基因?yàn)镸YC、VEGFA、MAPK8、FGF2、SOD2、PKM、TFRC、SOCS3、FOXO3、HNRNPDL。再利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò),篩選到調(diào)控Hub靶基因最多的上調(diào)關(guān)鍵miRNA為hsa-miR-19a、下調(diào)關(guān)鍵miRNA為hsa-miR-126。hsa-miR-19a、hsa-miR-126調(diào)控的Hub靶基因分別為TNF、PTEN、MAPK1、ESR1、CCND1、AKT1、ACTB、TP53、VEGFA和TFRC、SOCS3、MYC、MAPK8、HNRNPDL、FOXO3。見(jiàn)圖2。

圖2 靶基因PPI圖及miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖;A miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖,紅色圓點(diǎn)為上調(diào)miRNA,藍(lán)色圓點(diǎn)為下調(diào)miRNA,黃色圓點(diǎn)為靶基因;B 上調(diào)miRNA前10位Hub靶基因PPI圖,圓點(diǎn)顏色越深基因排序越前;C 下調(diào)miRNA前10位Hub靶基因PPI圖,圓點(diǎn)顏色越深基因排序越前

2.4 關(guān)鍵miRNA調(diào)控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達(dá)分析結(jié)果 將hsa-miR-19a、hsa-miR-126 兩個(gè)關(guān)鍵miRNA調(diào)控的Hub靶基因在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)肺鱗癌中的表達(dá)進(jìn)行分析。與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a調(diào)控的Hub靶基因PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB表達(dá)降低,TP53、VEGFA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肺鱗癌組hsa-miR-126調(diào)控的Hub靶基因SOCS3、FOXO3表達(dá)降低,TFRC、MYC、MAPK8表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 關(guān)鍵miRNA調(diào)控的Hub靶基因在肺鱗癌中的表達(dá) M(P25,P75)

2.5 關(guān)鍵miRNA在肺鱗癌中的表達(dá)情況與預(yù)后分析結(jié)果 將hsa-miR-19a、hsa-miR-126 兩個(gè)關(guān)鍵miRNA在UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)肺鱗癌中的表達(dá)進(jìn)行分析。與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a表達(dá)升高,hsa-miR-126表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier Plotter分析結(jié)果示,肺鱗癌中hsa-miR-19a高表達(dá)組總體生存期高于低表達(dá)組,hsa-miR-126高表達(dá)組總體生存期低于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表4。

表4 關(guān)鍵miRNA在肺鱗癌中的表達(dá)情況 M(P25,P75)

圖3 關(guān)鍵miRNA生存分析;A hsa-miR-19a高表達(dá)在肺鱗癌中的生存曲線;B hsa-miR-126高表達(dá)在肺鱗癌中的生存曲線

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理類型,早期不易診斷,一經(jīng)確診疾病已進(jìn)入晚期,多數(shù)患者已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)而采取化療,但是化療耐藥等使得患者治療效果往往不佳,患者的5年生存率較低[13,14]。因此尋找生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)對(duì)肺癌患者的早期診斷、治療及預(yù)后有重要意義。研究表明,miRNA是一組內(nèi)源性非編碼小RNA,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。

本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE17681數(shù)據(jù)集中肺癌樣本和正常樣本進(jìn)行分析,篩選出116個(gè)差異表達(dá)的miRNA,然后對(duì)排在前3位的上調(diào)和下調(diào)miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。GO和KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶基因的生物學(xué)過(guò)程主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程、細(xì)胞增殖等,靶基因主要富集在MAPK信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及miRNA-基因交互網(wǎng)絡(luò),分別篩選出上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的前10位Hub靶基因,并得到調(diào)控這些Hub靶基因最多的關(guān)鍵上調(diào)和下調(diào)miRNA分別是hsa-miR-19a和hsa-miR-126。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)肺鱗癌中的驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組比較,肺鱗癌組hsa-miR-19a表達(dá)升高,hsa-miR-126表達(dá)降低。研究表明,miR-19a是miR-19家族研究最多的致癌miRNA,其主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡及抑癌磷酸酶和張力蛋白同源物發(fā)揮致癌活性,也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致化療失敗[16]。hsa-miR-126是一類腫瘤抑制因子,能抑制腫瘤的增殖、遷移及血管發(fā)生[17]。Jiao等[18]研究發(fā)現(xiàn),hsa-miR-126在非小細(xì)胞肺癌中顯著下調(diào),其下調(diào)與hsa-miR-126基因上游啟動(dòng)子 CpG 島超甲基化有關(guān)。

肺鱗癌組hsa-miR-19a調(diào)控的Hub靶基因PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB表達(dá)降低,TP53、VEGFA表達(dá)升高;肺鱗癌組hsa-miR-126調(diào)控的Hub靶基因SOCS3、FOXO3表達(dá)降低,TFRC、MYC、MAPK8表達(dá)升高。這些結(jié)果表明hsa-miR-19a、hsa-miR-126在肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能通過(guò)靶向調(diào)控上述基因發(fā)揮作用。此外,hsa-miR-19a高表達(dá)及hsa-miR-126低表達(dá)均與肺腺癌較長(zhǎng)的總體生存率有關(guān)。研究表明,miRNA-19a過(guò)表達(dá)與肺癌的病理生理有關(guān)[19],并且與肺癌細(xì)胞的預(yù)后、轉(zhuǎn)移及增殖有關(guān)。Pan等[20]研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-19a-3p的上調(diào)顯著抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并通過(guò)下調(diào)UBAP2L的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-126-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控CCR1基因來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Sun等[22]報(bào)道m(xù)iR-126高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的較高總體生存率呈正相關(guān)。

綜上所述,本研究證實(shí)了hsa-miR-19a、hsa-miR-126在肺鱗癌組織中表達(dá)異常,是肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵miRNAs,可能通過(guò)靶向調(diào)控PTEN、MAPK1、ESR1、ACTB、TP53、VEGFA、SOCS3、FOXO3、TFRC、MYC、MAPK8等Hub基因發(fā)揮作用,并與肺鱗癌的總體整存率有關(guān)。因此,hsa-miR-19a、hsa-miR-126可能作為肺鱗癌早期診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。