柴曉婧 蔡甜甜 鄒龍

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,其死亡率約占各類惡性腫瘤死亡率的23%以上[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的肺癌類型,約占肺癌發(fā)病率80%,極大威脅到人類的生命健康[2]。近年來放化療、手術治療及靶向治療在非小細胞肺癌方面取得一定進步,改善了患者預后。但術后復發(fā)、轉移、減毒增效及克服耐藥等仍是影響患者預后的難題,因此尋找新的腫瘤標志物早期預測肺癌,制定針對性治療方案,對改善患者預后具有重要意義。研究證實,肺癌的發(fā)生發(fā)展與信號通路傳導及基因表達異常相關[3]。亮氨酸拉鏈EFhand結構域跨膜蛋白1(leucine zipper/leucine zipper/EF-hand-containing transmembrane protein 1,LETMI1)是一種線粒體蛋白,參與了線粒體代謝反應的調節(jié)。有報道稱LETMI1通過抑制線粒體生成誘導Hela細胞凋亡,促進多種類型的腫瘤進展[4]。研究發(fā)現(xiàn)通過免疫組化法對多種惡性腫瘤患者腫瘤組織進行染色處理,發(fā)現(xiàn)LETMI1在胃癌、卵巢癌、食管癌組織中的呈高表達量,但是在非小細胞肺癌中仍不清楚[5]。因此,本研究比較非小細胞肺癌組織LETMI1表達與患者一般資料以及生存預后的關系,旨在為非小細胞肺癌的診療評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2021年6月接受肺葉切除術的102例非小細胞肺癌患者作為研究對象。納入標準:(1)患者均為初次入院確診,術前未接受放化療治療;(2)經(jīng)病理學確診為非小細胞肺癌;(3)癌旁組織切緣未發(fā)生腫瘤組織浸潤;(4)圍手術期間未發(fā)生其他嚴重并發(fā)癥;(5)患者或家屬簽署知情同意書。排除標準:(1)臨床資料不完整或中斷隨訪者;(2)合并其他惡性腫瘤;(3)自身免疫功能缺陷、先天性心臟病或營養(yǎng)嚴重不良者;(4)其他組織的急慢性炎癥患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核并批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集:將納入本次研究的102例非小細胞肺癌患者術中同時切取癌組織和癌旁組織,癌組織距腫瘤切緣<1 cm,癌旁組織距腫瘤切緣≥2 cm。樣本組織取出后立即液態(tài)氮中冷凍,置于-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測組織LETM1蛋白表達:采用鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶法,取適量樣本組織,中性甲醛固定,石蠟包埋并制成切片。組織切片二甲苯脫蠟,梯度洗脫,將檸檬酸鈉粉末置入2 L的PBS溶液中制成抗原修復液,加熱抗原修復,在加入3%H2O2孵育10 min。滴加兔抗LETM1(美國Abnova公司,1∶100),37℃孵育3 h或4℃冰箱中過夜。次日PBS緩沖液震蕩沖洗3次,滴加通用型IgG抗體50～100 μg(武漢博士德生物工程公司)37℃孵育30 min;滴加50～100 μg DAB顯色試劑(上海Gene Tech公司)溶液顯色,復染、透明、封片。

1.2.3 結果判定:由兩名病理科醫(yī)生雙盲閱片評估,采用半定量積分法進行結果判定。染色強度:無染色,陰性;淡黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。染色面積:無陽性細胞,0分;0～25%,1分;26%～50%,2分;>50%,3分;將染色強度積分×陽性細胞百分比作為最終積分。參考相關報道[6],LETM1<2分為低表達,LETM1≥2分為高表達。

1.2.4 臨床資料收集:患者均行肺葉切除術,術后按照《中國臨床腫瘤學會肺癌診療指南》[7]進行輔助放化療。完成術后治療后,患者定期門診復查。收集患者復查結果,以死亡或失訪作為研究隨訪終點。隨訪時間為確診時間,終點日期為患者死亡日期或截止日期,本研究隨訪時間2022年6月。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果分析 LETM1蛋白表達主要定位于細胞核,陽性染色呈棕色顆粒;LETM1蛋白在癌組織中呈高表達,在癌旁組織絕大多數(shù)呈陰性表達或極低表達,非小細胞肺癌組織LETM1蛋白陽性表達率為57.9%(59/102),癌旁組織為10.8%(11/102),2者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=50.108,P<0.001)。見圖1。

癌旁組織

2.2 組織LETM1蛋白表達與非小細胞肺癌臨床病理資料的關系 LETM1蛋白低表達組43例和高表達組59例,2組在分化程度、TNM分期、淋巴結轉移的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其余臨床指標2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 組織LETM1蛋白表達與非小細胞肺癌臨床病理資料的關系 例(%)

2.3 LETM1蛋白表達與非小細胞肺癌生存預后的關系 隨訪截止至2022年6月,LETM1蛋白高表達59例,術后總體生存期為(26.74±3.78)月;LETM1蛋白低表達43例,術后總體生存期為(43.76±5.46)個月;差異有統(tǒng)計學意義(Log rank=17.627,P<0.05)。見圖2。

圖2 LETM1蛋白表達與非小細胞肺癌生存預后的關系

2.4 非小細胞肺癌患者預后Cox單因素分析 單因素分析顯示,分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、LETM1蛋白是影響患者生存期的主要因素(P<0.05)。見表2。

表2 非小細胞肺癌患者預后生存期Cox單因素分析

2.5 影響非小細胞肺癌患者預后Cox多因素分析 進一步Cox多因素分析顯示,TNM分期、LETM1蛋白表達是影響非小細胞肺癌預后生存期的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 非小細胞肺癌患者預后生存期Cox多因素回歸分析

3 討論

近年來,肺癌發(fā)病率和死亡率逐年上升趨勢,受到遠處轉移、局部侵襲及耐藥等因素影響,其5年死亡率高居不下。迄今為止,筆者發(fā)現(xiàn)肺癌的發(fā)病機制至今尚未完全明確,但腫瘤的發(fā)生和進展是一個多基因、多信號通路的復雜病理生理過程。LETM1是一種高度保守的線粒體內(nèi)膜蛋白,其表達異?？蓪е戮€粒體功能紊亂,并誘導腫瘤的發(fā)生和進展。LETM1可誘導正常細胞的壞死,與細胞內(nèi)調節(jié)能量的亞細胞線粒體的量減少相關。研究發(fā)現(xiàn)LETM1蛋白在宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌在組織中呈高表達[8]。國內(nèi)學者在胃癌、結腸癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)LETM1作為重要原癌基因促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。LETM1蛋白高表達可誘導線粒體穩(wěn)態(tài)功能障礙,致使整齊糖酵解,增加乳酸分泌,改變線粒體形態(tài),影響疾病生理進程。周寶勇等[10]研究還發(fā)現(xiàn)上調或敲低LETM1表達導致HeLa細胞線粒體Ca2+活性增大或降低,提示LETM1與線粒體Ca2+釋放緊密相關。已有研究證實LETM1作為一種線粒體內(nèi)膜蛋白,在維持正常呼吸代謝功能發(fā)揮重要作用[11]。

本研究首次檢測102例非小細胞肺癌患者癌組織和癌旁組織LETM1表達,其染色結果顯示,LETM1表達定位于細胞核中,但非小細胞肺癌組織陽性表達率為57.9%,癌旁組織為42.1%; 并且LETM1高表達與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關,提示高表達LETM1促使非小細胞肺癌浸潤和轉移能力增強。目前對LETM1在腫瘤中的應用尚處于初級階段,有學者研究發(fā)現(xiàn)LETM1高表達可能通過減少單磷酸腺苷激酶活性和ATP的生成而影響腫瘤進程[12]。此外,線粒體靶向基因LETM1的高表達在H-ras12V肝癌動物模型中具有抗腫瘤作用[13],提示LETM1可作為基因治療的潛力,為靶向治療提供了一條新的思路。

一項關于三陰性乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn),LETM1蛋白高表達的10年生存期均顯著低于低表達患者[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細胞癌患者LETM1蛋白表達與總生存期和無病生存期相關,LETM1蛋白高表達有助于頭頸部鱗狀細胞癌的早期預測[15]。為進一步證實LETM1蛋白在非小細胞肺癌病情進展中的作用,本研究分析了LETM1蛋白表達與非小細胞肺癌患者生存預后的關系,結果顯示,LETM1蛋白表達是影響非小細胞肺癌生存預后的獨立危險因素,LETM1蛋白高表達的非小細胞肺癌患者生存期顯著縮短,提示LETM1蛋白的表達可作為非小細胞肺癌生存預后的指標之一。

綜上所述,LETM1在非小細胞肺癌組織表達顯著上調,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,有作為評估非小細胞肺癌生存預后新型生物標志物的潛在價值。但是本研究樣本量偏少,且僅為單中心研究,LETM1表達與非小細胞肺癌患者的關系仍需要大樣本證實。