吳崢 郭盛虎 李文 張躍華 潘騰 汪治宇

食管癌(ESCA)是對(duì)我國(guó)居民生命健康存在危害性的一大惡性腫瘤?；谑澜缧l(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)可知,我國(guó)2020年的ESCA新發(fā)患者是32.4萬(wàn)人,死亡患者是30.1萬(wàn)人,近1/2的ESCA發(fā)病與死亡病例出現(xiàn)于我國(guó),新發(fā)率與病死率相較美國(guó)不止10倍,我省更是ESCA高發(fā)區(qū)域之一[1]。在我國(guó),以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)病理分型最為常見(jiàn),病理組織活檢為其主要診斷標(biāo)準(zhǔn)。ESCC患者早期通常無(wú)明顯表現(xiàn),主要采取手術(shù)切除療法,并將放療、化療與多學(xué)科聯(lián)合療法等作為輔助,但晚期ESCC患者進(jìn)展極為迅速,5年生存率只有20%～30%[2]。所以,深入了解本病的發(fā)病機(jī)制,挖掘具有高度特異性與敏感性的腫瘤標(biāo)志物(TM)顯得非常關(guān)鍵,對(duì)臨床領(lǐng)域早期診斷有利,同時(shí)可指導(dǎo)治療以及作為治療靶點(diǎn)改善預(yù)后。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FOX)家族的首次發(fā)現(xiàn)是在果蠅內(nèi),現(xiàn)今已劃分出19個(gè)亞家族,由FOXA至FOXS,這些亞家族在結(jié)構(gòu)方面的最大表現(xiàn)為存在由100多個(gè)保守氨基酸(AA)序列構(gòu)成的DNA結(jié)合域。諸多報(bào)道顯示,FOX家族對(duì)多種生物學(xué)功能具介導(dǎo)作用,包括細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù),還和腫瘤形成進(jìn)行等若干復(fù)雜進(jìn)程相關(guān)[3]。FOXD1、FOXD3均屬于FOXD亞族蛋白,FOXD1在早期胚胎發(fā)育和器官發(fā)生中具有公認(rèn)的作用,并且其表達(dá)紊亂,與不同類(lèi)型癌癥的生物學(xué)行為相關(guān)。類(lèi)似地,FOXD3最早在胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),維持胚胎干細(xì)胞的多能性,調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴的形成、分化和遷移。研究表明,FOXD3在細(xì)胞癌變過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用,其異常表達(dá)可調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等生物學(xué)功能[4]。本研究擬分析FOXD1、FOXD3在食管鱗癌患者中的表達(dá)情況,并探究?jī)烧吲c患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2013年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院收治的符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)接受手術(shù)治療的食管鱗癌患者105例作為研究對(duì)象。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①初次就診,無(wú)外院診治史;②入組前未行放化療及免疫治療者;③經(jīng)病理檢查明確診斷為食管鱗癌;④無(wú)食管狹窄和反流性食管炎等食管良性疾病;⑤患者和(或)其家屬對(duì)本研究知情同意并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①合并胃腸炎和腸結(jié)核等急性感染性疾病患者;②伴心肺功能衰竭患者;③伴免疫缺陷性疾病和精神障礙等患者。組織標(biāo)本的切取和使用經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者已簽署知情同意書(shū)。

1.3 總RNA提取以及qRT-PCR檢測(cè)組織中FOXD1和FOXD3 mRNA表達(dá) 將食管鱗癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣>2 cm)研碎后加入Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司),應(yīng)用Trizol法提取組織中RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)FOXD1、FOXD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,反應(yīng)體系共10 μl,引物由上海捷瑞有限公司設(shè)計(jì),FOXD1上游引物序列為5’-TGAGCACTGAGATGTCCGATG-3’,下游引物序列為5’-CACCACGTCGATGTCTGTTTC-3’;FOXD3上游引物序列為5’CGCTGCCCAATCCTGGACTCTG-3’,下游引物序列為5’CCCATCCCCACGGTACTAAGAGC-3’。反應(yīng)條件為50℃/2 min,95℃/3 min,95℃/30 s,60℃/1 min,共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)部參照,采用2-ΔΔCT法計(jì)算FOXD1、FOXD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FOXD1與FOXD3蛋白表達(dá)情況

1.4.1 免疫組化實(shí)驗(yàn)主要試劑:手工染色檢測(cè)食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1、FOXD3蛋白表達(dá)。依次實(shí)施石蠟切片處理、脫蠟水化處理、抗原修復(fù)、加入阻斷PO(內(nèi)源性過(guò)氧化物酶)阻斷劑、室溫下一抗FOXD1與FOXD3(1∶100)反應(yīng)1 h、復(fù)溫、室溫下二抗山羊抗兔IgG反應(yīng)20 min,接著DAB顯色、蘇木素(Hematoxylin)復(fù)染、脫水封片與顯微鏡觀察。FOXD1的一抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology,FOXD3的一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.4.2 染色結(jié)果評(píng)估:根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率對(duì)切片進(jìn)行評(píng)分分級(jí):①染色強(qiáng)度:未著色、淺著色、中等著色、強(qiáng)著色對(duì)應(yīng)的分值依次為0分、1分、2分、3分;②陽(yáng)性細(xì)胞占比:0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%對(duì)應(yīng)的分值依次是1分、2分、3分、4分;③雙方乘積:0～1分、2～4分、5～8分、9～12分依次對(duì)應(yīng)陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性,除了陰性,另3類(lèi)皆屬于陽(yáng)性[5]。

1.5 觀察指標(biāo) 比較食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并分析食管鱗癌組織FOXD1和FOXD3表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征關(guān)系,以及影響食管鱗癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA表達(dá)水平 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.085±0.432和 0.412±0.117,FOXD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.397±0.120和1.143±0.335。在食管鱗癌組織中FOXD1相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織,FOXD3相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平;A FOXD1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平;B FOXD3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平;與癌旁組織同一指標(biāo)比較,*P<0.05

2.2 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3蛋白表達(dá)水平 食管鱗癌組織FOXD1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織,而食管鱗癌組織FOXD3陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2,表1。

表1 食管鱗癌組織和癌旁正常組織2組FOXD1、FOXD3表達(dá)情況 n=105,例(%)

圖2 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3蛋白表達(dá);A FOXD1免疫組化染色圖;B FOXD3免疫組化染色圖

2.3 食管鱗癌組織中FOXD1、FOXD3表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系 食管鱗癌組織中FOXD1表達(dá)水平與患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.512,P=0.019)、腫瘤浸潤(rùn)深度(χ2=4.317,P=0.038)和腫瘤TNM分期(χ2=6.998,P=0.008)相關(guān),與患者年齡、性別及病理分化程度均無(wú)關(guān)(P=0.712、0.820)。FOXD3表達(dá)水平與患者性別(χ2=4.162,P=0.041)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=7.581,P=0.006)、腫瘤浸潤(rùn)深度(χ2=5.318,P=0.021)和腫瘤TNM分期(χ2=5.709,P=0.017)相關(guān),與患者年齡及病理分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2、3。

表2 FOXD1在ESCC組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表3 FOXD3在ESCC組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 影響食管鱗癌患者預(yù)后生存的多因素分析 將所有可能影響病人預(yù)后的因素帶入COX回歸模型,結(jié)果顯示腫瘤TNM分期為Ⅲ/Ⅳ的ESCC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是腫瘤TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期患者的2.884倍(95% CI:1.846～4.508,P<0.05);淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的ESCC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的2.103倍(95% CI:1.091～4.159,P<0.05);FOXD3高表達(dá)的ESCC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是FOXD3低表達(dá)者的0.514倍(95% CI:0.314～0.843,P<0.05);FOXD1高表達(dá)的ESCC患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是FOXD1低表達(dá)者的3.585倍(95% CI:1.843～5.841,P<0.05)。綜合以上結(jié)果,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXD1表達(dá)陽(yáng)性及FOXD3表達(dá)陰性均是影響食管鱗癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討論

ESCA發(fā)病隱匿,具強(qiáng)侵襲性,較易病死,為一大消化道惡性腫瘤,臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性吞咽障礙、癌痛與乏力等,如果未及時(shí)診治,一定會(huì)對(duì)病人的身心健康與生命安全產(chǎn)生影響[6]。研究發(fā)現(xiàn),分子標(biāo)志物在食管癌患者的診斷,治療以及預(yù)后評(píng)估中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。

FOXD1也稱(chēng)為BF2和FREAC-4,是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,本質(zhì)為蛋白質(zhì)。在染色體水平上,FOXD1是一種常染色體單外顯子基因,位于人類(lèi)的5q12-q13。FOXD1含有鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶(GC)富集區(qū)域,這些DNA區(qū)域容易形成發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)和遭受聚合酶滑移,從而妨礙編碼區(qū)的克隆和測(cè)序。FOXD1首次在前腦神經(jīng)上皮內(nèi)被識(shí)別和描述,它被認(rèn)為是視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要因素[7]。目前,FOXD1已被確認(rèn)為癌癥相關(guān)基因,它的異常表達(dá)在宮頸癌、腎透明細(xì)胞肉瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和結(jié)直腸癌中被觀察到,并參與了許多生物學(xué)過(guò)程[8-15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn),FOXD1通過(guò)上調(diào)口腔鱗狀細(xì)胞癌中的lncRNA CYTOR來(lái)促進(jìn)EMT和藥物的耐藥性;還有研究表明,FOXD1通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展,并預(yù)示著FOXD1可能為一種潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[17]。FOXD3同樣作為FOX家族的成員之一,也是目前研究較為廣泛,具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子之一。FOXD3位于人類(lèi)染色體1p31.3上,FOXD3以共有序列5'A[AT]T[AG]TTTGTTT-3'與DNA結(jié)合。FOXD3作用于腫瘤的機(jī)制是多樣的,Xie等[18]發(fā)現(xiàn)FOXD3會(huì)抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲,PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)FOXD3抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有重要影響。其他研究表明FOXD3在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展中同樣起著潛在的腫瘤抑制作用[19]。FOXD3可抑制多種癌細(xì)胞的遷移和侵襲,本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FOXD3作為抑癌基因可通過(guò)抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲在食管癌發(fā)生與進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示,食管鱗癌組織中FOXD1 mRNA及蛋白表達(dá)量高于癌旁組織,而FOXD3 mRNA及蛋白表達(dá)量低于癌旁組織。同時(shí)發(fā)現(xiàn),上述分子表達(dá)在不同浸潤(rùn)深度、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中存在顯著差異,表明FOXD1和FOXD3表達(dá)可能與食管鱗癌惡性生物學(xué)行為有關(guān)。進(jìn)一步建立多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析可知,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、以及FOXD1與FOXD3的表達(dá)是影響ESCC患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,推測(cè)其主要通過(guò)影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞敏感性[20],進(jìn)而影響患者預(yù)后。由此可見(jiàn)FOXD1、FOXD3表達(dá)的高低與食管鱗癌患者預(yù)后有著密切的聯(lián)系。

綜上,FOXD1、FOXD3的異常表達(dá)是食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,二者有望成為臨床評(píng)估食管鱗癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。