劉俊蓉,周琛婓,王曉鵬,劉 珂,唐 麗,蘇曉云,崔建梅

長期以來,缺血性心臟病一直是世界范圍內高發(fā)病率和高死亡率的主要病因。在過去的幾十年里,由于及時的再灌注醫(yī)療策略,如,經皮冠狀動脈介入和冠狀動脈搭橋等手段的干預,使得死亡率明顯下降[1]。然而,再灌注往往會加重缺血心肌的結構和功能損傷,產生心律失常、收縮功能障礙和心肌細胞死亡等一系列負面后果和影響,最終導致心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,而心肌I/R損傷又是急性心肌梗死臨床治療后的嚴重并發(fā)癥之一[2],會給家庭和社會帶來日益沉重的經濟負擔。因此,制定預防心肌I/R損傷的策略日益受到醫(yī)生和保健專業(yè)人員的重視。

根據以往的研究結果,心肌I/R后由線粒體產生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)導致的線粒體結構改變和功能障礙被認為是I/R誘導心肌損傷的關鍵驅動因素[3]。線粒體是一種動態(tài)的細胞器,是心肌細胞的主要能量來源,通過不斷的融合和分裂改變其形態(tài),形成新的線粒體,并有效去除受損或功能失調的線粒體。因此,線粒體分裂和融合的動態(tài)平衡對于維持線粒體的正常結構和功能至關重要[4]。大量研究表明,I/R會破壞線粒體融合和分裂的平衡狀態(tài),導致線粒體形態(tài)學的改變,進而引起線粒體功能障礙和心肌細胞凋亡[5]。動態(tài)相關蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)是一種細胞質蛋白,Drp1在介導裂變中起核心作用,通過與裂變蛋白1等的結合來啟動分裂,導致線粒體分裂和功能障礙,并與線粒體過度裂變導致的線粒體動態(tài)過程損傷與心肌細胞凋亡相關[6]。除線粒體裂變外,線粒體融合在心臟I/R損傷中也起著關鍵作用。視神經萎縮蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)位于線粒體膜內,主要調節(jié)線粒體內膜的融合,OPA1的破壞會導致線粒體分裂、碎裂,甚至細胞死亡[7]。最近,Zhang等[8]報道的Drp1的失活和Mfn2的激活有助于改善線粒體功能障礙,延緩I/R的發(fā)生。Xue等[9]的研究發(fā)現,心臟線粒體功能障礙已被證實有助于線粒體ROS的產生,抑制線粒體分裂,增加融合可減少I/R化損傷并改善心臟功能。上述研究證實,OPA1、Drp1介導的心肌ROS增加可能在I/R誘導的心臟功能障礙方面起到重要作用。

眾所周知,運動是一種非藥物干預手段,以運動為基礎的心臟康復可持續(xù)改善心梗患者的生活質量,減少住院和心源性死亡,并改善與健康相關的生活質量[10]。動物實驗證實,運動預干預可以通過調控副交感神經活性來削弱I/R大鼠心肌氧化應激水平,保護線粒體的呼吸功能,降低心肌梗死的面積[11]。Marques-Aleixo等[12]的研究也發(fā)現,體育鍛煉可以調節(jié)與線粒體融合和分裂相關的基因和蛋白的含量。Jiang等[13]的研究發(fā)現,8周有氧間歇運動預干預可以通過調節(jié)線粒體動力學信號傳導相關蛋白Drp1的表達來改善線粒體的網絡重構,認為此運動可以通過調節(jié)線粒體動力學和功能對大鼠心肌I/R損傷起到保護作用。此外,Zhang等[14]的研究發(fā)現,運動訓練可以通過增加線粒體融合相關蛋白(OPA1)來降低腦缺血大鼠心肌梗死的面積?；谏鲜鲅芯靠芍?運動訓練可以對線粒體動力學產生有利影響,可以推測運動預干預可能通過保護線粒體的功能或維持其動態(tài)平衡來減輕I/R大鼠的心肌損傷。因此,本研究通過觀察8周有氧運動預干預對I/R大鼠心肌纖維結構、心臟功能及心肌氧化應激水平和Drp1及OPA1表達的影響,探討運動預干預對I/R大鼠心肌保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.2 試劑及儀器

SOD(超氧化物歧化酶)及MDA(丙二醛)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供;Drp1及OPA1抗體購自美國ABclonal公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;ALC-V8型動物呼吸機購自上海奧爾特生物科技有限公司;光學顯微鏡購自日本 Olympus 公司;JD-801型形態(tài)學圖像分析軟件購自江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 運動方案

1.3.2 心肌I/R模型建立

1.3.3 左心室功能測定

用BL-420S生物機能實驗系統監(jiān)測大鼠的心功能,分別記錄左冠狀動脈前降支結扎前(T0)、結扎后30 min(T1)及再灌注120 min(T2)心功能指標。指標包括:左室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP,mmHg)、左室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure,LVDEP,mmHg)、左室內壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.3.4 心肌組織SOD活性及MDA水平的測定

1.3.5 HE染色

1.3.6 Western blot法檢測心肌組織Drp1及OPA1蛋白表達

1.4 數據處理與分析

采用 SPSS19.0 統計軟件進行數據處理,數據結果用平均數±標準差(mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析(One Way Anova),以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 實驗結果與分析

2.1 跑臺運動預干預對I/R大鼠左心室功能的影響

如表1所示,各組大鼠的心臟功能指標在心肌缺血前無明顯差異性(P>0.05)。與sham組比較,I/R組在心肌缺血30 min與再灌期120 min后,左室收縮壓(P<0.01)及左室內壓最大上升速率(P<0.01)和下降速率(P<0.01)均顯著降低,左室舒張末期壓力(P<0.01)顯著增加;I/R+EX組除大鼠再灌期(120 min)左室舒張末期壓力與sham組比較無顯著差異外(P>0.05),大鼠心肌缺血30 min及再灌期120 min后的左室收縮壓(30min:P<0.01;120 min:P<0.05)及左室內壓最大上升速率(P<0.01)和下降速率(30 min:P<0.01;120 min:P<0.05)均顯著降低,心肌缺血30 min的左室舒張末期壓力(P<0.01)顯著增加。與I/R組比較,I/R+EX組左室收縮壓(P<0.05)及左室內壓最大上升速率(P<0.01)和下降速率(30 min:P<0.01;120 min:P<0.05)均顯著增加,左室舒張末期壓力(P<0.05)顯著下降。而sham組與EX組比較,除EX組左室收縮壓(再灌期120 min)顯著增加外,兩組之間缺血前、心肌缺血30 min與再灌期120 min后的心臟功能指標均無顯著差異(P>0.05)。表明,運動預干預可在一定程度上改善I/R引起的心臟舒縮功能障礙,進而改善心臟功能。

表1 各組大鼠心臟功能結果表

2.2 跑臺運動預干預對 I/R 大鼠心肌組織病理變化的影響

由圖2可見,sham組與EX組心肌纖維呈線狀排列,染色均勻,細胞形態(tài)正常,結構及核膜完整,且區(qū)分明顯;I/R組心肌纖維排列紊亂且有斷裂,心肌細胞水腫明顯,部分心肌細胞呈現核固縮;I/R+EX組心肌病理性變化程度(心肌細胞水腫及炎性細胞浸潤程度)均較I/R組減輕,心肌纖維排列稍整齊,心肌受損的程度也進一步下降,心肌損傷程度介于sham組和I/R組之間。

圖2 各組大鼠左心室心肌組織HE染色結果圖(×100)Figure 2 HE staining results of myocardial tissue of left ventricle in each group rats(×100)

2.3 跑臺運動預干預對I/R大鼠心肌組織SOD活性及MDA水平的影響

如圖3所示,與sham組比較,I/R組和I/R+EX組心肌組織SOD活性(I/R:P<0.01,I/R+EX:P<0.05)均顯著下降,MDA水平(I/R:P<0.01,I/R+EX:P<0.05)均顯著增加;與I/R組比較,I/R+EX組心肌組織SOD活性(P<0.05)顯著增加,MDA水平(P<0.01)顯著下降;而EX組與sham組比較,心肌組織SOD活性(P<0.05)顯著增加,MDA水平在兩組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 各組大鼠心肌組織SOD活性及MDA水平結果圖Figure 3 Results of SOD activity and MDA level in myocardial tissue in each group rats注:##P<0.01,#P<0.05,與sham組比較;**P<0.01,*P<0.05,I/R+EX組與I/R組比較。

2.4 跑臺運動預干預對I/R大鼠心肌組織Drp1及OPA1蛋白表達的影響

圖4 各組大鼠心肌組織 Drp1及OPA1相對蛋白表達條帶圖Figure 4 Bands of relative protein expression of Drp1 and OPA1 in myocardial tissue of rats in each group注:##P<0.01,#P<0.05,與sham組比較;**P<0.01,*P<0.05,I/R+EX組與I/R組比較。

3 討 論

3.1 跑臺運動預干預對I/R大鼠心肌組織及心臟功能的影響

3.2 跑臺運動預干預對I/R大鼠心肌組織氧化應激的影響

氧化應激是指自由基產生而導致的體內氧化和抗氧化作用的失衡狀態(tài),對細胞代謝產生多種負面影響?；钚匝跎稍黾踊蚩寡趸烙鶞p少導致的氧化應激與心血管疾病的病理生理學有關[26]。線粒體是細胞產生ROS 的重要場所,正常情況下,由于抗氧化酶的抑制作用,ROS處于較低水平,而在I/R期間,由于鈣超載等導致氧自由基的迅速堆積,內源性抗氧化系統被破壞,自由基不能被清除,被認為是I/R導致心肌組織損害的重要原因之一[27]。有研究表明,心肌缺血可降低心肌抗氧化酶SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,并且大量的ROS可誘導脂質過氧化反應,在不飽和脂肪酸的作用下產生過量的MDA,最終通過多種途徑造成心肌細胞結構破壞,引發(fā)I/R心肌損傷[28]。Yin等[29]通過臨床研究發(fā)現,急性心梗合并心律失常與患者血清SOD活性下降、MDA含量增加有關。并且動物實驗證實,I/R后心臟舒縮功能下降與I/R降低了心肌抗氧化酶SOD、GSH-Px活性及CAT水平有關,認為心肌I/R對大鼠心臟功能的影響可能是通過氧化應激途徑介導的[30]。本研究結果顯示,心肌I/R減弱了大鼠心肌組織抗氧化的防御機制,具體表現為I/R大鼠心肌組織SOD活性下降,MDA水平增加,以上心肌組織抗氧化能力下降或許與I/R大鼠心臟功能下降有關。有研究表明,規(guī)律性體育鍛煉被認為是預防和治療心血管疾病和I/R損傷的重要干預方式[31]。近來的研究發(fā)現,運動預干預可以使機體對活性氧損傷產生良好的適應能力,通過氧氣的有效供給和能量的有效利用,減少因氧化系統過度負荷和組織相對缺血缺氧所導致的自由基生成[32]。路富林等[33]的研究發(fā)現,6周中等強度跑臺運動預干預對I/R心肌損傷具有保護作用,這種保護作用可能與此運動增加心肌線粒體SOD活性、降低MDA含量從而降低心肌氧化應激損傷有關。本研究對I/R大鼠進行8周跑臺運動預干預,發(fā)現運動預干預使I/R大鼠的心肌抗氧化活性酶SOD活性有一定恢復,使MDA水平下降。本研究還發(fā)現,運動預干預使I/R大鼠心肌受損的程度下降、心臟功能改善,因此,可以認為運動預干預可能通過增強心肌組織抗氧化能力改善I/R大鼠心肌受損程度和心臟功能。

3.3 跑臺運動預干預對I/R大鼠心肌組織Drp1及OPA1表達的影響

大量研究表明,心肌I/R的重要標志之一是線粒體結構和功能的改變。線粒體在能量產生中起關鍵作用,其融合、分裂的動態(tài)平衡是保證心肌細胞正常能量代謝及心肌收縮力的重要決定因素,而I/R會破壞這種平衡,使線粒體分裂增加,并呈現片段化,有可能導致心肌梗死的發(fā)生,這與I/R誘導的心功能障礙有關[34],而抑制線粒體分裂相關蛋白的表達(如Drp1)已被證明在心肌缺血/再灌注期間發(fā)揮心臟保護作用,表現為減少心肌梗死面積和改善左心室功能障礙[35]。Ding等[36]的研究表明,在糖尿病條件下,Drp1介導的線粒體分裂在I/R線粒體功能下降及心臟功能障礙方面起重要作用。Sharp等[37]的研究發(fā)現,心臟驟停后,Drp1抑制劑可以改善自主血液循環(huán)發(fā)生的時間和心肌血流動力學,進而改善心臟驟停模型小鼠的生存和神經預后。有研究認為,線粒體融合在I/R中起著關鍵作用,促進線粒體融合可能在I/R期間提供心臟保護[38]。Khuanjing等[39]的研究發(fā)現,在心肌缺血和再灌注開始時,可以通過增加線粒體融合蛋白OPA1減輕線粒體功能障礙和動態(tài)失衡,從而減少梗死面積,改善心功能,發(fā)揮心臟保護作用。本研究結果顯示,與sham組比較,I/R組大鼠心肌組織Drp1蛋白表達上調,OPA1蛋白表達下降,說明I/R后線粒體分裂增加,融合減少,從而導致I/R心肌損傷的形成。近年來,線粒體動態(tài)平衡被認為是治療多種疾病,特別是治療I/R損傷的有效靶點[40]。在I/R心肌損傷后,線粒體動力學平衡失調,而抑制過度的線粒體碎裂或增強線粒體融合可預防急性心臟缺血/再灌注損傷[41]。有研究認為,對于運動訓練誘導的抗I/R損傷的心臟保護方面,有不同的細胞機制被提出,而線粒體在結構和功能上的適應性訓練似乎在心臟保護中起著核心作用[42]。Zhao等[43]的研究表明,8周游泳運動預干預(15 min/d,5次/周)可以通過調節(jié)線粒體裂變、融合信號改善線粒體形態(tài),抑制心肌梗死小鼠心肌纖維化和細胞凋亡,從而恢復心肌梗死后線粒體形態(tài)并改善心臟功能。另一項研究發(fā)現,高強度間歇訓練預干預8周后,I/R大鼠心肌梗死面積減少,心肌組織融合蛋白表達增多、分裂蛋白Drp1表達減少,提示運動誘導的線粒體融合和分裂的調節(jié)可導致心肌線粒體動力學的改善,似乎參與了運動對I/R損傷的保護[44]。本研究結果表明,與I/R組大鼠比較,經過8周跑臺運動預干預,I/R+EX大鼠心肌組織Drp1蛋白表達顯著減少,OPA1蛋白表達顯著增多。而Zhang等[14]研究發(fā)現,運動預干預(2周低強度跑臺)對心肌線粒體Drp1蛋白表達無明顯影響,但可明顯提高OPA1蛋白表達。因此,針對不同研究得到的不同結果可能與不同研究選取的運動干預強度及時間不同有關。有研究認為,線粒體分裂增加、融合不足可以顯著增加心肌梗死面積,這與I/R敏感性的增加有關[45]。因此,本實驗中跑臺運動預干預改善I/R大鼠心臟功能可能與此運動下調心肌分裂蛋白Drp1、上調融合蛋白OPA1表達有關。有研究表明,線粒體是ROS的主要來源和靶點,I/R引起線粒體融合/分裂的動態(tài)平衡改變,致使線粒體出現過度分裂,ROS生成增加,是刺激氧化應激反應的上游信號通路,而過多的ROS會加重線粒體分裂[19]。并且Ding 等[36]的研究發(fā)現,Drp1抑制劑可通過增強糖尿病I/R小鼠心臟MnSOD的活性,降低MDA的形成,提示抑制Drp1可有效降低I/R誘導的氧化應激。此外,Zhang等[8]的研究發(fā)現,抗心衰藥物可以部分通過平衡心力衰竭小鼠的線粒體功能抑制線粒體ROS的生成,從而改善冠狀動脈結扎誘導的心臟收縮功能及心臟結構損傷。因此可以推測,8周跑臺運動預干預能夠增強I/R大鼠心臟功能及削弱心肌組織損傷,可能與此運動維持線粒體動態(tài)平衡從而降低I/R誘導的心肌氧化應激有關,但是線粒體融合及分裂蛋白通過何種途徑影響心肌氧化應激,還需要進一步研究證實。

4 結 論

8周中等強度跑臺運動預干預可以通過維持線粒體分裂與融合的動態(tài)平衡,減輕I/R誘導的心肌氧化應激損傷,進而改善I/R大鼠左心室舒縮功能障礙及心肌組織損傷。維持線粒體分裂與融合的動態(tài)平衡應該是預防心肌缺血/再灌注損傷的一種潛在策略。