張建銀,鄔容光,王強(qiáng)強(qiáng),張淑紅,馬金秀,王 艷,耑 冰,陳 乾,董 輝

近年來,法舒地爾作為Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)抑制劑在減輕急性心肌梗死(AMI)后心肌炎癥、延緩心衰進(jìn)展等方面均有較好應(yīng)用。多項(xiàng)研究[1-3]表明,ROCK信號(hào)通路廣泛參與心肌細(xì)胞收縮、遷移、增殖、凋亡及AMI后心室重構(gòu)等病理生理過程。在AMI小鼠模型[4]中發(fā)現(xiàn),ROCK信號(hào)通路通過上調(diào)促炎因子參與心肌梗死后左心室重構(gòu),而100 mg/kg劑量的法舒地爾口服可抑制AMI后左心室重構(gòu);將法舒地爾應(yīng)用于急性腦梗死患者,患者血清炎性標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白也被發(fā)現(xiàn)明顯降低[5]。目前公認(rèn)ROCK信號(hào)通路具有“分子開關(guān)”作用,即心肌損傷后該通路激活,將細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)從而調(diào)控相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。法舒地爾抑制AMI后心室重構(gòu)及炎性標(biāo)志物的減少,可能就是因?yàn)榉ㄊ娴貭栕钄郣OCK這一“分子開關(guān)”的作用。目前,法舒地爾降低血清中炎性標(biāo)志物多見報(bào)道,而未見對(duì)法舒地爾通過ROCK途徑降低AMI大鼠心肌組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)水平的報(bào)道。本研究利用已經(jīng)建立的AMI大鼠模型,觀察法舒地爾能否通過抑制ROCK途徑降低AMI大鼠心肌組織中TNF-α的水平,希望進(jìn)一步增加法舒地爾心肌保護(hù)的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:鹽酸法舒地爾(HF)注射液(川威,規(guī)格為每支2 mL/30 mg)、Trizol試劑、全蛋白提取試劑盒、蛋白含量檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、兔抗鼠ROCK2一抗、兔抗鼠TNF-α一抗、β-actin一抗、羊抗兔(二抗)。

1.2 主要儀器設(shè)備:4 ℃低溫離心機(jī)、PCR儀(BIO-RAD MyCycler)、凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)、熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)、酶標(biāo)儀(Bio-TekELx800)、濕電轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD);多功能小動(dòng)物呼吸機(jī)(SAR-1000,Ventilator)、大小鼠生命體征監(jiān)護(hù)儀(STARR公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購得健康成年雄性SD大鼠48只,其體重范圍為300～350 g[SCXK(鄂)20160009]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組:使用隨機(jī)數(shù)字表法分配大鼠,48只成年SD大鼠被隨機(jī)分配到以下8組中,每組分配大鼠6只。8組分別為健康對(duì)照組、假手術(shù)組(sham組)、心肌梗死6 h組(AMI 6 h)、心肌梗死24 h組(AMI 24 h)、心肌梗死48 h組(AMI 48 h)、心肌梗死6 h+法舒地爾組(AMI 6 h+HF)、心肌梗死24 h+法舒地爾組(AMI 24 h+HF)及心肌梗死48 h+法舒地爾組(AMI 48 h+HF)。

1.5 AMI大鼠模型建立及給藥方式:制備AMI大鼠模型[6],腹腔注射濃度為3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉,每只大鼠按45 mg/kg的注射劑量給藥。大鼠麻醉后將其固定于鼠臺(tái)并常規(guī)記錄大鼠心電圖;氣管插管成功后連接動(dòng)物呼吸機(jī),設(shè)置潮氣量為3 mL/100 g,設(shè)置呼吸頻率為55次/min。

1.5.1 AMI大鼠模型的建立:大鼠左胸備皮,備皮范圍約3 cm×3 cm,碘伏消毒并于左3、4肋間胸骨旁開口,逐層剖開皮膚層、皮下組織層及肌肉層,斷開第三肋后暴露心臟,剪開心包,6-0號(hào)眼科無創(chuàng)縫合線,在左心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐間距主動(dòng)脈根部2～3 mm處穿過前降支,并連同一小束心肌一同結(jié)扎。大鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎成功的標(biāo)志為冠狀動(dòng)脈前降支供血區(qū)域顏色變暗、變白,肉眼可觀察到供血區(qū)域心肌組織運(yùn)動(dòng)減弱,心電監(jiān)護(hù)提示對(duì)應(yīng)區(qū)域ST段上抬超過0.2 mV,提示結(jié)扎成功。結(jié)扎成功后須進(jìn)一步觀察大鼠心臟,主要觀察有無活動(dòng)出血及室性心律失常發(fā)生。如發(fā)生室性心律失常(如室速或室顫等)須尾靜脈注射2%利多卡因終止室性心律失常。在確認(rèn)無上述情況發(fā)生后可逐層縫合胸腔,并持續(xù)心電監(jiān)護(hù),待大鼠自主呼吸恢復(fù)后,拔除氣管插管,復(fù)蘇成功后大鼠須單只、分籠飼養(yǎng);成功手術(shù)后為每只大鼠腹腔注射青霉素20萬單位,防止術(shù)后感染。

1.5.2 給藥方式:AMI模型建立成功后,AMI+HF組大鼠立即給予HF溶液尾靜脈首次注射。HF溶液的濃度為30 mg/100 mL。大鼠尾靜脈注射HF溶液的劑量為4 mg/kg,首次注射完成以后開始計(jì)時(shí),以后每6 h尾靜脈注射1次[7]。根據(jù)大鼠體重,每次給予大鼠尾靜脈注射的溶液量范圍為4.0～4.6 mL。對(duì)于sham組大鼠,將大鼠開胸,在其冠狀動(dòng)脈相同部位,穿線但不結(jié)扎,余處理措施同AMI組,該組大鼠每6 h尾靜脈注射1次生理鹽水4 mL。對(duì)于對(duì)照組大鼠,每6 h尾靜脈注射1次生理鹽水4 mL,無其他處理措施。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)大鼠心肌組織ROCK2 mRNA表達(dá):在各組大鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后6 h、24 h和48 h后,無痛處死大鼠并獲取大鼠心臟,用冰鹽水清洗心臟,清除殘留血液,剪除大鼠心臟上殘留大血管,吸干水分,在大鼠心臟的乳頭肌平面,將心臟一分為二,獲取近心尖非梗死區(qū)心臟組織(梗死區(qū)心肌組織變薄,彈性及韌性減弱或消失,梗死區(qū)蒼白且與非梗死區(qū)有顯著差異),使用電子天平稱量待測(cè)心肌組織,取0.1 g的待測(cè)心肌組織,于冰上切碎后將其加入研缽,向其中加入液氮,將心肌組織研磨破碎,充分勻漿,然后加入Trizol 1 mL,收集破碎組織勻漿,使用Trizol試劑,提取勻漿中的總RNA。后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用特異性擴(kuò)增ROCK2引物(F為ATGTCCGACCTGTTACTC;R為GTFFCATCTACTGCACTCTA;235 bp),以β-actin(F為CCCATCTATGAGGGTTACGC;R為TTTAATGTCACGCACGATTTC;150 bp)作為內(nèi)參進(jìn)行Real-time PCR(PCR擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃、3 min;95 ℃、20 s,57 ℃、20 s,72 ℃、 20 s, 40個(gè)循環(huán);65 ℃、5 s)檢測(cè)所得數(shù)據(jù),最后計(jì)算2-ΔΔCT值,用其代表ROCK2 mRNA表達(dá)水平。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)檢測(cè)心肌組織中ROCK2及TNF-α蛋白的表達(dá):獲取心肌組織勻漿后,用全蛋白提取試劑盒提取心肌組織勻漿中全蛋白,BCA定量,取樣,經(jīng)上樣(上樣量40 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加兔抗鼠ROCK2一抗(一抗稀釋度1∶3 000,4 ℃)搖晃12 h,PBST轉(zhuǎn)膜15 min,3次,滴加生物素標(biāo)記二抗,4 ℃搖晃3 h,PBST洗膜后行ECL發(fā)光,膠片曝光,凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析,測(cè)定各組ROCK2蛋白、TNF-α蛋白條帶光密度值及β-actin條帶光密度值。然后計(jì)算目的蛋白表達(dá)的相對(duì)值。目的蛋白表達(dá)的相對(duì)值=目的蛋白條帶光密度值/β-actin條帶光密度值。

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾對(duì)AMI大鼠心肌組織中ROCK2 mRNA表達(dá)的影響:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組大鼠心肌組織中ROCK2 mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.18,P<0.05)。Sham組大鼠心肌組中ROCK2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h和48 h的時(shí)間點(diǎn),AMI 組和AMI+HF組大鼠心肌組織中的ROCK2 mRNA水平與AMI比降低,均高于sham組(P<0.05)。在冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h、48 h,AMI+HF組大鼠心肌組織中ROCK2 mRNA水平均低于AMI組大鼠對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平(P<0.05),見表1。

表1 法舒地爾對(duì)AMI大鼠心肌組織中ROCK2 mRNA與蛋白表達(dá)的影響

2.2 法舒地爾對(duì)AMI大鼠心肌組織中ROCK2蛋白表達(dá)的影響:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織中ROCK2蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.57,P<0.05),其中兩兩比較提示,sham組大鼠心肌組織中ROCK2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h和48 h的時(shí)間點(diǎn),AMI 組、AMI+HF組大鼠心肌組織中ROCK2蛋白含量均降低,明顯高于sham組大鼠(P<0.05);在冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h、48 h,AMI+HF組大鼠心肌組織中ROCK2蛋白表達(dá)低于AMI組大鼠對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平(P<0.05),數(shù)據(jù)結(jié)果見表1、WB結(jié)果見圖1(目次后)。

2.3 法舒地爾對(duì)AMI大鼠心肌組織中TNF-α表達(dá)的影響:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,各組大鼠心肌組織中TNF-α水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.78,P<0.05),其中兩兩比較提示,sham組大鼠心肌組織中TNF-α表達(dá)與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h和48 h的時(shí)間點(diǎn),AMI 組、AMI+HF組大鼠心肌組織中TNF-α水平高于sham組大鼠(P<0.05);在冠脈結(jié)扎術(shù)后6 h、24 h、48 h的時(shí)間點(diǎn),AMI+HF組大鼠心肌組織中TNF-α水平低于AMI組大鼠對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平(P<0.05),數(shù)據(jù)結(jié)果見表2、WB結(jié)果見圖2(目次后)。

表2 法舒地爾對(duì)AMI大鼠心肌組織TNF-α表達(dá)的影響

3 討論

目前,患者發(fā)生AMI后行冠脈介入治療存在明確的治療時(shí)間窗,選擇不同的介入治療時(shí)間窗,會(huì)直接影響介入治療效果[8]。以ST段抬高性心肌梗死患者為例,AMI癥狀發(fā)生的12 h內(nèi)均應(yīng)首選經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療,這已成為業(yè)界共識(shí)[9]。之所以有這樣的共識(shí),原因在于梗死的心肌組織隨時(shí)間推移發(fā)生一系列病理生理改變,而我們先前的研究也發(fā)現(xiàn)[6,10],心肌梗死后的6～24 h將有大量活性氧及炎性介質(zhì)爆發(fā)性增長(zhǎng),這些均是造成心肌損傷的關(guān)鍵原因。

法舒地爾作為目前唯一應(yīng)用于臨床的ROCK蛋白抑制劑,在改善缺血-再灌注損傷、提高心肌能量供應(yīng)、減少心肌梗死面積等方面已有良好的應(yīng)用。目前已發(fā)現(xiàn)ROCK蛋白有兩種亞型(ROCK1和ROCK2),這兩種亞型存在明顯的組織分布特異性:ROCK1主要表達(dá)于腎臟、睪丸、肺臟、肝等組織中,ROCK2則主要表達(dá)于腦組織和心肌組織中[11]。這種組織分布特異性,不僅解釋了法舒地爾可應(yīng)用于其他缺血性疾病(如法舒地爾降低急性腦梗死患者血清炎性標(biāo)志物[5])的治療,也為本研究觀察AMI后法舒地爾對(duì)心肌組織中ROCK2蛋白的影響提供研究思路。

本研究發(fā)現(xiàn),大鼠AMI后,其心肌組織內(nèi)ROCK2 mRNA的表達(dá)即出現(xiàn)明顯增加,而法舒地爾可以減少ROCK2 mRNA的表達(dá)。以上與Hattori等人[12]的結(jié)果類似,Hattori等人對(duì)心肌梗死小鼠使用法舒地爾(劑量為100 mg/kg),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠心肌組織內(nèi)ROCK2 mRNA表達(dá)減少。同時(shí),小鼠心肌梗死面積減少。本研究結(jié)果提示法舒地爾至少可能通過降低ROCK2 mRNA的表達(dá)水平而發(fā)揮減少ROCK2蛋白的作用,從而進(jìn)一步達(dá)到保護(hù)心肌的效果。大鼠AMI后心肌組織中ROCK2蛋白表達(dá)明顯增加,而法舒地爾可明顯降低ROCK2蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果也印證了Guo等人[13]在研究姜黃素對(duì)心肌缺血-再灌注損傷中的結(jié)果,即當(dāng)心肌缺血30 min后灌流3 h,蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)顯示心肌組織中ROCK1和ROCK2蛋白均明顯升高; Satoh等人[14]研究結(jié)果表明,ROCK2與心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控密切相關(guān),AMI后ROCK2蛋白的增加可能對(duì)于AMI后心室重構(gòu)發(fā)揮重要作用,而法舒地爾可以明顯減少ROCK2蛋白的表達(dá),提示法舒地爾亦可能在改善AMI后心室重構(gòu)方面發(fā)揮作用。

另外,TNF-α是公認(rèn)的炎性損傷因子。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中,選用非梗死區(qū)域的心肌組織作為研究對(duì)象,也是為了減少梗死區(qū)域內(nèi)大量炎性物質(zhì)(包括TNF-α)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的潛在影響。本研究發(fā)現(xiàn):對(duì)AMI大鼠使用ROCK蛋白抑制劑法舒地爾,大鼠AMI后非梗死區(qū)域心肌組織中TNF-α含量亦會(huì)隨之明顯降低;而Kajikawa等人[15]使用蛋白質(zhì)免疫印跡對(duì)AMI患者外周白細(xì)胞ROCK蛋白檢測(cè),發(fā)現(xiàn)ROCK蛋白在AMI發(fā)病2 h 開始升高,AMI 1 d 后達(dá)峰,心肌梗死7 d 后仍高于對(duì)照組,故其提出ROCK蛋白可以作為預(yù)測(cè)心血管事件的生物標(biāo)志物;本研究中法舒地爾抑制ROCK2蛋白后,同時(shí)伴隨著TNF-α水平的下降,提示ROCK2蛋白信號(hào)途徑很可能參與了AMI后TNF-α水平的調(diào)控,這也從側(cè)面再次印證了ROCK蛋白“分子開關(guān)”的關(guān)鍵作用。

綜上所述,ROCK2蛋白抑制劑法舒地爾可能通過抑制AMI大鼠心肌組織中ROCK2 mRNA的表達(dá)水平來減少ROCK2蛋白的表達(dá),并可能通過ROCK2蛋白的分子開關(guān)作用來降低心肌組織中炎性介質(zhì)TNF-α水平,從而發(fā)揮“抑制心室重塑”而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。雖然如此,法舒地爾的心肌保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。