朱 磊,曾 亮,李 芳

在職業(yè)病的眾多危害因素中,高溫作為十分常見(jiàn)的一種,已被很多文獻(xiàn)報(bào)道,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的描述,長(zhǎng)期處于高溫的環(huán)境下,人的認(rèn)知能力及記憶力受到影響,而表現(xiàn)出不同程度的下降[1]。已知在大腦的邊緣系統(tǒng)中,有與認(rèn)知功能有著密切關(guān)系的海馬,其作為邊緣系統(tǒng)非常重要的組成部分,對(duì)記憶功能和學(xué)習(xí)能力也有著很重要的影響[2]。存活素(SVV)基因,作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員之一,它不僅具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,同時(shí)還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的功能。有相關(guān)研究表明,SVV基因作為一種抗凋亡基因,它的表達(dá)與腫瘤、顱腦外傷[3]、缺血再灌注損傷[4]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及相關(guān)并發(fā)癥[5]等的發(fā)生密切相關(guān)。目前,關(guān)于SVV基因與高溫引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的相關(guān)研究,還鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)觀察在不同的干預(yù)溫度下,尤其是高溫狀態(tài)下,神經(jīng)元細(xì)胞中SVV基因的表達(dá)水平及神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞活力是否會(huì)受影響,為后續(xù)深入研究SVV基因與外界溫度變化,尤其是高溫對(duì)大腦神經(jīng)元細(xì)胞功能的影響提供一些依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系(HT22),由寧夏醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及儀器:DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胎牛血清(FBS)購(gòu)自BI;Survivin Polyclonal antibody(10508-1-AP)購(gòu)自Proteintech;Mouse Anti-β-Actin mAb(TA-09)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)購(gòu)自北京中杉金橋科技有限公司;全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:將培養(yǎng)好的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為4組,對(duì)照組在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng),3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在33 ℃、39 ℃、41 ℃,5% CO2下培養(yǎng),各組分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h。

1.4 Western blot檢測(cè)HT22細(xì)胞中SVV基因的蛋白表達(dá)水平:將HT22細(xì)胞的培養(yǎng)基吸去,加入PBS洗3次,每次5 min。加入胰酶消化細(xì)胞30 s,加入10%血清培養(yǎng)基終止消化,收集消化后的HT22細(xì)胞,移入離心管,使用離心機(jī)(1 000 r/min)離心5 min,吸去上清液,加入裂解液,充分震蕩使細(xì)胞裂解破碎。使用離心機(jī)(12 000 r/min)在4 ℃條件下離心5 min,后吸取上清蛋白液。使用BCA法檢測(cè)上清蛋白液的蛋白濃度,將蛋白液、ddH2O和5×上樣緩沖液混合后配成 30 μg/μL的蛋白工作液,在100 ℃下變性5 min。配制15%分離膠和5%濃縮膠的電泳凝膠,每孔上樣體積為25 μL;先在恒壓80 V條件下電泳30 min,再在恒壓120 V條件下電泳90 min;后恒流200 mA轉(zhuǎn)膜3 h,用5%脫脂牛奶封閉1 h;加入一抗β-Actin(稀釋比例為1∶1 500)、SVV基因(稀釋比例為1∶500),室溫下?lián)u床孵育1 h,4 ℃靜置過(guò)夜;第2 d 取出,搖床復(fù)溫1 h,吸去一抗,用1×TBST洗膜3次,5 min/次;加入二抗(稀釋比例為1∶8 000),搖床孵育1 h,吸去二抗,用1×TBST洗膜3次,5 min/次;加入發(fā)光液,曝光,獲得目的蛋白條帶及內(nèi)參條帶。通過(guò)應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各目標(biāo)蛋白條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參,結(jié)果使用目的蛋白與β-actin的灰度比值進(jìn)行表示,計(jì)算出SVV基因的相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)SVV基因的mRNA表達(dá)水平:將HT22細(xì)胞的培養(yǎng)基吸去,加入PBS洗3次,每次5 min。通過(guò)Trizol法收集并提取HT22細(xì)胞的總RNA。根據(jù)全式金試劑盒(AU341-02)說(shuō)明,將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因的樣本數(shù),配制PCR反應(yīng)液,以每管13 μL分裝,每管再加入2 μL樣本;設(shè)置程序進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng),反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);內(nèi)參設(shè)置為GAPDH。擴(kuò)增完畢后根據(jù)熔解曲線進(jìn)行分析,結(jié)合內(nèi)參,按照公式(2-ΔΔCT 法分析)進(jìn)行計(jì)算,每份樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果取其平均值。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6 CCK-8檢測(cè)HT22細(xì)胞活力:加HT22細(xì)胞懸液每孔100 μL(1×104個(gè)細(xì)胞)到96孔板中(不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置4個(gè)副孔),置于培養(yǎng)箱,設(shè)置37 ℃,5% CO2孵育過(guò)夜;分別置于33 ℃、37 ℃、39 ℃及41 ℃的培養(yǎng)箱中,以5% CO2分別培養(yǎng)12 h、24 h,達(dá)到干預(yù)時(shí)間后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃,5% CO2的條件下孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處各孔的吸光值(OD值),取各孔OD值平均數(shù),計(jì)算細(xì)胞活力。

2 結(jié)果

2.1 溫度變化對(duì)HT22細(xì)胞中SVV基因的蛋白表達(dá)水平的影響:Western blot結(jié)果顯示,與37 ℃對(duì)照組比較,39 ℃實(shí)驗(yàn)組及41 ℃實(shí)驗(yàn)組中SVV基因的蛋白表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出了不同程度的升高(P<0.05),其中以12 h和24 h升高較為明顯;但33 ℃實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化,見(jiàn)圖1(封二)。

2.2 溫度變化對(duì)HT22細(xì)胞中SVV的mRNA表達(dá)水平的影響:Real-time PCR結(jié)果顯示,39 ℃實(shí)驗(yàn)組及41 ℃實(shí)驗(yàn)組中SVV基因的mRNA表達(dá)水平較37 ℃對(duì)照組明顯升高(P<0.05),而33 ℃實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)略有升高(P<0.05)或升高不明顯,見(jiàn)圖2(封二)。

2.3 溫度變化對(duì)HT22細(xì)胞活力的影響:CCK-8結(jié)果顯示,與37 ℃對(duì)照組相比較,33 ℃實(shí)驗(yàn)組、39 ℃實(shí)驗(yàn)組以及41 ℃實(shí)驗(yàn)組中,細(xì)胞活力在12 h及24 h表現(xiàn)出了不同程度的下降(P<0.05),其中以33 ℃下降較為明顯,可見(jiàn)亞低溫對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用較為明顯,見(jiàn)圖3(目次后)。

3 討論

SVV基因是凋亡抑制蛋白家族的成員之一,是在1997年由耶魯大學(xué)的Altierii等通過(guò)使用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1(EPR1)cDNA進(jìn)行雜交,并在人類基因組庫(kù)的雜交篩選中首先分離出來(lái)的[6]。SVV基因可以同時(shí)作用于內(nèi)源性和外源性兩條凋亡信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用。一方面,它可以直接作用于caspase-3,通過(guò)抑制caspase-3的活性,來(lái)阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程[7]。另一方面,它還可以通過(guò)作用于細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4,與其形成SVV-CDK4復(fù)合物,使得p21能夠從CDK4復(fù)合物中釋放出來(lái)并與caspase-3結(jié)合,從而間接地抑制caspase通路而阻斷細(xì)胞凋亡[8]。SVV基因幾乎在所有的人類惡性腫瘤,如在胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高度選擇性表達(dá)[9],但是在除淋巴細(xì)胞、胸腺、多核粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及原始造血細(xì)胞外的多數(shù)正常組織中幾乎不表達(dá)[10]。

在神經(jīng)系統(tǒng)研究領(lǐng)域,有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在顱腦損傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞中的SVV基因大量表達(dá)[11],SVV基因的上調(diào)可以減輕DNA的裂解及細(xì)胞的死亡[12];腦缺血再灌注后的缺血側(cè)腦組織中SVV基因的表達(dá)水平升高,于再灌注3 h后,出現(xiàn)SVV基因陽(yáng)性神經(jīng)元,其參與了抑制腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[13];在缺血性卒中后,SVV基因也呈現(xiàn)出了高表達(dá)[14],其作為一種抗凋亡保護(hù)基因,在卒中后參與了腦內(nèi)新生血管的形成[15]。近年來(lái),在臨床診療過(guò)程中,因?yàn)橛變焊邿狍@厥,以及持續(xù)的高熱狀態(tài)造成兒童大腦損傷時(shí)有發(fā)生。上述關(guān)于SVV基因與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病及顱腦損傷的相關(guān)研究為開(kāi)展研究不同溫度變化,尤其是高溫,對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中SVV基因的表達(dá)情況及細(xì)胞功能的影響提供了一定的參考。

本研究通過(guò)對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行了不同培養(yǎng)溫度的處理,觀察了不同溫度變化尤其是高溫條件對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響,以及細(xì)胞中SVV基因的表達(dá)水平的變化。通過(guò)研究可知,3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的溫度變化使細(xì)胞活力較對(duì)照組有所下降,其中33 ℃實(shí)驗(yàn)組的抑制作用較為明顯,39 ℃實(shí)驗(yàn)組和41 ℃實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力下降程度較33 ℃實(shí)驗(yàn)組弱一些,由此可知,低溫對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用較高溫更強(qiáng)一些,同時(shí),該現(xiàn)象可能也與SVV基因表達(dá)水平升高,對(duì)細(xì)胞起到了保護(hù)作用有關(guān)。

Western blot和Real-time PCR的結(jié)果表明:39 ℃、41 ℃兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中SVV基因的蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平較37 ℃對(duì)照組均有所升高,其中以41 ℃實(shí)驗(yàn)組升高最為明顯,說(shuō)明對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行不同溫度變化(尤其是高溫)的處理時(shí),SVV基因作為一種抗凋亡保護(hù)基因,其表達(dá)水平升高,以抵抗細(xì)胞凋亡,33 ℃實(shí)驗(yàn)組中SVV基因的蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平較37 ℃對(duì)照組輕度升高或升高不明顯,推測(cè)其可能是與亞低溫(33 ℃)本身對(duì)細(xì)胞的抑制作用有關(guān)。

根據(jù)上述結(jié)論可以進(jìn)行進(jìn)一步推斷,即在一定的溫度范圍內(nèi),低溫對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞功能所產(chǎn)生的影響主要體現(xiàn)在其有著較強(qiáng)的抑制作用,而高溫對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響則更多體現(xiàn)在引起或加快細(xì)胞凋亡或壞死,在所得研究結(jié)果中,細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中33 ℃實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力下降較為明顯,Western blot實(shí)驗(yàn)中39℃實(shí)驗(yàn)組和41℃實(shí)驗(yàn)組中SVV基因的蛋白表達(dá)水平升高較明顯可以為這一推斷提供一些依據(jù)。同時(shí),本研究結(jié)果也可為后續(xù)繼續(xù)深入研究高溫對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞及大腦功能影響機(jī)制的研究提供參考。