周 鋼，馬方圓，單蓮蓮，柴冰陽(yáng)，陶 虹△，嚴(yán) 華

（1. 新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830054； 2. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥＜維藥＞質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054； 3. 中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，北京 100050）

尿通卡克乃其片（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080304，規(guī)格為每片0.5 g）為維吾爾藥制劑，由酸漿、黃瓜子、血竭、西黃蓍膠、阿拉伯膠、巴旦仁、甘草浸膏、乳香、芹菜子、阿片等組方，氣微香，味甜、微苦澀，具有止痛、利尿功效，用于尿痛、尿不凈、尿血、尿道流膿等癥的治療。阿片主要含有芐基異喹啉類(lèi)和菲類(lèi)生物堿［1-2］，前者主要為罌粟堿，后者包括嗎啡、可待因、蒂巴因等。阿片主要成分為嗎啡［3］，其為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛劑［4］，但成癮性較大［5］?，F(xiàn)行尿通卡克乃其片現(xiàn)收載于《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》YBZ00342008中，因干擾因素較多，無(wú)法準(zhǔn)確對(duì)嗎啡進(jìn)行定量分析。為更好地控制尿通卡克乃其片的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法［6］測(cè)定制劑中嗎啡的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配有紫外檢測(cè)器，Labsolution 工作站；Milli - Q 型超純水儀［美國(guó)Millipore 公司，電阻率為18.2 MΩ·cm，總有機(jī)碳（TOC）不大于5 × 10-9 μg / L］；XPR205 型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.1 mg）；SK8210LHC 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為35 / 53 kHz）；Centrifuge5430R 型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，最大工作壓力為29 bar，最大轉(zhuǎn)速為17 500 r/min）。

1.2 試藥

嗎啡對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為171201-201123，純度為97.9%）；乙腈（批號(hào)為192552），甲醇（批號(hào)為211769），均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher 公司，純度為99.9%；冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20210810，純度不低于99.5%）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20140218，純度不低于99.0%）；庚烷磺酸鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為2017051101，純度不低于99.0%）；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；尿通卡克乃其片（新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號(hào)分別為181197，180847，181196，190925，181034，191142，200103，200112，1904022，1902022，嗎啡含量為0.065%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：島津Shim - pack GIST - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 0.05 mol/ L 磷酸氫二鉀溶液- 0.025 mol / L 庚烷磺酸鈉溶液（15∶45∶40，V/V/V）［6］；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。供試品溶液色譜圖中，嗎啡色譜峰與相鄰色譜峰分離度為1.85，理論板數(shù)為7 122，拖尾因子為1.20，表明嗎啡和樣品中其他組分色譜峰可達(dá)到基線分離。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取嗎啡對(duì)照品20.32 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.397 9 mg/mL對(duì)照品貯備液；精密吸取1 mL，置5 mL容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品20 片，研細(xì)，取5 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加1%冰醋酸甲醇溶液25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，加1%冰醋酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），取上清液，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒杯中蒸干，加1%冰醋酸甲醇溶液2 mL，振搖、超聲，使殘?jiān)纬删鶆蚧鞈乙海m(xù)加5%冰醋酸溶液10 mL，超聲處理10 min，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，加少量5%冰醋酸溶液洗滌燒杯（重復(fù)2次），轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，放冷，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，取5 mL，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/ min）10 min，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方工藝制備除阿片的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)為200103）、陰性對(duì)照品溶液各適量，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜圖中出現(xiàn)與嗎啡對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1 mL，分別置2，5，10，25，50，100 mL 容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為3.979，7.958，15.916，39.790，79.580，198.950 μg/ mL 的系列對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)工作液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、嗎啡的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 3 578X- 43 665，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，嗎啡的質(zhì)量濃度在3.979～198.950μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限與定量限確定：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）為3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，以S/N為10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測(cè)限為1μg/mL，定量限為3μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果嗎啡峰面積的RSD為0.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果嗎啡峰面積的RSD為0.32%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為200103）適量，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果嗎啡的平均含量為0.064%，RSD為2.09%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取已知含量的樣品粉末（批號(hào)為200103）2.5 g，精密稱(chēng)定，共9 份，分別置三角瓶中；取嗎啡對(duì)照品5.25，6.52，7.89 mg，精密稱(chēng)定，各3份，分別置100 mL 容量瓶中，即得質(zhì)量濃度分別為0.051 40，0.063 83，0.077 24 mg/mL 的對(duì)照品溶液；精密吸取對(duì)照品溶液各25 mL，置三角瓶中，按2.2 項(xiàng)下方法從“稱(chēng)定質(zhì)量”起制備供試品溶液，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，符合要求［7］。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別使用不同色譜柱［島津Shim-pack GIST-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shiseido Capcellpak C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）、Agilent Zobax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果每片分別含嗎啡0.33，0.32，0.33 mg，表明色譜柱的耐用性良好?？疾觳煌鲃?dòng)相系統(tǒng)［乙腈-0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-0.025 mol/L庚烷磺酸鈉溶液（20∶40∶40，V/V/V），甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-0.025 mol/L庚烷磺酸鈉溶液（40∶30∶30，V/V/V）］［8］和不同柱溫（20～40 ℃）對(duì)樣品中嗎啡含量的影響，結(jié)果供試品溶液色譜峰保留時(shí)間與嗎啡對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，拖尾因子與分離度均符合要求。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取10 批樣品粉末5 g，各2 批次，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣測(cè)定2次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果10批樣品中嗎啡的平均含量為每片0.32 mg，詳見(jiàn)表2。

表2 10批樣品中嗎啡含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of the content determination of morphine in 10 batches of samples

3 討論

3.1 提取方法考察

尿通卡克乃其片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中阿片的含量測(cè)定項(xiàng)下存在以下問(wèn)題：1）原標(biāo)準(zhǔn)中使用甲醇溶解嗎啡對(duì)照品，穩(wěn)定性較差，嗎啡的峰面積隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減?。?-10］；2）使用高效液相色譜法分析供試品溶液，發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)峰對(duì)主峰干擾嚴(yán)重，使檢測(cè)值嚴(yán)重失真。2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》阿片含量測(cè)定項(xiàng)下［11］，經(jīng)固相萃取柱提純樣品后使用高效液相色譜法測(cè)定，提取過(guò)程中雜質(zhì)干擾較小，試驗(yàn)可順利進(jìn)行，但對(duì)尿通卡克乃其片中嗎啡的提取無(wú)借鑒意義。

阿片在尿通卡克乃其片中占1%，嗎啡在阿片中含量約為10%，在處方中約占0.1%。方中，樹(shù)脂類(lèi)藥材總占比達(dá)40%以上，其中阿拉伯膠、西黃蓍膠為水溶性樹(shù)脂［12］，乳香、血竭為脂溶性樹(shù)脂，導(dǎo)致樣品成分復(fù)雜，用含水的溶劑提取會(huì)形成均勻的乳濁液，用濾頭過(guò)濾后仍無(wú)法消除。嗎啡在日光下和空氣中放置會(huì)逐漸氧化變性，在常規(guī)溶液中不穩(wěn)定，而在酸性溶液中較穩(wěn)定且溶解度極好。故本研究中采用1%冰醋酸甲醇溶液提取樣品，去除大多數(shù)阿拉伯膠和西黃蓍膠后，蒸干，先用少量1%冰醋酸甲醇溶液振搖、超聲，使殘?jiān)纬删鶆蚧鞈乙?，續(xù)加5%冰醋酸溶液提取、定容。絕大部分乳香和血竭以沉淀形式析出，經(jīng)離心、過(guò)濾后，得到供試品溶液［13-15］。

預(yù)試驗(yàn)中采用2 種方法考察提取過(guò)程中放置溶劑的蒸發(fā)皿對(duì)提取結(jié)果的影響。方法1：蒸干后殘?jiān)?%冰醋酸甲醇3 mL，超聲振蕩形成均勻混懸液，再加5%冰醋酸溶液提取；方法2：蒸干后殘?jiān)苯蛹?%冰醋酸溶液提取。結(jié)果表明，方法1 所得嗎啡含量高于方法2，原因?yàn)橹苄猿煞趾推骶弑砻娼Y(jié)合成一層疏水膜，冰醋酸溶液無(wú)法有效進(jìn)入而提取嗎啡。故最終確定2.2項(xiàng)下供試品溶液提取方法。

3.2 提取時(shí)間考察

取樣品（批號(hào)為200103）研細(xì)，取粉末5 g，精密稱(chēng)定，共3 份，分別置三角瓶中，精密加入1%冰醋酸甲醇溶液25 mL，分別考察超聲提取20，30，40 min 對(duì)提取結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，超聲提取30 min 時(shí)嗎啡含量最高，與提取40 min 的結(jié)果基本一致；提取20 min 的結(jié)果稍低，可能由于制劑中樹(shù)脂占比大，影響嗎啡的溶解速率。故最終確定提取時(shí)間為30 min。

3.3 檢測(cè)結(jié)果偏高原因分析

制備供試品溶液時(shí)，溶液中存在較多血竭和乳香，影響定容，沉淀物占據(jù)容量瓶一定體積導(dǎo)致分析結(jié)果略偏高，可通過(guò)擴(kuò)大稀釋倍數(shù)減輕此影響。

3.3 制劑成癮性分析

成人口服給藥途徑嗎啡攝入量一般為每次5～15 mg，每天15～60 mg；極量為單次不得過(guò)30 mg，每日不得過(guò)100 mg。該制劑服用量為每次3～5片，每天2次，最大單次攝入量約為1.6 mg，每日最大攝入量約為3.2 mg，遠(yuǎn)低于嗎啡的常規(guī)使用劑量，不會(huì)產(chǎn)生成癮性。

3.4 方法評(píng)價(jià)

該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于尿通卡克乃其片中嗎啡的含量測(cè)定。