郭莉,魏秀麗,王繼芳,吳志敏,蘇婷婷,任榮香,王承華,田麗麗

(新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 血液內(nèi)科,河南 新鄉(xiāng) 453000)

真性紅細胞增多癥是一種造血干細胞克隆性疾病,屬于骨髓增殖性腫瘤范疇,以紅細胞異常增殖、血容量增高和血液黏滯為主要特征[1]。據(jù)統(tǒng)計,真性紅細胞增多癥發(fā)病率為(0.4～1.6)/10萬人,且近年來呈不斷升高趨勢,該病起病隱匿、發(fā)展緩慢,極易并發(fā)心肌梗死、心力衰竭等心血管并發(fā)癥,嚴重威脅患者生命安全[2]。因此,加強對真性紅細胞增多癥分子水平的研究,尋找可靠的早期診斷分子標志物,對預測其并發(fā)癥發(fā)生有重要意義。蛋白質(zhì)組學技術(shù)是從蛋白整體水平探討正常與病理條件下蛋白譜表達差異,具有高通量、高靈敏度、高效率的特性[3]。近年來蛋白質(zhì)組學技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和完善,為從蛋白分子角度尋找各種疾病的早期特異性診斷標志物與發(fā)病機制研究提供了新的思路和方法。多項研究顯示,蛋白質(zhì)組學在血栓形成[4]、急性髓系白血病[5]、遺傳性球形紅細胞增多癥[6]等多種血液系統(tǒng)疾病中通過篩選出疾病相關(guān)的生物標志物,為臨床診斷和治療提供數(shù)據(jù)參考。但截至目前,仍然缺乏有效的、可預測的分子標志物來診斷真性紅細胞增多癥。因此本研究通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)探究真性紅細胞增多癥患者差異表達的蛋白,為真性紅細胞增多癥的早期診斷和預后篩查提供分子病理依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2022年1—12月在新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院就診的40例真性紅細胞增多癥患者和40例健康志愿者,分別記作疾病組和健康組。疾病組男24例,女16例;年齡30～77(58.06±7.25)歲;病程1～15[8.5(4,10)]a;脾腫大24例,血栓栓塞病史8例;血紅蛋白(haemoglobin,Hb)173～209 (190.26±14.33)g·L-1;紅細胞比容55.17%～71.69%(64.33±5.24)%。健康組男20例,女20例;年齡33～75(56.53±6.92)歲。兩組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.202,P=0.653;t=1.572,P=0.118)。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 選取標準

(1)納入標準:①疾病組符合真性紅細胞增多癥的診斷標準[7];②健康組均為健康體檢人群;③患者及志愿者年齡≥18歲;④患者及家屬知情同意,并簽署知情同意書。(2)排除標準:①繼發(fā)性或相對性紅細胞增多癥;②伴有其他血液系統(tǒng)疾病;③合并免疫系統(tǒng)疾病;④既往血栓;⑤合并其他惡性腫瘤;⑥有精神疾病不能配合診療。

1.3 實驗試劑及儀器

ProteoMiner高豐度蛋白質(zhì)去除蛋白質(zhì)濃縮試劑盒(貨號163-3003,購自美國Bio-Rad公司);質(zhì)譜級胰蛋白酶(貨號BTN131029,購自北京百奧萊博科技有限公司);iRT內(nèi)標肽試劑盒(貨號Ki-3002-1,購自瑞士Biognosys公司);TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司);LC-100型高效液相色譜儀(購自上海伍豐科學儀器有限公司);Agilent 7850 ICP-MS型質(zhì)譜儀(購自美國Agilent公司)。

1.4 研究方法

1.4.1高效液相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定篩選出差異表達蛋白

分別抽取兩組受試者清晨空腹EDTA-K2抗凝靜脈血各5 mL,室溫靜置30 min,4 ℃下以3 000g離心10 min,吸取上層血漿分裝凍存于-80 ℃冰箱待用。通過ProteoMiner蛋白質(zhì)濃縮試劑盒去除上清樣品中的高豐度蛋白獲得低豐度蛋白,用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳進行蛋白定量和分離,加入人胰蛋白酶裂解成肽段,將樣品加載到對稱C18柱吸附和脫鹽,采用高效液相色譜分析肽段,C18反相分析柱進行分離,獲取差異蛋白肽段進行后續(xù)的質(zhì)譜分析。使用高分辨質(zhì)譜儀進行同位素標記相對和絕對定量技術(shù)檢測,質(zhì)譜掃描后使用質(zhì)譜分析軟件Proteome Discoverer 2.5和Mascot 2.6進行定量和定性數(shù)據(jù)分析,找出表達差異有統(tǒng)計學意義(差異倍數(shù)>1.2,P<0.05)的蛋白。

1.4.2差異表達蛋白的生物信息學分析

利用Blast2GO軟件對差異表達蛋白集合進行基因本體(gene ontology,GO)(http://www.geneontology.org/)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)(https://www.kegg.jp/)通路富集分析。以P<0.05為閾值,得到有統(tǒng)計學意義的注釋,進而得到差異表達蛋白在GO類別上的分布信息及其參與的信號轉(zhuǎn)導通路。

1.4.3差異表達蛋白的蛋白互作分析

將差異表達蛋白導入STRING_v11.5在線數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)分析其相互作用的關(guān)系,并將分析得到的結(jié)果導入在線作圖軟件Cytoscape_v3.9.1(https://manual.cytoscape.org/en/3.9.1/)繪制蛋白相互作用分析圖。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 差異表達蛋白篩選結(jié)果

所有受試者血漿中共鑒定到871種蛋白,將兩組受試者血漿中蛋白表達的比值作為兩組間蛋白的差異表達量,取log2使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用獨立樣本t檢驗推算P值,健康組和疾病組受試者血漿中共篩選出34種差異表達蛋白(差異倍數(shù)>1.2,P<0.05)。與健康組相比較,疾病組患者血漿中有13種蛋白表達上調(diào),21種蛋白表達下調(diào),見圖1。其中表達上調(diào)的前10種蛋白為Hb、血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)、Janus激酶(Janus kinase,JAK)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP-1)、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子(signaltrans ducerandactivatoroftranscription,STAT)、肌營養(yǎng)不良蛋白關(guān)聯(lián)糖蛋白1(dystrophin-associated glycoprotein 1,DAG1)、6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase,PGLS)、胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)、免疫球蛋白λ常數(shù)2(immunoglobulin lambda constant 2,IGLC2);表達下調(diào)的前10種蛋白為促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、凝血因子Ⅸ(recombinant coagulation factor Ⅸ,F9)、纖維膠凝蛋白3(ficolin 3,FCN3)、核糖體蛋白S27a(ribosomal protein S27a,RPS27A)、胰島素樣生長因子酸不穩(wěn)定亞基(insulin-like growth factor acid-labile subunit,IGFALS)、蘋果酸脫氫酶1(malate dehydrogenase 1,MDH1)、肌球蛋白輕鏈6(myosin light polypeptide 6,MYL6)、正五聚蛋白3(pentraxin 3,PTX3)、免疫球蛋白M重鏈(immunoglobulin M heavy chain,IGHM)、氨肽酶N(aminopeptidase N,ANPEP)。

圖1 健康組和疾病組患者差異表達蛋白火山圖

2.2 差異表達蛋白的GO富集分析

兩組差異表達蛋白的GO功能富集分析結(jié)果顯示,其參與的生物過程(biological process,BP)主要包括中性粒細胞激活、免疫反應、蛋白級聯(lián)激活、氧化應激等;細胞成分(cellular component,CC)主要位于細胞質(zhì)內(nèi),其中包括初級溶酶體顆粒、細胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、分泌顆粒管腔等;分子功能(molecular function,MF)主要有抗原結(jié)合、肽結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、過氧化物酶活性等。見圖2。

圖2 差異表達蛋白的GO功能富集分析

2.3 差異表達蛋白的KEGG富集分析

KEGG通路富集分析顯示,兩組患者差異表達蛋白主要參與造血細胞譜系、JAK/STAT信號通路、細胞黏附分子、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、膽固醇代謝、谷胱甘肽代謝等生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導通路。見圖3。

圖3 差異表達蛋白的KEGG通路富集分析

2.4 差異表達蛋白的互作分析

STRING在線數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,34種差異表達蛋白中有23種蛋白與其他蛋白之間無相互作用關(guān)系,其余11種蛋白分別在4種功能網(wǎng)絡(luò)中存在相互作用關(guān)系。其中RPS27A、Hb和JAK蛋白與其他蛋白的相關(guān)度較高。見圖4。

圖4 差異表達蛋白相互作用分析圖

3 討論

真性紅細胞增多癥的病因和發(fā)病機制都不十分明確,目前認為可能是基因突變導致紅細胞異常增殖。引起基因突變的因素包括化學毒物刺激、電離輻射等[8]。近年來隨著分子生物學的發(fā)展,靶向治療的出現(xiàn)為真性紅細胞增多癥的治療提供了新的方向[9]。因此,探究真性紅細胞增多癥的蛋白質(zhì)組學對了解其發(fā)病機制、尋找新的治療靶點有重要意義。

本研究中兩組受試者血漿中共篩選出34種差異表達蛋白。與健康組相比較,疾病組患者血漿中有13種蛋白表達上調(diào),21種蛋白表達下調(diào)。其中Hb、SAA、JAK為表達上調(diào)較高的蛋白,EPO、F9、FCN3為表達下調(diào)較高的蛋白。蛋白質(zhì)組學技術(shù)是一種對復雜樣品中全部蛋白進行大規(guī)模修飾定性和定量分析的技術(shù),可綜合分析蛋白的生物學特性,明確蛋白的功能及其相互作用關(guān)系,并確定蛋白在細胞中的定位以及翻譯后修飾水平[10]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以系統(tǒng)挖掘疾病的致病機制,目前已經(jīng)在多種疾病的研究中得到廣泛應用。Hb是紅細胞的主要組成成分,Hb表達升高提示血液中紅細胞增多,是真性紅細胞增多癥的重要病理學表現(xiàn)[11]。SAA水平的升高提示機體發(fā)生了急性炎癥損傷,可能參與了炎癥損害時的血栓形成[12]。JAK屬于非受體蛋白酪氨酸激酶家族,其異常活化可導致血細胞增殖失控[13]。EPO是調(diào)控紅系細胞增殖分化的最主要的細胞因子,在促進血管生成和減少梗死中發(fā)揮重要作用[14]。Meier-Abt等[15]指出,真性紅細胞增多癥患者紅細胞計數(shù)增加,引起血液黏滯,F9等凝血因子被消耗,最終導致血栓發(fā)生。FCN3主要分布于血漿中,可通過激活凝集素途徑參與凝血、緩激肽釋放、內(nèi)皮細胞和血小板活化等過程[16]。Sekiguchi等[17]研究證實Hb可作為診斷真性紅細胞增多癥的血漿生物標志物,譚怡等[18]研究也證實了真性紅細胞增多癥患者血漿中EPO水平明顯降低,EPO可作為真性紅細胞增多癥病因的預測標志物。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

本研究中兩組差異表達蛋白的GO功能富集分析結(jié)果顯示,其主要位于細胞質(zhì)內(nèi),通過干預抗原結(jié)合、肽結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合等MF,參與中性粒細胞激活、免疫反應、蛋白級聯(lián)激活、氧化應激等BP,提示上述BP、CC和MF及其富集的蛋白分子在真性紅細胞增多癥的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。KEGG通路富集分析顯示,兩組患者差異表達蛋白主要參與的有造血細胞譜系、JAK/STAT信號通路、細胞黏附分子等代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導通路,提示差異表達蛋白可能是通過上述代謝途徑和通路參與調(diào)控真性紅細胞增多癥的病理進程的。真性紅細胞增多癥是一種典型的骨髓增殖性腫瘤,以紅細胞增多為主要病理表現(xiàn),同時伴有白細胞和血小板升高,差異表達蛋白可能是通過影響造血細胞譜系的生物學過程參與真性紅細胞增多癥的發(fā)生發(fā)展。既往研究顯示,真性紅細胞增多癥患者多存在JAK2基因V617F突變,該突變可使JAK2蛋白異?；罨?進而促進JAK2下游STAT磷酸化,造成JAK/STAT信號通路持續(xù)活化,最終導致紅細胞增殖失控,加劇病情進展[19]。血栓是真性紅細胞增多癥最常見并發(fā)癥,高紅細胞比容導致血液黏度增加,細胞黏附分子在該過程中發(fā)揮重要作用[20]。STRING在線數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,RPS27A、Hb和JAK蛋白與其他蛋白的相關(guān)度較高,提示這3種蛋白可能是診斷真性紅細胞增多癥的潛在蛋白標志物。雖然單一的蛋白差異表達不可能是真性紅細胞增多癥的特定指標,但不同蛋白的綜合差異表達可能為真性紅細胞增多癥的診斷和監(jiān)測提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

真性紅細胞增多癥患者差異表達蛋白主要富集于造血細胞譜系、JAK/STAT信號通路、細胞黏附分子等代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導通路參與真性紅細胞增多癥的發(fā)生發(fā)展,RPS27A、Hb和JAK蛋白可能是診斷真性紅細胞增多癥的潛在蛋白標志物。本研究對真性紅細胞增多癥患者進行了初步的蛋白質(zhì)組學分析,為進一步探索其診斷標志物提供了方向。