楊海燕 黃云霞 文靜

（1. 川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學院藥學院，四川 南充 637000）

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范圍內最為常見的肝臟疾病之一，患病率約為25%，發(fā)病機制較為復雜且認知有限，因而尚無針對NAFLD 有效的治療方法[1-2].。根據(jù)其組織學的不同，NAFLD 可分為非酒精性單純性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）兩種，前者僅存在肝細胞變形而無明顯的肝細胞損傷，通常注意飲食可得到改善；而后者為NAFLD 的嚴重病理類型之一，易演變?yōu)橥砥诟斡不?、肝纖維化、肝癌等惡性肝病，造成不可逆后果[3-5]。因此，尋找針對NASH 治療的有效藥物、探究其作用機制對該病的臨床治療及科學研究均具有十分重要的意義。虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根莖和根，有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功（2020 版《中華人民共和國藥典》（一部））?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，虎杖具有抗炎、抗氧化、調節(jié)代謝、改善微循環(huán)、肝保護、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、神經保護、血管新生等生物活性[6-7]，可改善酒精性脂肪肝[8]、非酒精性脂肪肝[9]、肝臟缺血再灌注損傷[10]等引起的肝損傷，發(fā)揮一定的保肝作用。但有關虎杖對非酒精性脂肪性肝炎的報道較少，且多為復方研究，對其作用機制更是知之甚少。

由于虎杖具有多成分、多靶點、多通路的特點，為探究其對NASH 的保護作用，此研究采用網絡藥理學技術預測虎杖治療NASH 的主要活性成分及潛在靶點，探究其主要作用機制，為臨床虎杖治療NASH 提供一定的參考，并為NASH 的治療提供一定的新想法及新思路。

1 材料與方法

1.1 虎杖活性成分及靶點的獲取

借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php），以OB＞30%，DL＞0.18 為篩選條件獲取虎杖的活性成分，并以各活性成分CAS 號于Pubmed compound 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載其2D 結構式，保存為sdf 格式，將其結構式導入 Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）獲得各活性成分的作用靶點，將其靶點通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）標準化為Gene Symbol 格式，篩除重復項后得到虎杖活性成分作用靶點。

1.2 非酒精性脂肪性肝炎靶點的獲取

以“NASH”、“non-alcoholic steatohepatitis”為關鍵詞于Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org）、OMⅠM（https://www.omim.org）等數(shù)據(jù)庫下載相關靶點，篩除重復項后獲得NASH 相關靶點。

1.3 韋恩圖及成分-靶點網絡圖的構建

分別將獲得的虎杖活性成分作用靶點與NASH 相關靶點導入微生信在線制圖平臺（www.bioinformatics.com.cn）繪制韋恩圖，獲取二者交集靶點；并通過Cytoscape 3.9.1 軟件構建成分-靶點網絡圖，預測虎杖治療NASH 的主要活性成分。

1.4 蛋白互作網絡圖（Protein-protein interaction，PPⅠ）建立的繪制及核心靶點的獲取

將虎杖活性成分與NASH 的交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）蛋白種屬選擇“Homo sapiens” ， 設定“minimum required interaction score”的“medium confidence=0.9”，獲得PPⅠ網絡圖，將該網絡圖導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行美化并借助Cytohubba 插件獲取“Top 10”核心靶點，預測虎杖治療NASH 的關鍵靶點。

1.5 基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導入Metascape 平臺（https:// metascape. org/gp/ index.htmL#/main/step1）進行GO 及KEGG 富集分析，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍，篩選排名前15 的生物功能及通路過程，通過微生信在線繪圖平臺（www.bioinformatics.com.cn）將結果可視化。

1.6 靶點-通路網絡的構建

將虎杖作用于NASH 潛在靶點數(shù)據(jù)通過Cytoscape 3.9.1 繪制靶點通路網絡圖進行可視化。

2 結果

2.1 虎杖主要活性成分作用靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫以OB＞30%，DL＞0.18為篩選條件，獲得虎杖10 個主要活性成分，將其結構式導入Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫獲得各活性成分作用靶點，篩除重復項后得到虎杖主要活性成分作用靶點436 個。

2.2 NASH 相關作用靶點

通過Genecards、Disgenet、OMⅠM 數(shù)據(jù)庫下載NASH 相關作用靶點，刪除重復項后得到3944個NASH 相關靶點。

2.3 韋恩圖及成分-靶點網絡得構建

將虎杖主要活性成分靶點及NASH 相關作用靶點導入微生信在線制圖平臺繪制韋恩圖，獲得二者交集靶點81 個，見圖1，表明虎杖可能通過此81 個靶點作用于NASH 發(fā)揮治療作用。并借助Cytoscape3.9.1 軟件將10 個活性成分及81 個潛在作用靶點繪制成分-靶點網絡圖，如圖2所示。按照度值（表1）對活性成分進行排序，篩選出靠前的主要活性成分為 6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine，分別可與67、65、63 個靶點發(fā)生作用，表明此三者為虎杖作用于NASH 的主要活性成分。

表1 虎杖主要活性成分及度值

圖1 虎杖治療NASH 交集靶點的韋恩圖

圖2 成分-靶點網絡

2.4 PPⅠ網絡圖及核心靶點

將虎杖-NASH 交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫設置“medium confidence=0.9”獲得PPⅠ網絡，該網絡圖包含81 個節(jié)點，134 條邊，通過Cytoscape 3.9.1軟件對該網絡圖進行美化，如圖3 所示。借助Cytohubba 插件獲取“Top 10”核心靶點，如表2、圖4 所示，該結果表明，虎杖主要通過作用于SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 等關鍵蛋白發(fā)揮對NASH 的治療作用。

表2 核心靶點度值及介度中心數(shù)

圖3 PPI 網絡圖

圖4 “Top 10”核心靶點網絡

2.5 GO 及KEGG 富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導入Metascape 平臺，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍進行GO 功能注釋，得到生物過程（Biological process，BP）條目1092 個、細胞組分（Cellular component，CC）條目49 個、分子功能（Molecular function，MF）條目98 個。將p 值前15 的條目通過微生信在線制圖平臺進行可視化，如圖5 所示。結果表明，虎杖治療NASH 可能通過調節(jié)細胞對脂質的反應（Cellular response to lipid）、激素反應（Response to hormone）、細胞內受體信號通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物過程；受體復合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微結構域（Membrane microdomain）等細胞組分；核受體活性（Nuclear receptor activity）、配體激活的轉錄因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。

圖5 GO 功能富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導入Metascape 平臺，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍進行KEGG 富集分析，富集到130 條信號通路。按P 值大小將前15 條通路借助微生信在線制圖平臺進行可視化，如圖6 所示。結果提示虎杖可能通過調節(jié)癌癥通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信號通路、化學致癌作用-受體激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌癥中的應用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信號通路發(fā)揮對NASH 的治療作用。

圖6 KEGG 富集分析

2.6 靶點-通路網絡

采用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制靶點-通路網絡，如圖7 所示。按度值大小排序，發(fā)現(xiàn)AKT、EGFR、GRB2、ⅠGF1R、SRC、ⅠGF1、MDM2、MET、RAC1、MMP9 等靶點與主要調節(jié)信號通路關系較為密切，表明這些靶點可能在虎杖治療NASH 過程中發(fā)揮關鍵作用。

圖7 靶點-通路網絡

3 討論

NASH 為NFALD 進展為肝硬化、肝纖維化、肝癌的關鍵性環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為肝脂肪變、肝細胞損傷、炎癥、纖維化、內質網應激、線粒體功能障礙等，治療主要針對糖脂代謝紊亂、炎癥、細胞凋亡、纖維化、改善胰島素抵抗、調節(jié)腸道菌群等[11-12]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)虎杖及其復方可以發(fā)揮抗炎、抗氧化、改善胰島素抵抗、調節(jié)脂質代謝、抑制內質網應激等藥理活性改善肝臟疾病損傷[7,13-14]，但對NASH 的研究較少，且機制尚不明確。

本研究應用網絡藥理學技術探究虎杖治療NASH 的潛在靶點及作用機制，篩選得到虎杖主要活性成分10 個、活性成分作用靶點436 個、NASH 疾病靶點3944 個，二者交集靶點81 個。通過構建成分靶點網絡、PPⅠ網絡、GO、KEGG富集分析分析有關成分、靶點、作用途徑、通路之間的關系。結果顯示，6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine 可能為虎杖改善NASH 的主要活性成分。6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、luteolin 均為黃酮類化合物，現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制細胞外基質、的異常堆積、調節(jié)脂質代謝等作用改善肝纖維化、酒精性肝病所致肝細胞損傷從而發(fā)揮保肝作用[15-17]。PPⅠ拓撲分析發(fā)現(xiàn)SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 可能為虎杖改善NASH 的潛在靶點。

非受體酪氨酸激酶SRC 在腫瘤的存活、增殖、遷移過程中扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)抑制SRC 表達可抑制肝癌細胞的轉移，對肝癌的發(fā)生有一定的改善作用[18-19]；RXRA、RXRB 均屬維甲酸受體家族蛋白，研究表明RXRA 在肝臟中大量表達，可通過調控其表達發(fā)揮抗炎、調節(jié)代謝、抗凋亡等改善肝纖維化[20-21]；GRB2 在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中異常表達，實驗證實抑制GRB2 的表達可抑制肝癌細胞侵襲及增殖[22-23]；AKT1 與細胞增長、凋亡等密切相關，在肝癌的發(fā)生過程中具有重要的意義，抑制其表達可抑制肝癌細胞增殖并促使其凋亡[24]；同樣的，ESR1 的表達也與肝癌細胞增殖呈現(xiàn)一定的相關性[25]；STAT1、JAK 參與細胞增殖、凋亡、免疫、線粒體功能、內質網應激等調節(jié)，可改善肝癌、肝衰竭、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎等肝臟相關疾病[26-29]；ⅠGF1、ⅠGF1R 為合成代謝相關因子，調控其表達可抑制脂質蓄積及纖維化，改善非酒精性脂肪肝[30]，且其表達還與肝癌細胞的增殖有關[31]。GO 富集分析結果表明虎杖治療NASH 可能通過調節(jié)細胞對脂質的反應（Cellular response to lipid）、激素反應（Response to hormone）、細胞內受體信號通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物過程；受體復合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微結構域（Membrane microdomain）等細胞組分；核受體活性（Nuclear receptor activity）、配體激活的轉錄因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。KEGG 富集分析結果表明結果提示虎杖可能通過調節(jié)癌癥通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信號通路、化學致癌作用-受體激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌癥中的應用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信號通路發(fā)揮對非酒精性脂肪性肝炎的治療作用。癌癥、肝癌等相關通路主要涉及基因突變、凋亡、細胞周期、細胞增殖轉移等過程[32]；PⅠ3K-Akt 信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡過程[33-34]，且在炎癥及氧化應激等過程中也發(fā)揮作用[35-36]。Ras 通路被證實參與肝炎、肝纖維化等肝病發(fā)生發(fā)展過程，可能機制與抗炎、抗凋亡有關[37]。

綜上所述，虎杖可能通過調節(jié)癌癥、PⅠ3K/Akt、肝癌、Ras 信號通路以調節(jié)SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R等蛋白的表達發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調節(jié)脂質代謝、抑制細胞增殖等作用改善NASH 損傷。