毛曉菲,黃世平,銀芳柳,曾幼玲

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830000)

0 引 言

【研究意義】干旱和高鹽脅迫是抑制植物生長和作物產(chǎn)量的兩個主要環(huán)境因素。當植物遭受鹽旱脅迫時會導(dǎo)致細胞中活性氧(ROS)的過度累積[1],ROS會氧化膜磷脂以及游離氨基酸等物質(zhì)而產(chǎn)生有毒物質(zhì),如醛類[2]。解決植物在逆境環(huán)境下的生存問題,有必要去除和解毒過量的醛類化合物[3]?！厩叭搜芯窟M展】乙醛脫氫酶基因(ALDH)超家族成員是一大類催化酶,在NAD(P)+的協(xié)助下,乙醛脫氫酶可以將有毒醛氧化形成相對應(yīng)的羧酸,使植物不被醛類毒害而緩解逆境脅迫[4]?；谄涞鞍仔蛄?共鑒定出24個家族,其中ALDH10、ALDH12、ALDH19、ALDH21、ALDH22、ALDH23和ALDH24家族是植物所特有的[5]。ALDH7家族的酶被稱為Δ1-piperideine-6-carboxylate脫氫酶(P6CDH, E.C.1.2.1.31),或α-氨基己二酸半醛脫氫酶(AASADH),是一個典型的跨物種高度保守的蛋白群[5],參與賴氨酸的分解代謝,并催化α-氨基己二酸半醛轉(zhuǎn)化為無毒的α-氨基己二酸,從而緩解醛類對植物的毒害[6]。植物ALDH基因已經(jīng)從多種植物中克隆,如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、水稻(OryzasativaL.)[8]、葡萄(VitisviniferaL.)[9]、玉米(ZeamaysL.)[10]等,且基因的過表達在不同程度上可提高轉(zhuǎn)基因植物對鹽旱脅迫和氧化脅迫的耐受性?！颈狙芯壳腥朦c】鹽穗木(Halostachyscaspica, Bieb.)是一種耐鹽性極強的莧科矮灌木,自然生長在高鹽堿半荒漠地區(qū)。課題組前期以pMD18-T Simple-HcALDH7B4為模板,通過PCR擴增、連接轉(zhuǎn)化以及酶切,成功構(gòu)建重組的原核表達載體pET28a-HcALDH7B4[11]。需繼續(xù)基于已構(gòu)建的pET-28a-HcALDH7B4重組載體,原核誘導(dǎo)表達,分析鹽旱脅迫下重組大腸桿菌耐鹽抗旱性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究HcALDH7B4基因在原核細胞里的耐鹽抗旱性,分析鹽旱脅迫下重組菌株的菌落大小和生長活力,為HcALDH7B4基因的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將實驗保存的鹽穗木種子接種到培養(yǎng)基質(zhì)(1∶1∶2蛭石∶珍珠巖∶土壤)中,培養(yǎng)條件:溫度26℃,相對濕度20%～30%,黑暗/光照周期為8/16 h。生長2.5個月后給予鹽旱脅迫處理。設(shè)鹽穗木不同濃度的NaCl處理(200、400、600 mmol/L)并分別于0、6、12、24、48、72 h采樣;于旱脅迫,設(shè)自然干旱處理并分別于15、30 d采樣。

E.coliDH5α、Transetta (DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;Transcriptase M-MLV(RNase H)、ITPG、蛋白Marker購自大連寶生物技術(shù)有限公司;SYBR?Select master Mix購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;引物由上海生工工程股份有限公司合成;其余常用試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 HcALDH7B4的生物信息學分析

ExPASy 軟件用于在線預(yù)測鹽穗木HcALDH7B4蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、親疏水性和三級結(jié)構(gòu);Conserved Domain Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)用于其結(jié)構(gòu)域分析。通過NCBI中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)檢索HcALDH7B4同源序列,利用MEGA 7.0軟件中ClustalW程序進行多序列比對,通過Neighbor-joining鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

取1.5 g鹽穗木同化枝,提取總RNA。使用M-MLV(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3HcALDH7B4在不同處理下的表達模式

基于鹽穗木HcALDH7B4的序列,設(shè)計特異性引物HcALDH7B4-p1和HcALDH7B4-p2 。使用SYBR?Select master Mix和ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行檢測。反應(yīng)條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。每個樣本有4個生物學重復(fù)。β-actin作為內(nèi)參基因。相對表達水平用2-ΔΔct定量。相對定量的最終值為基因表達與試驗中對照相比的倍數(shù)變化。表1

表1 引物

1.2.4 原核表達的重組菌(pET-28a-HcALDH7B4)的鑒定和誘導(dǎo)表達

通過PCR擴增以及雙酶切對前期構(gòu)建的pET28a-HcALDH7B4重組載體進行鑒定。將鑒定正確的含有重組質(zhì)粒pET28a-HcALDH7B4的Transetta菌種擴大培養(yǎng)至菌液OD600在0.6～0.8時,加入ITPG至終濃度0.6 mmol/L,30℃誘導(dǎo)表達4h,SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達并用Western blot鑒定[11]。

1.2.5 重組菌株的鹽旱脅迫耐受性測定

滴板實驗:將重組菌株(pET-28a-HcALDH7B4)和對照菌株(pET-28a)擴大培養(yǎng)至OD6000.5后加入0.6 mmol/L ITPG,誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h至OD6000.8,之后以10-1、10-2、10-3和10-4為梯度將菌液進行稀釋[12]。將每個稀釋的樣品(5 μL)分別點于含有500 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、500、800 mmol/L Manntiol的固體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后拍照。

液體培養(yǎng):將達到OD6000.8的2種菌株按1%(V/V)的接種量,分別接種到添加有500 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、500、800 mmol/L Manntiol的新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測菌液在不同處理下OD600的值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GraphPad Prism軟件繪圖和數(shù)據(jù)分析。用Duncan法進行差異顯著性檢驗。不同小寫字母代表組間有顯著差異(P< 0.05)。表1

2 結(jié)果與分析

2.1 HcALDH7B4的生物信息學

研究表明,鹽穗木HcALDH7B4蛋白的理論等電點為5.91,理論分子量為55kD。該蛋白多肽鏈中疏水性氨基酸多于親水性氨基酸,HcALDH7B4屬于疏水性蛋白。HcALDH7B4蛋白具有ALDH家族典型的NAD結(jié)合位點、四聚體界面、催化殘基,HcALDH7B4是ALDH基因超家族的一員。圖1

注:A、B分別為HcALDH7B4蛋白的疏水性分析和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

HcALDH7B4與擬南芥AtALDH7B4在同一分支且有較高的氨基酸序列相似性,HcALDH7B4與擬南芥AtALDH7B4在耐鹽抗旱方面有相似的功能。圖2

注:HcALDH7B4由紅色顯示

2.2 鹽旱脅迫下鹽穗木HcALDH7B4基因的表達模式

研究表明,HcALDH7B4基因在鹽旱脅迫后被顯著誘導(dǎo)。600 mmol/L NaCl處理48 h時HcALDH7B4的表達量最高。自然干旱脅迫下,隨著脅迫時間的延長,HcALDH7B4基因的表達逐漸增加,30 d時表達量最為顯著。圖3

注:不同濃度的NaCl脅迫(A);600 mmol/L NaCl脅迫(B);不同時期的干旱脅迫(C)

2.3 融合蛋白的鑒定與誘導(dǎo)表達

研究表明,將鑒定正確的原核表達載體pET28a和重組質(zhì)粒pET28a-HcALDH7B4分別轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,12%SDS-PAGE電泳檢測,在44～66 kDa有一條差異表達條帶,構(gòu)建原核表達載體正確。在55～70 kDa有一條明顯的特異性條帶,HcALDH7B4蛋白被準確表達。取超聲處理后菌體上清及沉淀進行蛋白可溶性檢測。包涵體是目的蛋白存在的主要形式。圖4

注: A: SDS-PAGE鑒定。M: 蛋白分子量Marker;1,3,5: 重組菌誘導(dǎo)前;2,4,6: 重組菌誘導(dǎo)后;7: 對照菌誘導(dǎo)前;8: 對照菌誘導(dǎo)后。B: Western blot分析。1,2,3: 重組菌誘導(dǎo)前;4,5,6: 重組菌誘導(dǎo)后。Total: 細胞總粗蛋白;Ins: 不溶性蛋白質(zhì);Sol: 可溶性蛋白

2.4 重組菌株的鹽旱耐受性

研究表明,重組菌與對照菌在菌落數(shù)方面沒有明顯差異;相較對照菌,重組菌株在500 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、500、800mmol/L Mannitol脅迫下有更多的菌落數(shù)。正常情況下,重組菌和對照菌生長沒有差異,20 h后基本達到平穩(wěn)期,脅迫條件下,兩者菌體生長量均有顯著差異,并且對照菌的生長受到明顯脅迫抑制。HcALDH7B4的表達可正向調(diào)節(jié)大腸桿菌在鹽旱脅迫下的生長。圖5,圖6

圖5 重組大腸桿菌菌株的鹽旱抗性

注:(A) 對照;(B) 500 mmol/L NaCl脅迫;(C) 500 mmol/L KCl脅迫;(D) 500 mmol/L Mannitol脅迫;(E) 800 mmmol/L Mannitol脅迫

3 討 論

3.1醛脫氫酶(ALDHs)是一個進化保守的氧化還原酶超家族,將大量的醛轉(zhuǎn)化為羧酸來緩解毒害。前期對ALDH家族在非生物脅迫上的功能研究主要集中在模式植物擬南芥[13]、玉米[14,15]、水稻[16]中,而對鹽生植物中該蛋白家族的研究較少。

3.2前期研究證實ALDH7家族基因在各種非生物脅迫下被顯著誘導(dǎo),并參與植物對非生物脅迫的響應(yīng)。在鹽、旱以及ABA等其他非生物脅迫下,大豆GmALDH7B1[17]、水稻OsALDH7[18]和高粱SbALDH7B2[19]基因的表達顯著上調(diào),ALDH7基因參與了植物對多種非生物脅迫的響應(yīng)。與HcALDH7B4聚為一類的擬南芥AtALDH7B4在脫水、高鹽、H2O2或ABA處理后在葉和根中也被強烈誘導(dǎo)[20],且在轉(zhuǎn)基因植物中可提高其鹽旱耐性。試驗中HcALDH7B4在鹽旱脅迫下也被顯著誘導(dǎo)。HcALDH7B4可能有助于植物響應(yīng)鹽旱脅迫。

3.3研究結(jié)果表明,鹽穗木HcALDH7B4基因的原核表達增強了大腸桿菌的鹽旱耐性。與Gautam等[21]的結(jié)果相一致,油菜BrALDH7B2的過表達也使大腸桿菌和酵母在鹽脅迫和氧化脅迫下有更好的適應(yīng)和生存能力,且過表達BrALDH7B2可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[22]。鹽穗木HcALDH7B4很有可能也在植物的非生物脅迫中發(fā)揮正向的調(diào)控作用。HcALDH7B4是一個脅迫應(yīng)答基因,其原核表達可以提高大腸桿菌鹽旱耐性。進一步通過植物轉(zhuǎn)基因方式提高作物的非生物抗性后,有望作為候選基因提高作物和林木的耐鹽和抗旱性。

4 結(jié) 論

根據(jù)鹽穗木HcALDH7B4基因在600 mmol/L NaCl和自然干旱脅迫下不同時間點的表達量,鹽穗木HcALDH7B4基因在鹽旱脅迫下被顯著誘導(dǎo);相較對照菌,500 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、500、800 mmol/L Manntiol脅迫下重組菌的菌落大小和生長活力更優(yōu)。原核表達HcALDH7B4能夠提高大腸桿菌的鹽旱抗性。