陽(yáng) 妮,瑪依拉·玉素音,楊延龍,李春平,張大偉,徐海江,賴成霞

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花在種植過(guò)程中易遭受黃萎病的侵害,隨著大面積種植、連作年限的延長(zhǎng)等原因,導(dǎo)致棉花黃萎病病害愈加嚴(yán)重,給棉花生產(chǎn)造成損失[1]。棉花黃萎病(CottonVerticilliumWilt,CVW)主要是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的1種嚴(yán)重的土傳真菌病害,侵染棉花主要表現(xiàn)為黃化狀和枯斑狀[2]。該病原菌的遺傳穩(wěn)定,潛伏期長(zhǎng),普通化學(xué)防治很難根除,在加上其具有豐富的變異性,同一病菌可能造成植株呈現(xiàn)相同、相似、或不同的表征,給黃萎病診斷和防治帶來(lái)難度[3]。植物在面對(duì)病原菌侵染時(shí),會(huì)產(chǎn)生某些與防御相關(guān)的代謝物質(zhì)來(lái)抵御病原菌侵入,植物病癥的形成與植物體內(nèi)代謝物的變化有關(guān),這些代謝物質(zhì)不僅是植物基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)表達(dá)的最終的產(chǎn)物,也是植物病癥形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5]。因此,研究棉花黃萎病病癥中的相關(guān)代謝物質(zhì)變化,對(duì)于防治棉花黃萎病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物揮發(fā)物物質(zhì)(volatile organic compounds,VOCs)是植物與病原菌互作過(guò)程中的重要代謝物,大致分為脂肪酸衍生物、芳香族化合物、單萜和倍半萜類物質(zhì)[6]。當(dāng)植物受到病原菌侵害時(shí),植物能通過(guò)改變揮發(fā)物的種類和數(shù)量上來(lái)抵御病原菌入侵,如油菜揮發(fā)物中的二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫醚(DMTS)和異硫氰酸烯丙酯(AITC)對(duì)三七根腐病菌均有抑菌活性,且濃度不同抑菌率也不同[7];在柑橘中揮發(fā)性的檸檬烯能抵御指狀青霉菌、單胞桿菌等病原菌的入侵[8];綠葉揮發(fā)物中的(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛等物質(zhì)能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗真菌蛋白、植物抗毒素來(lái)抵御病原菌的侵染[9]。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)技術(shù)因具有較高的分辨率和較高的靈敏度,已成為研究揮發(fā)性代謝物的主要技術(shù)[10]。例如Batovska等[11]采用GC-MS技術(shù)比較了不同抗性葡萄葉片的代謝組分差異,獲得了抑制白粉病菌、霜霉病菌及灰霉病菌的16種抗性代謝物。McCartney等[12]利用GC-MS技術(shù)對(duì)杜鵑花與雷公藤疫霉(Phytophthoraramorum)病原菌互作進(jìn)行研究,檢測(cè)出78種揮發(fā)性化合物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在棉花與黃萎病互作的研究中,僅有李社增等[13]通過(guò)液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)技術(shù)獲得了一些與棉花黃萎病病程相關(guān)的代謝產(chǎn)物,如咖啡酸、紫云英苷、異紫云英苷、五椏果素等,而目前基于GC-MS技術(shù)上研究棉花中黃萎病不同病癥的揮發(fā)性成分差異還未見(jiàn)報(bào)道。棉花在抵御病原菌入侵過(guò)程中,會(huì)發(fā)生大幅度的生理生化代謝及表型變化,而目前棉花對(duì)黃萎病的防御相關(guān)物質(zhì)研究成果仍然不足以解析病癥變化的機(jī)制。需研究黃萎病病原菌與棉花互作過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)的變化。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME),結(jié)合GC-MS技術(shù),檢測(cè)分析棉花植株健康葉片、黃化狀和枯斑狀病葉中的揮發(fā)性物質(zhì)變化,研究與病癥差異相關(guān)的主要揮發(fā)性物質(zhì),為棉花抗黃萎病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品種

供試棉花品種新陸早75號(hào),健康葉片、枯斑狀病片和黃化狀病葉采自新疆沙灣市不同試驗(yàn)棉田的不同棉花植株,每個(gè)樣本采集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于代謝組學(xué)分析。取樣后葉片樣品用含水脫脂棉包裹葉柄并放入10℃的保鮮盒內(nèi),迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SPME支架和65 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷纖維(DVB/CAR/PDMS)萃取頭購(gòu)自Supelco(美國(guó)Supelco公司); GC/MS-2020NX氣質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取0.4 g棉花葉片,并分割成0.5 cm的小塊狀迅速放入 30 mL萃取瓶中,瓶蓋用鋁蓋和封口膜進(jìn)行密封。萃取頭250℃老化30 min后,將萃取頭插入萃取瓶的2/3處,31℃條件下萃取30 min,之后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口內(nèi),進(jìn)行GC-MS分析,每份樣品重復(fù)3次。

1.2.2 揮發(fā)性成分

參照Qiu等[14]的方法進(jìn)行揮發(fā)性成分的提取和分析,并做適當(dāng)改動(dòng)。具體條件如下,色譜柱:SH-Rtx-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛細(xì)管色譜柱;色譜柱初始溫度35℃,保留5 min,按照4℃/min升溫至60℃,再以3℃/min升溫至180℃,然后以4℃/min升溫至240℃,保留5 min;載氣:高純氦氣;色譜柱流量:1 mL/min;分流,分流比6∶1,溶劑延遲0.5 min;接口溫度:240℃。質(zhì)譜條件:離子源為EI源,溫度200℃,電子能量70 eV,采集方式為scan,質(zhì)譜掃描范圍:35～350 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將樣品總離子流色譜圖中色譜峰的質(zhì)譜圖逐一與NIST 17譜庫(kù)進(jìn)行檢索匹配,并對(duì)代謝物進(jìn)行定性分析。采用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法判別(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA);通過(guò)SPSS 22進(jìn)行t檢驗(yàn)(Student’st-test);根據(jù)PLS-DA模型獲得的變量重要性投影(variable importance in project,VIP)值(闕值﹥1)和t檢驗(yàn)的P值(闕值﹤0.05)來(lái)篩選差異化合物,并采用Excel 2010和GraphPad Prism 9制作差異化合物的柱狀圖;韋恩圖和條形圖通過(guò)在線數(shù)據(jù)分析https://www.omicshare.com完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同病癥葉片的揮發(fā)性成分及含量變化

研究表明,與健康葉片相比,黃化狀病葉葉色失綠變淺呈黃色,病葉邊緣和主脈間出現(xiàn)黃色斑塊,枯斑狀病葉病斑色澤加深,變黃褐色,病葉邊緣上卷,但主脈及其附近的葉肉仍保持綠色。各類葉片的質(zhì)譜譜圖,與NIST17質(zhì)譜庫(kù)檢索,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)搜索查詢,共鑒定出158種揮發(fā)性化合物,其中醇21種、綠葉揮發(fā)物9種、萜烯類49種、烷烴類16種、酯類38種、芳香烴類5種、醛類13種、其他類8種。不同病癥葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其中健康葉片檢測(cè)到的化合物總數(shù)為104種、枯斑狀病葉為112種、黃化狀病葉為54種,且黃化狀病葉中未檢測(cè)到芳香烴類物質(zhì)?？莅郀畈∪~中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對(duì)含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉。在所有化合物類別中,萜烯類和綠葉揮發(fā)物的比例最大,健康葉片、黃化狀病葉和枯斑狀病葉的萜烯類物質(zhì)占比分別為35.04%,62.61%和42.31%,其中香柑油烯、(E)-β-金合歡烯、(+)-苜蓿烯、別香橙烯、欖香烯、萜品油烯、E-11,13-十四二烯和長(zhǎng)葉烯-(V4)只存在于枯斑病葉中;綠葉揮發(fā)物在健康葉片、黃化狀病葉和枯斑狀病葉中的占比為54.58%、29.73%和46.78%,其中3-己烯醛是枯斑病葉中的特有成分;醇類化合物在健康葉片、黃化狀和枯斑狀病葉占比分別為5.27%、3.64%、4.40%,十氫化萘-2-醇只存在于黃化狀病葉中,枯斑病葉中包含了5種特有成分,以松香芹醇含量最高;而烷烴類、醛類、酯類、芳香烴類、其他類的含量較低,均在4%以下,健康葉片含量最高的化合物是水楊酸甲酯,且此物質(zhì)未在病葉中未檢出,黃化狀病葉和枯斑病葉含量較高的是β-苯丙氨酸。圖1,表1

表1 不同病癥葉片的揮發(fā)性成分及含量變化

注:CK:健康葉片,Y:黃化狀病葉,K:枯斑狀病葉。下同

2.2 主成分分析與偏最小二乘法判別

研究表明,3組樣本中PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為50.3%、24.9%,其中CK組、K組、Y組分別位于第一、二、四象限上,組間化合物分離趨勢(shì)明顯且組內(nèi)生物重復(fù)性好,3組間化合物有較大差異。使用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)表明,組內(nèi)數(shù)據(jù)重復(fù)性好,3組樣品的區(qū)分效果非常明顯,具有明顯不同的代謝特征。圖2

注:A:PCA分析圖;B:PLS-DA分析圖。

2.3 差異化合物篩選

研究表明,設(shè)定條件為VIP >1.0,且P<0.05。K和CK間存在61種差異化合物(23種上調(diào)/39種下調(diào)),主要包括12種醇類、20種萜烯類、13種酯類、6種烷烴類、3種醛類、1種綠葉揮發(fā)物,2種芳香烴類和4種其他類物質(zhì)。Y和CK間存在24種差異化合物(14種上調(diào)/10種下調(diào)),包含醇類2種、萜烯類14種、酯類5種和烷烴類3種;K和Y共有差異化合物26種(19種上調(diào)/7種下調(diào)),包含3種醇類、10種萜烯類、6種酯類、3種烷烴類、2種醛類、1種綠葉揮發(fā)物和1種其他類物質(zhì)。圖3

圖3 不同病癥葉片的差異化合物篩選

2.4 不同病癥葉片的差異化合物變化

研究表明,化合物β-蒎烯在3個(gè)比較組間均發(fā)生了差異變化,其中K組、Y組與CK組相比分別上調(diào)了2.33、3.97,而K組與Y組相比下調(diào)了1.65。與CK相比,K組和Y組中有5個(gè)共有化合物發(fā)生差異變化,其中角鯊烯、坎烯、(E)-2-丁酸己烯酯在病癥葉片中顯著下調(diào),香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇顯著上調(diào),且這些化合物在Y組中的變化更大。K組與Y組的相比,有13個(gè)差異化合物與K組相連,其中以(Z)-2-丁酸己烯酯倍數(shù)變化最大,上調(diào)3.76,5個(gè)差異化合物與Y組相連,倍數(shù)變化最大化合物是(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,下調(diào)3.03,7個(gè)化合物發(fā)生特有表達(dá),其中(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和正十六烷均顯著上調(diào),且變化倍數(shù)均大于2。圖4

注:A: 差異化合物韋恩圖;B-D: 差異化合物條形圖,紅色代表上調(diào),藍(lán)色代表下調(diào)

3 討 論

SPME是一種集萃取、濃縮、進(jìn)樣等功能為一體的檢測(cè)方法,靈敏性高且操作簡(jiǎn)單,被應(yīng)用于提取各類樣品,如甘薯[15]、西洋參[16],同樣也被用于植物-病原菌互作中揮發(fā)性物質(zhì)的提取,如Chen等[17]采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,從豆根內(nèi)生真菌ETR-B22中共鑒定出了32種揮發(fā)性有機(jī)化合物,其中鄰氨基甲酸甲酯、水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯等表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性。研究利用SPME-GC-MS技術(shù),從3組樣品中獲得了包括醇類,綠葉揮發(fā)物、萜烯類、烷烴類、酯類,芳香烴類和醛類在內(nèi)的158種揮發(fā)性化合物,SPME應(yīng)用于揮發(fā)性物質(zhì)提取是可行的。鄭雪芳等[18]采用GC-MS法對(duì)青枯菌菌株侵染后的番茄進(jìn)行了化合物分析,檢測(cè)到的化合物種類主要有萜烯類、醇類、酯類和烷烴類,且致病性不同的菌株化合物數(shù)量也不同。研究在不同病癥葉片中也檢測(cè)出不同數(shù)量的化合物,其中健康葉片的化合物總數(shù)為104種、枯斑狀病葉為112種、黃化狀病葉為54種,病癥葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其差異主要集中于萜烯類、酯類化合物上。各類別物質(zhì)的相對(duì)含量變化反映了寄主植物對(duì)病原菌的響應(yīng),ROBISON等[19]利用UPLC-MS和GC-MS研究發(fā)現(xiàn)感染核盤(pán)菌后,抗性大豆品種中的萜烯類含量增加,而酯類、氨基酸及糖類減少。在研究中,健康葉片和病癥葉片中各類別物質(zhì)含量差別明顯,可能是導(dǎo)致了病葉呈枯斑和黃化狀的重要原因。其中枯斑狀病葉中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對(duì)含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉。

在大麗輪枝菌與棉花互作中,包括半棉酚、棉酚、半棉酚酮在內(nèi)的萜類物質(zhì)和酚類物質(zhì)是棉花抗病工作過(guò)程中的重點(diǎn)之[20]。研究從枯斑狀病葉、黃斑狀病葉分別篩選到了61、24個(gè)差異化合物,通過(guò)對(duì)比比較,從兩個(gè)病癥葉片中篩選到了6種共有差異化合物,主要為萜烯類、酯類等物質(zhì),這些類別物質(zhì)可能是棉花抗黃萎病過(guò)程中的重要代謝組分。其中β-蒎烯更是在病癥葉片中顯著上調(diào),且在黃化狀病葉中的表達(dá)倍數(shù)大于枯癍病葉,其作為萜烯類中的重要物質(zhì),在植物抗逆過(guò)程中起重要作用[21]。高全等[22]研究顯示草果揮發(fā)油中發(fā)揮抑菌作用的主要活性成分為β-蒎烯;張美紅等[23]在研究葉同樣證實(shí)了β-蒎烯可顯著抑制柑橘青霉菌生長(zhǎng)繁殖,抑菌作用的大小與其濃度正相關(guān)。在枯斑狀病葉與黃化狀病片比較中發(fā)現(xiàn)了(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和十六烷等差異化合物均發(fā)生顯著的倍數(shù)變化。(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯已被證實(shí)是棉花抗逆過(guò)程中具有揮發(fā)性質(zhì)的間接防御物質(zhì)[24]。智亞楠等[25]曾在研究中證實(shí)了(Z)-3-己酸己烯酯對(duì)茶樹(shù)輪斑病菌具有抑制能力,其熏蒸抑制率可達(dá)到27%。(Z)-3-己烯基乙酸酯是綠葉揮發(fā)物重要成分,在增強(qiáng)小麥對(duì)禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的防御能力、提高馬鈴薯對(duì)晚疫病的抗病能力等生物脅迫方面發(fā)揮作用[26-27]。γ-依蘭油烯已被鑒定是果實(shí)精油中的主要成分,具有良好的抗生物膜活性和抑制病原菌粘附的性質(zhì)[28]。以上鑒定出的揮發(fā)性化合物在大麗輪枝菌與棉花互作相關(guān)文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,可能為新發(fā)現(xiàn)的棉花與病原菌互作過(guò)程中相關(guān)化合物,這些化合物的含量差異是病癥葉片呈現(xiàn)不同表型的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

4.1枯斑型葉片與黃化型葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其差異主要集中于萜烯類、酯類化合物上,其中枯斑病葉的萜烯類、酯類化合物分別有37種、26種,而黃化狀病葉為24種、8種。枯斑狀病葉中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對(duì)含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉?？莅卟∪~以綠葉揮發(fā)物(46.78%)的相對(duì)含量最高,黃化狀病葉以萜烯類(62.61%)最高,且黃化狀病葉無(wú)芳香烴類物質(zhì)。

4.2與健康葉片相比,β-蒎烯、(E)-2-丁酸己烯酯、坎烯、角鯊烯、香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇均在病癥葉片顯著富集,且在黃化狀病葉的變化倍數(shù)大于枯斑病葉。枯斑病葉與黃化狀病葉相比,(Z)-2-丁酸己烯酯,(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和正十六烷均發(fā)生了顯著性倍數(shù)變化,差異化合物是黃萎病菌與棉花互作的結(jié)果,是病癥葉片呈現(xiàn)不同表型的關(guān)鍵。