劉佳佳,韓 濤

(1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所,烏魯木齊 830011;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】石榴營養(yǎng)價(jià)值豐富,包括維生素、蛋白質(zhì)、脂肪以及多種微量元素,且石榴皮瓤提取物含有大量的多酚類化合物。鞣花酸(Ellagic acid)是一種分布在石榴皮瓤中的多酚類化合物,其生物學(xué)功能體現(xiàn)在機(jī)體抗氧化和抗炎癥作用[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明[2],多酚類化合物可以改善動(dòng)物健康。Amor Antonio J等[3]研究顯示,鞣花酸具有顯著的抗氧化作用,能夠減緩機(jī)體衰老。Hassan Fawzia A等[4]研究表明,石榴皮瓤提取物具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的作用,可以提高機(jī)體免疫功能,有利于動(dòng)物健康,且石榴皮瓤提取物是很有前景的天然抗氧化劑的來源?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】石榴皮瓤提取物與飼料中抗生素類添加劑相比沒有副作用,且一定程度上能夠提高動(dòng)物生長性能和增強(qiáng)免疫力[5]。尚需研究石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠體重、血漿抗氧化和促炎因子水平的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以成年小鼠為研究對(duì)象,灌喂石榴皮瓤提取物,研究石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠體重增長及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響,為研究鞣花酸調(diào)控機(jī)體抗氧化和抗炎的機(jī)制及生物學(xué)作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)選擇平均日齡50 d、體重相近(37.31±5.57)g、健康良好的SPF級(jí)雄性昆明小鼠30只,購自新疆醫(yī)科大學(xué)。

在第21 d,所有試驗(yàn)小鼠斷尾采血,將血樣收集于肝素鈉抗凝管內(nèi),室溫靜置10 min后3 500 r/min離心15 min,吸取上清,-20℃冷凍保存。同一個(gè)重復(fù)組3只小鼠的樣品合為1個(gè)樣品,即每個(gè)組最終5個(gè)樣品,用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 方 法

1.2.1 石榴皮瓤中鞣花酸提取

在市場(chǎng)上購買新疆和田皮亞曼新鮮石榴,石榴去除籽實(shí)后剩余的皮瓤晾干后超微粉碎,用于提取鞣花酸。鞣花酸提取參考陳鵬等[6]方法。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)小鼠,隨機(jī)分為2組,分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3只,共15只。在相同基礎(chǔ)日糧條件下試驗(yàn)組小鼠灌喂1.5 g/(d·只)石榴皮瓤粗提物[即鞣花酸的灌喂量為40.74 mg/(d·只)],將1.5 g提取物溶解于2 mL無菌蒸餾水中,分別在每天10:00和18:00分兩次灌喂,每次灌喂1 mL,對(duì)照組每次灌喂等體積的無菌蒸餾水,進(jìn)行為期21 d的灌喂試驗(yàn)。每周測(cè)定1次小鼠的平均采食量,試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天小鼠晨飼前空腹稱量體重,尾部采集小鼠血樣并制取血漿,-20℃冷凍保存,待測(cè)。表1

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(以風(fēng)干物質(zhì)計(jì),%)

1.2.3 測(cè)定鞣花酸含量

鞣花酸測(cè)定的色譜分析條件:色譜柱為C18(Welch Ultimate AQ-C18,4.6×250 mm,5 μm);流動(dòng)相的配制:分別量取甲醇∶水∶冰乙酸按50∶49.85∶0.15(V/V/V)的比例混合,用0.45 μm濾膜抽濾,超聲脫氣30 min;檢測(cè)波長:254 nm,柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μL。鞣花酸的平均含量為(27.16±5.26) mg/g(風(fēng)干重)。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)

常規(guī)指標(biāo):總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)和尿素氮(BUN);抗氧化相關(guān)指標(biāo):超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽氧化物酶(GSH-PX)、抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子活力、總抗氧化能力(T-AOC)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA);炎癥因子相關(guān)指標(biāo):腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-17(IL-17A)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)。所有指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,方法參考試劑盒提供的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Excel中先將數(shù)據(jù)預(yù)處理,再使用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮瓤中鞣花酸含量的測(cè)定

研究表明,石榴皮瓤中提取的鞣花酸平均含量為(27.16±5.26) mg/g(風(fēng)干重),自然風(fēng)干基礎(chǔ)上鞣花酸的有效含量為2.72%。

2.2 石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠體重增長影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠日均采食量和初始重均無顯著影響(P>0.05)。能夠顯著提高試驗(yàn)組小鼠末重、總增重及平均日增重,分別比對(duì)照組提高了8.21%(P<0.05)、47.56%(P<0.05)和48.39%(P<0.05)。表2

表2 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠體重增長變化(n=15)

2.3 石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠血漿常規(guī)指標(biāo)影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠血漿中總蛋白、白蛋白、球蛋白以及尿素氮均無顯著影響(P>0.05),但能提高血漿中總蛋白、白蛋白和球蛋白含量,能夠降低血漿中尿素氮的含量,比對(duì)照組低了33.48%(P>0.05)。表3

表3 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血漿常規(guī)指標(biāo)變化(n=15)

2.4 石榴皮瓤提取物對(duì)小鼠血漿抗氧化水平影響

研究表明,灌喂石榴皮瓤提取物能夠顯著提高試驗(yàn)組小鼠血漿SOD、CAT和T-AOC的水平,分別比對(duì)照組提高了24.44%(P<0.05)、54.82%(P<0.05)和27.69%(P<0.05),對(duì)GSH-PX活力無顯著性影響(P>0.05);極顯著提高了試驗(yàn)組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活力,分別比對(duì)照組提高了36.01%(P<0.01)和43.21%(P<0.01);顯著降低了試驗(yàn)組小鼠血漿MDA的濃度,比對(duì)照組降低了25.82%(P<0.05);能夠提高血漿中NO的水平,但差異不顯著(P>0.05)。表4

表4 灌喂石榴皮瓤提取物下小鼠血漿抗氧化水平變化(n=15)

2.5 對(duì)血漿炎癥因子水平影響

研究表明,石榴皮瓤提取物能夠顯著降低試驗(yàn)組小鼠血漿中TNF-α和IL-17A的水平,分別比對(duì)照組降低了17.16%(P<0.05)和30.34%(P<0.05);對(duì)IL-10的水平無顯著性影響(P>0.05)。表5

表5 石榴皮瓤提取物下小鼠血漿炎癥相關(guān)指標(biāo)水平變化(n=15)

3 討 論

3.1鞣花酸是一種天然多酚類化合物,廣泛存在于各種堅(jiān)果、軟果等植物組織(如草莓、覆盆子、黑莓、石榴、葡萄、核桃)中[7]。鞣花酸通常與葡萄糖等縮合成糖苷,進(jìn)而參與鞣花單寧酚類化合物的形成,進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后先水解形成鞣花酸,大部分被腸道微生物代謝為尿石素[8]。鞣花酸具有廣泛的生物學(xué)作用,包括抗氧化、抗腫瘤、抗突變及抗炎等[9]。補(bǔ)喂鞣花酸能夠促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育,與鞣花酸能夠改善機(jī)體消化機(jī)能、促進(jìn)腸道健康有關(guān)[10-11]。趙銘偉等[12]研究顯示,仔豬基礎(chǔ)日糧中添加鞣花酸(500 g/d),能夠顯著促進(jìn)仔豬的體重增長。陳暉等[13]研究顯示,灌喂石榴汁使SD大鼠體重和日增重比對(duì)照組提高了8.88%和36.32%(P<0.05)。試驗(yàn)中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,能夠顯著提高試驗(yàn)組小鼠末重、總增重及平均日增重,與趙銘偉等[12]和陳暉等[13]研究結(jié)果一致,鞣花酸對(duì)促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育方面具有一定作用。體重的增加是因?yàn)槿占Z中蛋白質(zhì)沉積率提高,還是改變了生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)量及激素的水平所致,有待于進(jìn)一步研究。

3.2血漿白蛋白作為營養(yǎng)物質(zhì)的載體,可維持機(jī)體滲透壓[14];血漿球蛋白由漿細(xì)胞分泌,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防止病毒和細(xì)菌入侵等作用[15]。周本宏等[16]研究發(fā)現(xiàn),石榴皮鞣質(zhì)對(duì)阿霉素腎病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用,能夠顯著改善血漿TP以及ALB水平。在試驗(yàn)中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物,血漿中TP、ALB以及GLB水平都呈升高趨勢(shì),說明鞣花酸在一定程度上參與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝,改善機(jī)體血漿中總TP、ALB以及GLB水平,維持機(jī)體健康[16]。BUN濃度的高低可直接反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸的平衡狀況[17]。日糧中粗蛋白質(zhì)含量充足,氨基酸種類和比例均衡時(shí),機(jī)體蛋白質(zhì)、氨基酸的利用率提高,BUN含量就會(huì)降低[18]。試驗(yàn)中,灌喂石榴皮瓤提取物的小鼠血漿中BUN呈下降趨勢(shì)。石榴皮瓤提取物的灌喂能夠促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝,平衡氨基酸的水平[19-20]。

3.3氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基與抗氧化防御系統(tǒng)失衡的一種生物學(xué)現(xiàn)象[21]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平或器官脂質(zhì)過氧化的程度[15]。Qiu等[22]通過測(cè)量膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)的ROS水平、MDA水平和SOD活性來驗(yàn)證鞣花酸和尿石素A的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)鞣花酸和尿石素A均可降低H2O2誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞中的ROS和MDA水平,并增加了SOD的活性,尿石素A與其前體鞣花酸均可緩解T24細(xì)胞的氧化應(yīng)激。駱靜方等[23]研究發(fā)現(xiàn),給糖尿病小鼠補(bǔ)喂鞣花酸后,其血漿中SOD活性升高、MDA含量顯著降低。陳敏純等[24]研究鞣花酸對(duì)缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用結(jié)果顯示,給予小鼠鞣花酸藥物處理后,MAD含量顯著降低并且能夠顯著增加SOD的活性。試驗(yàn)中,灌喂石榴皮瓤提取物極顯著提高了試驗(yàn)組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活性,顯著提高了試驗(yàn)組小鼠血漿中SOD活性、CAT以及T-AOC的水平,顯著降低了試驗(yàn)組小鼠血漿MDA的濃度,鞣花酸可以增強(qiáng)小鼠清除自由基以及機(jī)體抗氧化的能力。鞣花酸的生物學(xué)作用主要依賴腸道微生物代謝產(chǎn)生的尿石素[25]。尿石素是由鞣花酸失去一個(gè)內(nèi)酯環(huán),并逐步脫羥基而生成的[26],其保留了一定的抗氧化能力。鞣花酸及其衍生物的抗氧化效率與酚羥基數(shù)目有關(guān)[27],鞣花酸打開一個(gè)內(nèi)酯環(huán)脫去羧基生成尿石素D,尿石素D通過脫去1,2或3個(gè)羥基分別生成尿石素C,尿石素A或尿石素B[28]。在氧化自由基吸收能力(ORAC)抗氧化指數(shù)試驗(yàn)中與抗壞血酸相比,尿石素A是尿石素類中抗氧化能力最強(qiáng)大的代謝產(chǎn)物[29]。線粒體自噬可通過調(diào)控線粒體的分裂與融合以清除功能受損的線粒體并抑制ROS的過量積累,對(duì)預(yù)防氧化損傷具有重要作用[30]。研究表明,短期的尿石素A處理可能會(huì)誘導(dǎo)線粒體自噬,維持線粒體呼吸功能,而長期尿石素A處理有助于促進(jìn)線粒體生物合成[31]。試驗(yàn)中小鼠清除自由基以及機(jī)體抗氧化能力的提升,一方面可能與鞣花酸及其代謝產(chǎn)生的尿石素具有降低MDA含量、降低ROS、RNS水平以及提高SOD、CAT、GSH活性有關(guān),另一方面鞣花酸及其代謝產(chǎn)生的尿石素激活了參與自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵酶AMP激活的蛋白激酶 α(AMPK α)以及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的蛋白激酶1(PINK-1)[32],誘導(dǎo)線粒體自噬,并清除功能受損的線粒體以及抑制ROS的過量積累,從而提高了小鼠的抗氧化能力。

3.4多酚類化合物抗炎的生物學(xué)作用在人和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)[7]。繆?？〉萚32]研究發(fā)現(xiàn),在核桃多酚中,在機(jī)體內(nèi)通過抑制TNF-α以及IL-6等相關(guān)炎癥因子的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)。肖玉欣等[7]研究表明,鞣花酸抗炎活性主要表現(xiàn)為降低MCP-1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平以及降低細(xì)胞遷移與粘附。鞣花酸抗炎活性主要表現(xiàn)為降低機(jī)體相關(guān)炎癥因子的表達(dá)以及降低細(xì)胞遷移與黏附。Marin等[33]驗(yàn)證了鞣花酸在急性和慢性潰瘍性結(jié)腸炎中的抗炎作用,鞣花酸能夠降低IL-6和TNF-α的分泌。鞣花酸的生物學(xué)作用的發(fā)揮主要依靠腸道微生物將其代謝為尿石素[7]。在動(dòng)物模型中,尿石素對(duì)于小鼠足水腫具有急性抗炎作用[34],并且尿石素可減少小鼠全身性炎癥因子的產(chǎn)生(IL-6,TNF-α)[35]。IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)早期啟動(dòng)因子,可以促進(jìn)T細(xì)胞的激活和刺激細(xì)胞黏附分子,從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生[36]。試驗(yàn)中,給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物能夠顯著降低試驗(yàn)組小鼠血漿中TNF-α和IL-17A的水平,鞣花酸具有促進(jìn)炎癥因子分泌,抑制炎癥因子表達(dá)的作用?？赡芘c鞣花酸能夠降低調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子的表達(dá)與含量有關(guān),如TNF-α和IL-10,同時(shí)可能由于鞣花酸能夠減弱成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及單核細(xì)胞的黏附[37],從而抑制炎癥反應(yīng),具體的調(diào)控路徑和潛在的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究表明。

4 結(jié) 論

給小鼠灌喂石榴皮瓤提取物可顯著提高小鼠末重、總增重及平均日增重,促進(jìn)小鼠生長發(fā)育;可極顯著提高試驗(yàn)組小鼠血漿中抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子活力;顯著提高SOD、CAT以及T-AOC水平;顯著降低MDA、TNF-α和IL-17A的水平。鞣花酸具有提高小鼠抗氧化以及緩解炎癥的作用。