李偉,王嘉豪,劉均,馬永強(qiáng)

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院,哈爾濱 150028;2.東莞市永益食品有限公司,廣東 東莞 523106)

二氧化硫是一種無(wú)色、有刺激性氣味的氣體,其存在形式或前體有單質(zhì)硫、焦亞硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸等。二氧化硫類(lèi)添加劑在食品和中草藥中使用較廣泛,限量?jī)?nèi)的二氧化硫具有防腐、抗氧化、漂白等功能[1-2],但添加過(guò)量將嚴(yán)重影響身體健康[3]。因此,建立準(zhǔn)確的二氧化硫定量方法十分必要。我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.34—2016采用滴定法,其原理是利用碘的標(biāo)液氧化亞硫酸根。需要注意的是,定量的前提是定性,如果分析方法本身的選擇性不強(qiáng),比如化學(xué)滴定法,就會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)誤差。

異硫氰酸酯(ITCs)是一類(lèi)具有辛辣刺激性味道的風(fēng)味物質(zhì),天然存在于十字花科植物中,如辣根、芥末、山葵等,主成分為異硫氰酸烯丙酯(AITC)[4-5]。以其為原料制成的青芥辣、芥末油、辣根粉等調(diào)味品常見(jiàn)于大眾飲食中。質(zhì)檢部門(mén)在對(duì)含異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品的二氧化硫殘留檢測(cè)(GB 5009.34—2016)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象,而事實(shí)上廠家并未使用二氧化硫類(lèi)添加劑。針對(duì)此問(wèn)題,我們對(duì)可能的影響因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

青芥辣、辣根粉和芥末油:購(gòu)于超市。

1.2 試劑

異硫氰酸烯丙酯(含量>99%):滕州瑞元香料有限公司;0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào):20210927H):北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;1 000 mg/L硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào):210860):水利部水環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)研究中心。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SP756型紫外可見(jiàn)吸收光譜儀 上海光譜儀器有限公司;GC7890-MS5975氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;Metrohm 883離子色譜儀 瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司;ZNCL智能數(shù)顯磁力電熱套 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;PDMS固相微萃取頭 美國(guó)Supelco公司。

1.4 方法

1.4.1 異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品中ITCs含量的測(cè)定[6]

以異硫氰酸烯丙酯(AITC)作為標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)樣品中異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)的含量。

標(biāo)液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:母液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取 0.050 0 g AITC溶于正己烷中,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容,得到濃度為1.000 mg/mL的AITC溶液。依次移取母液20,40,60,80,100 μL于10 mL容量瓶中,用正己烷稀釋定容,得到20,40,60,80,100 μg/mL的AITC標(biāo)準(zhǔn)溶液。紫外光譜掃描:確定最大吸收波長(zhǎng)249 nm。采用光度掃描方式,按濃度由低到高測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值,平行測(cè)試2次,按吸光度-濃度關(guān)系制作AITC的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品處理與測(cè)試:稱(chēng)取約0.20 g樣品于燒杯中,加入3 mL蒸餾水后攪拌均勻,用5 mL正己烷萃取2次,合并后依次用蒸餾水、飽和氯化鈉溶液洗滌,經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容,待測(cè)。

1.4.2 異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品中二氧化硫殘留量的測(cè)定[7]

根據(jù)ITCs含量高、中、低選取3份青芥辣樣品以及辣根粉和芥末油各1份。按照國(guó)標(biāo)方法操作,首先,組裝儀器,連接500 mL蒸餾瓶與蛇形冷凝管,其下端出口接上硅膠管,并插入錐形瓶?jī)?nèi)的醋酸鉛溶液中,保證裝置的氣密性。然后稱(chēng)取樣品約5.00 g,青芥辣樣品用水少量多次溶解、攪拌分散后轉(zhuǎn)入蒸餾瓶?jī)?nèi),辣根粉稱(chēng)量后直接轉(zhuǎn)入蒸餾瓶?jī)?nèi),芥末油樣品稱(chēng)量后,用水少量多次沖洗稱(chēng)量舟,蒸餾瓶?jī)?nèi)每份樣品加入蒸餾水總計(jì)250 mL,安裝蛇形冷凝管,為避免蒸餾瓶底部過(guò)熱導(dǎo)致樣品糊底,蒸餾過(guò)程中采用磁力攪拌,待樣品攪拌2 min后迅速加入10 mL鹽酸(6 mol/L),蓋好瓶塞,開(kāi)啟加熱功能。蒸餾時(shí)間約2 h,蒸餾液達(dá)到約200 mL后,放下錐形瓶,繼續(xù)蒸餾1 min,用蒸餾水沖洗硅膠管插入溶液部分。最后進(jìn)行滴定操作,迅速向錐形瓶?jī)?nèi)加入10 mL鹽酸、1 mL淀粉溶液(1%),搖勻后立即用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色,維持30 s不褪色即為終點(diǎn),記錄讀數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行2次。

二氧化硫含量按下式計(jì)算:

式中:X表示樣品中二氧化硫含量,mg/kg;V表示滴定樣品所用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V0表示空白實(shí)驗(yàn)所用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;m表示稱(chēng)取樣品質(zhì)量,g;c表示碘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L;0.032表示1 mL碘標(biāo)準(zhǔn)溶液[c(1/2 I2)=1.0 mol/L]相當(dāng)于二氧化硫的質(zhì)量,g。

1.4.3 異硫氰酸烯丙酯(AITC)在國(guó)標(biāo)條件下的對(duì)照實(shí)驗(yàn)

以AITC標(biāo)準(zhǔn)品作為研究對(duì)象,分別稱(chēng)取兩組30,50 μL的AITC標(biāo)準(zhǔn)品,按“2.2”中方法進(jìn)行操作分析。

聞喜被稱(chēng)為“花饃之鄉(xiāng)”，制作花饃歷史悠久，作為一項(xiàng)與勞動(dòng)人民生活中產(chǎn)生的藝術(shù)，已有1000多年的歷史了，從先秦時(shí)期就有有關(guān)記載，最早是用來(lái)祭祀的，人們把它做成豬、牛、羊等動(dòng)物的模樣來(lái)祭祀祖先。因聞喜花饃技藝獨(dú)特、歷史悠久，在2006年與定襄面塑、焙面面塑、新絳面塑共同作為山西面塑藝術(shù)入選省級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄；2008年以其獨(dú)有的食用、觀賞、禮儀功能，作為傳統(tǒng)美術(shù)—面花的成員被列為第二批國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，這些都是對(duì)聞喜花饃的肯定和鼓勵(lì)。

1.4.4 異硫氰酸烯丙酯(AITC)在酸性條件下水解產(chǎn)物的分析

取一支20 mL的頂空樣品瓶,依次加入磁子、10 mL蒸餾水、50 μL AITC和2 mL鹽酸,壓好膠墊和蓋子,磁力加熱攪拌1 h。冷卻至約50 ℃,維持溫度恒定,插入活化好的固相微萃取針頭,靜態(tài)吸附10 min,然后用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行分析。

儀器測(cè)試條件:氣相色譜(GC):彈性石英毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),載氣(He)流量1 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃,分流比30∶1。程序升溫:柱溫60 ℃保持1 min,然后以10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min。質(zhì)譜(MS):EI離子源溫度230 ℃,質(zhì)量掃描范圍28～550 u,四極桿溫度150 ℃,電離電壓70 eV。采用NIST 14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配對(duì)照定性分析,面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。

1.4.5 離子色譜法檢測(cè)二氧化硫殘留量

操作步驟同上,稱(chēng)取樣品約10 g,為避免亞硫酸根被氧化,冷凝管下端插入250 mL容量瓶?jī)?nèi)的吸收液中,瓶?jī)?nèi)盛有50 mL的3%雙氧水、5%抗壞血酸溶液或者淋洗液作為吸收液。蒸餾時(shí)間約2 h后,取下容量瓶,沖洗硅膠管,用蒸餾水定容。取約5 mL蒸餾液經(jīng)C18固相萃取小柱純化后,再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)行離子色譜儀的上樣分析。

淋洗液配制:稱(chēng)取0.339 2 g Na2CO3和0.084 0 g NaHCO3溶解后轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中,加入50 mL丙酮試劑,加入去離子水定容,得到3.2 mmol/L Na2CO3+1.0 mmol/L NaHCO3+5%丙酮的淋洗液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:移取100 μg/mL的硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液10,50,100,500,1 000 μL至10 mL容量瓶中,稀釋定容后得到0.10,0.50,1.00,5.00,10.0 μg/mL的硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液。

二氧化硫(SO2)含量按下式計(jì)算:

式中:X表示樣品中二氧化硫含量,mg/kg;C表示樣品餾出液中硫酸根(SO42-)濃度,μg/mL;V表示蒸餾定容體積,mL;m表示稱(chēng)取樣品質(zhì)量,g;0.667表示SO42-換算成SO2的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品中ITCs含量的比較

圖1 異硫氰酸烯丙酯(AITC)的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of allyl isothiocyanate (AITC)

圖2 異硫氰酸烯丙酯(AITC)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of allyl isothiocyanate (AITC)

對(duì)在售的10個(gè)品牌的青芥辣醬及2個(gè)品牌的辣根粉進(jìn)行了異硫氰酸酯類(lèi)化合物(ITCs)含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同品牌、類(lèi)別調(diào)味品中異硫氰酸烯丙酯(ITCs)含量Table 1 Content of isothiocyanates (ITCs) in different brands and types of condiments

青芥辣的ITCs含量大約在1%,含量越高,其味道越濃烈,如1#和2#樣品,而ITCs含量較低的3種青芥辣產(chǎn)品——3#、7#、10#,均為日本進(jìn)口產(chǎn)品,其ITCs含量低于0.3%。相比之下,用于制作青芥辣的辣根粉原料——11#、12#,其ITCs含量低于國(guó)產(chǎn)青芥辣,而高于進(jìn)口青芥辣,這一數(shù)據(jù)表明國(guó)產(chǎn)青芥辣產(chǎn)品中存在不同程度的人工合成異硫氰酸烯丙酯(AITC)的添加。

2.2 異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品中二氧化硫殘留量的測(cè)定

按照ITCs含量的多少,選取了鳳球嘜、川珍和金印3個(gè)品牌的青芥辣,以及金葵辣根粉作為研究對(duì)象。在蒸餾冷凝開(kāi)始后,插入醋酸鉛吸收液的乳膠管附近開(kāi)始生成黑色沉淀,溶液呈現(xiàn)棕褐色,但觀察不到亞硫酸鉛應(yīng)有的白色,ITCs含量越高,這種現(xiàn)象越明顯。蒸餾結(jié)束后,錐形瓶?jī)?nèi)溶液氣味嗆鼻,上層浮有油狀物,應(yīng)為ITCs,加入鹽酸后沉淀大部分溶解,溶液呈輕微棕褐色,滴定完成后,瓶?jī)?nèi)留有少量不溶性黑色沉淀。滴定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2,結(jié)果顯示大部分產(chǎn)品的二氧化硫殘留量超標(biāo)。排除二氧化硫類(lèi)添加劑的使用,推測(cè)產(chǎn)品中唯一的含硫化合物ITCs可能在蒸餾階段發(fā)生酸性水解反應(yīng),其產(chǎn)物或ITCs參與了滴定階段與碘標(biāo)液的反應(yīng)。

表2 含異硫氰酸酯類(lèi)化合物(ITCs)調(diào)味品中二氧化硫含量(GB 5009.34—2016)Table 2 Content of sulfur dioxide in the condiments containing isothiocyanates (ITCs) (GB 5009.34—2016)

2.3 異硫氰酸烯丙酯(AITC)在國(guó)標(biāo)條件下的對(duì)照實(shí)驗(yàn)

以AITC替代樣品做對(duì)照實(shí)驗(yàn),蒸餾和滴定過(guò)程的現(xiàn)象與前述相同,說(shuō)明AITC在蒸餾過(guò)程中發(fā)生了變化,滴定數(shù)據(jù)結(jié)果表明,碘標(biāo)液的消耗體積與AITC用量成正比關(guān)系(見(jiàn)表3)。另外,在使用碘標(biāo)液滴定AITC的水溶液時(shí),沒(méi)有觀察到明顯變化,說(shuō)明碘單質(zhì)不能氧化AITC,因此初步判斷ITCs在蒸餾階段發(fā)生了水解反應(yīng),而水解產(chǎn)物影響了后續(xù)的滴定過(guò)程。

表3 異硫氰酸烯丙酯(AITC)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)Table 3 Controlled experiment of allyl isothiocyanate (AITC)

表4 異硫氰酸烯丙酯(AITC)水解液的揮發(fā)性成分鑒定Table 4 Identification of volatile components in allyl isothiocyanate (AITC) hydrolysate

2.4 異硫氰酸烯丙酯(AITC)在酸性條件下水解產(chǎn)物的分析

酸性條件下水解后的AITC體系,可以明顯嗅到臭雞蛋氣味,推測(cè)國(guó)標(biāo)滴定法中的黑色沉淀可能是硫化鉛,初步判斷生成了硫化氫,在AITC水解產(chǎn)物的總離子流色譜圖中共檢測(cè)到23個(gè)組分,鑒定出16個(gè)成分,見(jiàn)圖3。

圖3 異硫氰酸烯丙酯(AITC)水解的揮發(fā)性產(chǎn)物總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile products of allyl isothiocyanate (AITC) hydrolysis

由圖4可知,色譜峰1的質(zhì)譜圖的檢索匹配度較低。通過(guò)對(duì)離子碎片的分析,認(rèn)為應(yīng)該是一個(gè)混合物,質(zhì)荷比(m/z)39,41,42的碎片有可能是由環(huán)丙烷分子裂解產(chǎn)生的,而環(huán)丙烷可能來(lái)自異硫氰酸烯丙酯分子的烯丙基部分關(guān)環(huán)。質(zhì)荷比(m/z)60的碎片比較特殊,排除環(huán)丙烷分子的碎片,與其相關(guān)的離子并不多,極有可能來(lái)自硫化羰分子(SCO),而空氣中的氮?dú)?、二氧化碳、氧氣的分子離子峰恰好與硫化羰分子(SCO)的碎片[CO]+、[CS]+、[S]+對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比(m/z)28,44,32相同,造成干擾。因此,結(jié)合譜圖的特征,判斷(m/z)60是硫化羰的分子離子峰[SCO]+。

圖4 色譜峰1的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of chromatographic peak 1

硫化羰也具有類(lèi)似硫化氫的臭雞蛋氣味,遇水不穩(wěn)定,可產(chǎn)生硫化氫[8],這也證實(shí)了蒸餾法中的沉淀是硫化鉛,在加酸后溶解生成硫化氫,被碘標(biāo)液氧化滴定,客觀上造成了二氧化硫殘留量的誤差。由于樣品基質(zhì)造成二氧化硫殘留量異常的情況已有報(bào)道,但多為猜測(cè)而缺少直接證據(jù)[9-10]。除了硫化羰、二硫化碳和烯丙基硫醇外,烯丙基硫醚和硫雜環(huán)類(lèi)是AITC水解的主要產(chǎn)物,烯丙基硫醚類(lèi)化合物也是大蒜的特征風(fēng)味物質(zhì)[11],多硫醚和多硫雜環(huán)類(lèi)化合物體現(xiàn)了硫原子在反應(yīng)中容易失去,尤其是檢測(cè)到以單質(zhì)硫形式存在的環(huán)己硫烷說(shuō)明了這一點(diǎn)?？傊?在酸性水溶液、加熱條件下,AITC會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)。

從理論上分析,對(duì)于AITC含量為1%的樣品,如果取樣5 g,則含 50 mg的AITC,物質(zhì)的量約為5×10-4mol,假設(shè)AITC全部轉(zhuǎn)化為硫化羰,則將消耗濃度為0.001 mol/L的碘標(biāo)液(1/2 I2)500 mL,說(shuō)明0.2%的AITC轉(zhuǎn)化為硫化羰會(huì)導(dǎo)致國(guó)標(biāo)滴定法檢測(cè)的二氧化硫殘留量超標(biāo)。

2.5 離子色譜法檢測(cè)二氧化硫殘留值

要證明二氧化硫檢測(cè)的假陽(yáng)性,蒸餾液中是否存在亞硫酸根(SO32-)是一個(gè)很好的判斷依據(jù),因此用離子色譜對(duì)蒸餾液進(jìn)行分析。首先對(duì)SO32-和硫酸根(SO42-)的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,低濃度的淋洗液和丙酮的加入有助于二者的分開(kāi),見(jiàn)圖5。嘗試用抗壞血酸溶液保護(hù)SO32-,效果一般,仍出現(xiàn)SO42-,考慮到SO32-的特殊性,用雙氧水將SO32-氧化成SO42-作為檢測(cè)對(duì)象,但雙氧水對(duì)SO42-出峰有干擾,因此使用堿性的淋洗液作為吸收液,將SO42-作為檢測(cè)目標(biāo)。若有SO32-,用碘標(biāo)液將其氧化成SO42-再分析,見(jiàn)圖6。

圖5 SO32-與 SO42-的離子色譜圖Fig.5 Iron chromatograms of SO32- and SO42-

圖6 碘標(biāo)液氧化前后的樣品蒸餾液的離子色譜圖Fig.6 Iron chromatograms of sample distillate before and after oxidation of iodine standard solution

得到硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.127 31C+0.012 94,回歸系數(shù)R2=0.999 8,見(jiàn)圖7。在對(duì)青芥辣產(chǎn)品1#、3#、5#,辣根粉11#和芥末油12#的蒸餾液分析中,在1#、5#青芥辣以及12#芥末油中檢測(cè)到二氧化硫殘留量,其測(cè)定數(shù)值遠(yuǎn)小于前面的滴定法,3#和11#樣品的SO42-色譜峰峰面積小于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度值0.1 μg/mL對(duì)應(yīng)的峰面積0.041 (μS/cm)·min,由公式推算其二氧化硫含量小于2 mg/kg,遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)50 mg/kg(見(jiàn)表5),這與GB 5009.34—2016滴定法的結(jié)果差別非常大,這也驗(yàn)證了AITC對(duì)滴定法確實(shí)存在影響。

表5 離子色譜法檢測(cè)的二氧化硫含量Table 5 Content of sulfur dioxide detected by iron chromatography method

圖7 硫酸根(SO42-)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of sulfate (SO42-)

3 結(jié)論

青芥辣中的異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)含量普遍高于原料辣根粉,國(guó)產(chǎn)青芥辣中存在不同程度的人工合成異硫氰酸烯丙酯(AITC)的添加。應(yīng)用GB 5009.34—2016滴定法檢測(cè)含異硫氰酸酯類(lèi)(ITCs)調(diào)味品中二氧化硫殘留量時(shí),會(huì)出現(xiàn)超標(biāo)結(jié)果。對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)AITC影響了測(cè)定結(jié)果,AITC的水解產(chǎn)物分析進(jìn)一步表明,水解中生成了硫化羰,導(dǎo)致生成硫化氫,被醋酸鉛溶液吸收后,與碘標(biāo)液發(fā)生反應(yīng),造成二氧化硫檢出值偏高。離子色譜法的測(cè)定結(jié)果表明樣品中二氧化硫殘留量遠(yuǎn)低于GB 5009.34—2016滴定法測(cè)定值和國(guó)標(biāo)限量值。GB 5009.34—2016滴定法存在兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題;一是空氣氛下蒸餾,二氧化硫極易被氧化,造成負(fù)誤差;二是樣品中若存在其他能被碘單質(zhì)氧化的化合物,或者蒸餾中生成能夠被碘單質(zhì)氧化的化合物,都會(huì)造成測(cè)量值的正誤差。在本研究開(kāi)展過(guò)程中,國(guó)家衛(wèi)生健康委頒布了新的食品二氧化硫測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.34—2022,并定于2022年12月30日實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)采用充氮蒸餾、酸堿滴定的方法[12]。