劉琳琳,楊楊,范婧,邊鑫,馬春敏,郭曉雪,石彥國,張娜

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院,哈爾濱 150070)

蛋白質中的自由氨基與多糖中的羧基通過共價鍵形成“蛋白質-多糖偶聯(lián)物”,該接枝反應在保留蛋白質與多糖初始性能的同時,還可進一步提高蛋白質的功能特性[7],蛋白質是兩親性分子,常用來作為乳化劑和穩(wěn)定劑,為此大量學者探究糖基化反應對蛋白乳化性的影響,Zhang等[8]以小麥蛋白與葡聚糖進行糖基化反應,發(fā)現(xiàn)蛋白的乳化性有所提高,并將其作為脂肪替代品應用于蛋糕中。Li等[9]用乳清分離蛋白與半乳糖生成的糖基化乳清分離蛋白制成的乳液顯示出較好的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性,并有增強消化的效果。因此,糖基化在提高蛋白質乳化性方面發(fā)揮了重要作用。

因此,本研究利用干熱法糖基化反應,以不同質量比的SPI和葡聚糖生成不同接枝度的糖基化蛋白,控制一定的反應溫度、濕度及時間,通過測定接枝程度、紅外光譜、內源熒光光譜、表面疏水性指數(shù),探究不同質量比下發(fā)生糖基化反應后蛋白質出現(xiàn)的結構變化,以及糖基化反應對SPI乳化活性與乳化穩(wěn)定性的影響,為擴大蛋白質作為乳化劑在調味品行業(yè)的應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI):哈高科大豆食品有限責任公司;葡聚糖T10:上海源葉生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇:北京索萊寶科技有限公司;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS):北京百靈威科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HWS-50B恒溫恒濕培養(yǎng)箱 天津市宏諾儀器有限公司;LAMBDA紅外光譜儀 珀金埃爾默股份有限公司;紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;UV5100B高速均質乳化機 上海滬析實業(yè)有限公司;F97Pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖基化大豆蛋白的制備

配制4 g/dL的SPI溶液和1 g/dL的葡聚糖溶液,攪拌一段時間至樣品完全水合,將SPI與葡聚糖分別按照1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0的質量比進行復配,經過1 h的攪拌處理,置于-20 ℃冷凍保存,利用冷凍干燥機凍干48 h成粉備用。為獲得美拉德前期反應產物,將凍干后的粉末置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中反應,控制溫度與相對濕度分別為60 ℃和79%,反應24 h后于4 ℃下保存[10]。

1.3.2 接枝度的測定

比較(1)式與(2)式不難看出，鋼纖維的含量特征值的變化對鋼纖維再生混凝土的軸心抗拉強度和劈裂抗拉強度的增強效果不同，鋼纖維對劈裂抗拉強度的增強效果大于對軸心抗拉強度的增強作用。其原因可能是在劈裂抗拉時，受荷端的劈裂面上的鋼纖維承受壓剪兩個方向的作用，相當于對劈拉區(qū)施加了約束，形成了邊壁效應，隨著鋼纖維含量特征值的增大，邊壁效應的約束作用也同時增大，使得鋼纖維再生混凝土的劈裂抗拉強度遠大于軸心抗拉強度；而在鋼纖維再生混凝土軸心受拉時，鋼纖維只受拉力作用，因此軸心抗拉強度增長值沒有劈裂抗拉強度增長值明顯。

對于糖基化蛋白接枝程度的考察參照Sun等[11]的方法并稍加改動,采用OPA法進行測定,首先配制50 mL OPA溶液,稱取40 mg OPA溶于1 mL甲醇溶液中,加入5 g/mL的SDS溶液2.5 mL、0.1 mol/L的硼砂溶液25 mL、β-巰基乙醇100 μL,用蒸餾水定容至50 mL。試管中加入4 mL配制好的OPA溶液與200 μL 2 mg/mL的糖基化蛋白溶液,混勻后置于35 ℃水浴鍋中溫浴2 min,于340 nm處測定其吸光值A1,空白對照為添加200 μL蒸餾水的OPA試劑,二者吸光值的差值ΔA為自由氨基的凈吸光值,接枝度(DG)按照公式(1)進行計算:

DG(%)=(A0-A1)/A0×100。

(1)

1.3.3 紅外光譜掃描

參照Yang等[12]的方法并稍作修改,通過傅里葉紅外掃描圖譜表征糖基化反應前后蛋白質分子的二級結構,稱取糖基化反應前后的蛋白1 mg,與溴化鉀按1∶150的質量比混合后于研缽中研磨成粉,壓制成薄片,在4 000～400 cm-1波數(shù)內掃描32次,記錄蛋白的紅外圖譜。

1.3.4 內源熒光光譜掃描

參考Chen等[13]的方法掃描樣品的內源熒光光譜,配制糖基化前后的蛋白溶液濃度為1 mg/mL,設置狹縫寬度為5 nm,使蛋白溶液于280 nm波長處激發(fā),掃描其在300～500 nm波長下的發(fā)射光譜,記錄蛋白的內源熒光光譜。

1.3.5 表面疏水性指數(shù)的測定

糖基化產物表面疏水性指數(shù)的測定參照Mu等[14]的方法并稍加改動,配制濃度為2 mg/mL的蛋白樣品溶液,梯度稀釋制作曲線,分別稀釋至0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL。試管中倒入4 mL待測樣品溶液,加入8 mmol/L的ANS 20 μL后混合均勻,使用熒光分光光度計于15 min內對樣品熒光強度進行測定。設定狹縫寬度為5 nm,使待測樣品在390 nm波長下激發(fā),掃描其在300～600 nm波長內的發(fā)射光譜,糖基化蛋白質的表面疏水性指數(shù)可由曲線初始階段的斜率表示。

1.3.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

乳化性的測定參照Zhang等[15]的方法并稍作修改,量取15 mL 2 mg/mL糖基化前后的大豆蛋白溶液與5 mL大豆油混合,室溫下用高速均質乳化機以11 000 g將溶液均質2 min,立即在容器底部取100 μL勻漿,與5 mL 0.1% SDS溶液充分混合,空白對照即為0.1% SDS溶液,測定500 nm波長下的吸光值A0;均質后靜置30 min,于同一位置取100 μL勻漿,與5 mL 0.1% SDS溶液充分混合,空白對照仍為0.1% SDS溶液,于500 nm波長下測定吸光值A30。乳化活性指數(shù)(EAI)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)分別按照公式(2)、公式(3)進行計算。

(2)

(3)

式中:n為稀釋倍數(shù);C為形成乳液前的蛋白質濃度(g/mL);φ為乳狀液中油相的體積分數(shù)。

1.4 數(shù)據處理

每組實驗重復3次,所得數(shù)據使用Origin 2018軟件進行繪圖分析,采用IBM SPSS Statistics 26軟件對實驗所得數(shù)據進行方差分析,P<0.05代表具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 糖基化產物接枝度分析

SPI與葡聚糖之間發(fā)生的干熱糖基化反應屬于美拉德反應的前期反應,接枝度是評價糖基化程度的重要指標。由圖1可知,葡聚糖添加量的增加致使接枝程度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,蛋白與糖的質量比由1∶0.5增大至1∶2.5,接枝度從26.32%增大到42.68%,這說明蛋白質與葡聚糖分子之間接觸的面積增加,體系中參與接枝反應的活性基團增多,SPI中自由氨基可與葡聚糖分子上更多的羰基發(fā)生共價結合,促進反應的發(fā)生[16]。魏晨[17]以不同質量比的木糖與卵白蛋白發(fā)生濕熱美拉德反應,研究表明不同的質量比會影響糖基化反應的接枝度,糖占比增大時反應體系中活性位點接觸機會增加,促進反應發(fā)生,與本文得到的結果相似。當?shù)鞍着c糖的質量比達到1∶3.0時,接枝度顯著下降至39.68%,可能的原因是糖占比過大,提高了體系的黏度,阻礙了分子間的接觸,而接枝后的SPI空間位阻增大,可能發(fā)生再聚集,使接枝度下降[18]。

圖1 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的接枝度Fig.1 Degree of grafting of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同。

2.2 糖基化產物二級結構分析

在1 200～800 cm-1波數(shù)范圍內,對碳水化合物來說,主要有C-H的彎曲方式及C-C和C-O的拉伸,呈現(xiàn)于圖譜中會有波峰產生,糖基化產物對該區(qū)域內的吸收強于天然SPI,說明葡聚糖附著于SPI上,二者之間發(fā)生了共價結合[20]。糖基化反應發(fā)生后,賴氨酸分子中的-NH2官能團可能發(fā)生丟失,而美拉德化合物(C-O)、吡嗪類(C-N)和席夫堿(C-N)的量增加,糖基化后的蛋白在碳水化合物區(qū)域有較強的吸收,由紅外圖譜(見圖2)可以看出共軛物于1 200～800 cm-1波長內出現(xiàn)了多個新的吸收峰,未經糖基化處理的SPI幾乎不存在吸收峰,表明在干熱美拉德反應期間,葡聚糖附著在SPI分子上,二者之間發(fā)生了共價結合。Zhou等[21]將不同分子量的葡聚糖與SPI按照1∶10的質量比發(fā)生糖基化反應,其紅外圖譜的結果與本實驗結果一致。

圖2 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.3 糖基化產物三級結構分析

SPI分子中的色氨酸殘基在280 nm波長下激發(fā)從而產生熒光,熒光光譜的變化可以用來反映色氨酸微環(huán)境的變化,當SPI與葡聚糖發(fā)生共價結合時,蛋白本身的結構發(fā)生變化,發(fā)色基團被掩埋從而導致熒光強度降低[22],由圖3中熒光光譜也可以看出,糖基化反應可以明顯降低SPI的熒光強度,Hu等在濕熱條件下制備了SPI與杏鮑菇多糖的美拉德偶聯(lián)物,其研究結果也出現(xiàn)了糖基化后蛋白的內源熒光強度低于天然SPI的類似現(xiàn)象[23]。糖基化產物的最強熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在340 nm左右的波長下,熒光強度隨糖占比的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,當?shù)鞍着c糖的質量比為1∶2.0時熒光值為75.16,僅次于天然蛋白的89.03,最大發(fā)射波長發(fā)生小程度的藍移且峰強度有所減弱,表明糖基化反應對SPI的結構有一定影響,部分色氨酸參與了糖基化反應,而接入的葡聚糖鏈分子過多,遮蔽了蛋白本身的發(fā)射強度,造成峰強度有所降低;同時酪氨酸與色氨酸之間可能會發(fā)生疏水相互作用,在蛋白內部形成疏水環(huán)境,致使最大發(fā)射波長出現(xiàn)藍移的現(xiàn)象。

圖3 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的內源熒光光譜圖Fig.3 Endogenous fluorescence spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.4 糖基化產物表面疏水特性

ANS熒光探針用于測定糖基化反應前后SPI的表面疏水特性,ANS熒光探針中含有的磺酸基團帶有負電,可以與蛋白質中帶正電的氨基酸(如賴氨酸等)發(fā)生結合,使用熒光分光光度計掃描時可發(fā)射出熒光強度,通過測定樣品的熒光強度可計算出蛋白質的表面疏水性指數(shù),見圖4。

圖4 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

對糖基化反應前后的SPI進行外源熒光強度的測定并利用線性關系計算得到其表面疏水性指數(shù),由圖4結合ANS熒光光譜圖(見圖5)可知,天然SPI的表面疏水性指數(shù)為64.01,而經過糖基化反應后,大量親水性羥基引入體系中,增大了體系的親水性,與天然SPI對比來看,糖基化處理后的蛋白質表面疏水性指數(shù)出現(xiàn)顯著降低的現(xiàn)象,有提高蛋白質溶解度的可能性[24]。Qu等[25]采用傳統(tǒng)和超聲輔助濕熱法制備了油菜籽分離蛋白(RPI)與葡聚糖偶聯(lián)物,得到了類似的結果,與RPI相比,糖基化反應降低了偶聯(lián)物的表面疏水性,由此說明,葡聚糖的接枝反應對SPI的表面疏水性有較強的遮蔽效果,降低了SPI的表面疏水性。可以觀察到隨著糖占比的增大,復合體系的表面疏水性呈現(xiàn)上升的趨勢,可能是因為經過糖基化后的蛋白質,其結構部分伸展,內部疏水基團部分暴露;當?shù)鞍着c糖比例達到1∶2.0時,其表面疏水指數(shù)達到最高,為34.28,繼續(xù)增大糖的占比時,可能會因多糖鏈的遮蔽作用而使表面疏水指數(shù)略有降低[26]。

圖5 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的ANS熒光光譜圖Fig.5 ANS fluorescence spectrograms of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

2.5 糖基化蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析

乳化活性指數(shù)(EAI)與乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)可以反映出蛋白質形成及穩(wěn)定乳化體系的能力,可用于衡量蛋白質的乳化性[27]。由圖6可知,天然SPI的乳化活性為75.14 m2/g,當?shù)鞍着c糖的質量比達到1∶0.5時,乳化活性增大至92.07 m2/g,此時由于接枝反應的發(fā)生,蛋白質的球狀結構部分伸展,暴露內部的疏水基團,增強蛋白的表面活性,有利于油滴的分散,保持了更好的乳化性[28];隨著葡聚糖占比的增加,雖然蛋白質與糖的接觸面積進一步增大,糖基化反應逐漸加強,但葡聚糖的過多加入會使體系中引入大量親水基團,破壞了水油的界面平衡,因此受空間位阻的影響可能會導致乳化性與天然蛋白相比有下降的趨勢。乳化穩(wěn)定性更多受放置時油水界面形成的保護膜的穩(wěn)定性的影響[29],天然SPI的乳化穩(wěn)定性為22.55%,經過糖基化反應后的蛋白,其乳化穩(wěn)定性均高于天然蛋白,說明多糖的黏附性有利于乳化穩(wěn)定性的增強。過量糖的加入對乳化性不利,但對于乳化穩(wěn)定性來說卻是有利的[30]。

圖6 SPI與葡聚糖在不同質量比下糖基化產物的乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)Fig.6 Emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI) of glycosylated products at different mass ratios of SPI to dextran

3 結論

文章探究了SPI與葡聚糖的質量比不同時發(fā)生糖基化反應后蛋白質結構及乳化性的改變,結果表明糖基化反應的發(fā)生使蛋白質的二級結構和三級結構改變,葡聚糖接枝到SPI上,導致蛋白表面親水性基團增多,降低了蛋白的表面疏水性。當SPI與葡聚糖的質量比為1∶2.0時,蛋白質結構改變最大,疏水基團暴露最多,乳化穩(wěn)定性最高;當SPI與葡聚糖的質量比為1∶0.5時,蛋白的乳化性最好,綜上所述,改變葡聚糖的添加量對糖基化產物的結構以及乳化性有不同影響,而蛋白質功能性質的改善對食品工業(yè)有重要影響,本研究可為糖基化大豆分離蛋白相關產品在新型乳液、脂肪替代品、生物活性載體等方面的開發(fā)提供科學指導。