木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因調(diào)控琯溪蜜柚汁胞?；难芯?/h1>
2023-09-10 09:49劉鹿寧趙秋月葛聰田志嬌周曉俐阮翥龍莊木來(lái)李延王平
果樹(shù)學(xué)報(bào) 2023年3期 關(guān)鍵詞：酶活性
劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來(lái) 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，以揭示汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機(jī)制。【方法】選取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個(gè)時(shí)期的琯溪蜜柚果實(shí)，測(cè)定汁胞?；始澳举|(zhì)素含量以及分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的木質(zhì)素生物合成途徑關(guān)鍵基因的差異表達(dá)和相關(guān)酶活性變化，并進(jìn)行汁胞細(xì)胞壁木質(zhì)素沉積的顯微觀察?！窘Y(jié)果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實(shí)發(fā)育成熟期，木質(zhì)素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個(gè)基因的表達(dá)量都顯著增強(qiáng)，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。這期間果實(shí)汁胞?；黠@加速，木質(zhì)素合成相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過(guò)氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質(zhì)素含量顯著積累，番紅染色顯示木質(zhì)素在蜜柚汁胞細(xì)胞壁中明顯沉積。【結(jié)論】琯溪蜜柚木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因參與調(diào)控汁胞?；^(guò)程中細(xì)胞壁木質(zhì)素的合成。研究結(jié)果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞粒化；基因調(diào)控；酶活性；木質(zhì)素合成
中圖分類(lèi)號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹(shù)，是福建省平和縣乃至全國(guó)具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞?；瘒?yán)重影響到了果實(shí)的生產(chǎn)和銷(xiāo)售，對(duì)琯溪蜜柚的口碑和相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了沖擊，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)民帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失。
琯溪蜜柚成熟過(guò)程中的汁胞?；且环N生理病害，將?；c正常汁胞比較，發(fā)現(xiàn)?；兏伞⒆冇?，呈現(xiàn)渾濁的絮狀物。汁胞?；瘜?duì)果實(shí)汁胞的外觀、質(zhì)地和風(fēng)味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過(guò)觀察琯溪蜜柚汁胞細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)，認(rèn)為汁胞粒化是汁胞細(xì)胞次生壁木質(zhì)化形成厚壁組織的結(jié)果。潘騰飛等[4]的研究發(fā)現(xiàn)琯溪蜜柚汁胞?；笖?shù)與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|(zhì)素合成關(guān)系密切。木質(zhì)素是沉積在植物細(xì)胞壁中的酚類(lèi)聚合物，主要有3 種類(lèi)型[5]，分別是由香豆醇合成的對(duì)羥基苯基木質(zhì)素（H型）、由松伯醇合成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質(zhì)素（S 型）[6]?，g溪蜜柚?；邪l(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素主要為G型木質(zhì)素[7]。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過(guò)氧化物酶（POD）等和木質(zhì)素合成直接相關(guān)[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質(zhì)素含量相關(guān)[9]。目前，對(duì)琯溪蜜柚汁胞粒化與木質(zhì)素代謝關(guān)系的報(bào)道多為對(duì)木質(zhì)素代謝途徑中個(gè)別基因家族的分析或木質(zhì)素相關(guān)合成酶活性對(duì)木質(zhì)素含量的影響，關(guān)于琯溪蜜柚汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素代謝途徑的系列關(guān)鍵基因表達(dá)變化與汁胞粒化關(guān)系的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對(duì)此展開(kāi)系統(tǒng)研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；F(xiàn)象通常發(fā)生在果實(shí)成熟和采后的貯藏過(guò)程中，有關(guān)采后貯藏汁胞粒化的研究較多，但對(duì)成熟果實(shí)的汁胞粒化研究較少。筆者在本研究中以不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組篩選差異表達(dá)的木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因分析相關(guān)酶活性和木質(zhì)素含量、?；实淖兓?，以期揭示琯溪蜜柚汁胞粒化過(guò)程的生理與分子調(diào)控機(jī)制。
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)材料
琯溪蜜柚果實(shí)樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗(yàn)站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹(shù)齡、樹(shù)勢(shì)一致的健壯樹(shù)體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個(gè)時(shí)期分別隨機(jī)采集大小一致、健康、無(wú)明顯機(jī)械外傷的果實(shí)各9 個(gè)立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行果實(shí)?；实臏y(cè)定和果實(shí)汁胞石蠟切片。每個(gè)時(shí)期每個(gè)果實(shí)各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的測(cè)定和qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。此外，每個(gè)果實(shí)各取約100 g 置于玻璃瓶?jī)?nèi)于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質(zhì)素含量測(cè)定。以上所有試驗(yàn)均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。
1.2 蜜柚果實(shí)?；?、汁胞木質(zhì)素含量測(cè)定
琯溪蜜柚果實(shí)粒化率測(cè)定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測(cè)定花后4個(gè)時(shí)期的粒化汁胞質(zhì)量和汁胞總質(zhì)量。果實(shí)?；?%=?；|(zhì)量/汁胞總質(zhì)量×100。琯溪蜜柚果實(shí)汁胞木質(zhì)素含量采用AB 法，即乙酰溴法測(cè)定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機(jī)切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹(shù)膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質(zhì)化的細(xì)胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達(dá)分析
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由深圳華大基因研究院完成，統(tǒng)計(jì)和評(píng)估轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量以及組裝效果。
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到基因的表達(dá)水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據(jù)4 個(gè)時(shí)期汁胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質(zhì)素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達(dá)基因。
1.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成差異基因引物設(shè)計(jì)
從轉(zhuǎn)錄組中篩選出13 個(gè)差異表達(dá)基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設(shè)計(jì)程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗(yàn)證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以琯溪蜜柚果實(shí)汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測(cè)定基因的表達(dá)量。
1.7 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性測(cè)定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測(cè)試劑盒（上海優(yōu)選）說(shuō)明對(duì)琯溪蜜柚果實(shí)汁胞進(jìn)行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測(cè)定其活性。
1.8 數(shù)據(jù)處理
采用2-△△Ct方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。利用WPS 表格進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（2019），SPSS 19.0 進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實(shí)?；始爸举|(zhì)素含量的變化
在琯溪蜜柚果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育期間，花后195 d之前的果實(shí)發(fā)育期未見(jiàn)汁胞粒化，但在花后195 d 之后的果實(shí)成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實(shí)的成熟，汁胞木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在花后195 和215 d 汁胞中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量顯著增加（圖1），這些結(jié)果說(shuō)明在蜜柚果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間，隨著木質(zhì)素的積累，果實(shí)汁胞?；室搽S之增加，果實(shí)汁胞?；赡苁悄举|(zhì)素含量過(guò)度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微觀察
對(duì)FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實(shí)汁胞進(jìn)行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內(nèi)部細(xì)胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花后135 和165 d 蜜柚果實(shí)汁胞顏色相似，無(wú)明顯紅色、無(wú)明顯顏色變化（圖2-A、B），說(shuō)明這兩個(gè)時(shí)期汁胞木質(zhì)素含量較低；花后195 d 汁胞內(nèi)部細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細(xì)胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無(wú)明顯變化，但此時(shí)汁胞已出現(xiàn)木質(zhì)化，木質(zhì)素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內(nèi)部細(xì)胞和外表皮層的細(xì)胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說(shuō)明在花后195 d 之后的果實(shí)成熟期汁胞細(xì)胞壁木質(zhì)化程度增加，木質(zhì)素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達(dá)分析
對(duì)4 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期琯溪蜜柚果實(shí)汁胞轉(zhuǎn)錄組17 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑中差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖分析（圖3），結(jié)果表明，其中1 個(gè)基因CrCCR1 和另外3 個(gè)基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達(dá)量與這2 個(gè)時(shí)期的木質(zhì)素含量的增加趨勢(shì)不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個(gè)基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育成熟進(jìn)程，在花后165、195 和215 d 差異表達(dá)（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達(dá)水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調(diào)了2 至9 倍，并且和木質(zhì)素含量的變化趨勢(shì)相一致。研究認(rèn)為這13 個(gè)基因可能是蜜柚汁胞木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因，因此篩選這13個(gè)基因用于后續(xù)的qRT-PCR驗(yàn)證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成差異基因qRT-PCR驗(yàn)證分析
對(duì)13 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑差異基因進(jìn)行qRT- PCR 驗(yàn)證（ 圖4）。隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個(gè)基因qRTPCR相對(duì)表達(dá)量都上調(diào)表達(dá)，尤其在花后195 至215 d 的果實(shí)成熟期顯著表達(dá)，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致，證明了這9 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。說(shuō)明花后195 至215 d 是蜜柚果實(shí)汁胞?；瘯r(shí)期。另外4 個(gè)基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)酶活性變化分析
分別對(duì)花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實(shí)汁胞中木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，酶活性隨著果實(shí)的發(fā)育成熟呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在花后215 d 達(dá)到峰值（圖5），與木質(zhì)素含量及粒化率的變化規(guī)律基本一致，表明這些酶可能在蜜柚果實(shí)發(fā)育成熟階段的汁胞木質(zhì)素生物合成途徑中起關(guān)鍵作用。
3 討論
木質(zhì)素是植物細(xì)胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產(chǎn)物。木質(zhì)素在果實(shí)汁胞中過(guò)量積累可能會(huì)導(dǎo)致汁胞?；瑫?huì)影響果實(shí)的口感和風(fēng)味，目前在收獲的柑橘果實(shí)中普遍存在汁胞?；@一現(xiàn)象[14]。前人有研究表明木質(zhì)素生物合成與汁胞?；g有著密切關(guān)聯(lián)，?；闹ǔ０l(fā)生木質(zhì)素過(guò)度積累的現(xiàn)象[15]，但總體研究還不夠完整和系統(tǒng)。因此，筆者在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和產(chǎn)物生成3 個(gè)水平展開(kāi)木質(zhì)素代謝與琯溪蜜柚汁胞?；瘷C(jī)制的系統(tǒng)研究。
果實(shí)中木質(zhì)素含量的變化與木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質(zhì)素的合成過(guò)程中起著極為重要的調(diào)控作用，且木質(zhì)素合成量與這些基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[16-17]。筆者在本研究中通過(guò)琯溪蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到17 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑的差異表達(dá)基因，其中13 個(gè)基因的表達(dá)量與汁胞?；始澳举|(zhì)素含量變化趨勢(shì)一致，且在花后195至215 d 顯著表達(dá)。qRT- PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個(gè)基因在蜜柚果實(shí)發(fā)育和成熟期的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果變化趨勢(shì)一致，均隨著果實(shí)的成熟呈顯著上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)相關(guān)酶活性也隨之增強(qiáng)，并與木質(zhì)素生物合成的增加及蜜柚汁胞?；厔?shì)相一致。這一研究結(jié)果表明以上9 個(gè)基因是蜜柚汁胞木質(zhì)素的合成調(diào)控的關(guān)鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞?；倪^(guò)程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它在木質(zhì)素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過(guò)對(duì)5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結(jié)果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達(dá)水平對(duì)梨果中石細(xì)胞和木質(zhì)素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉(zhuǎn)錄水平在木質(zhì)化組織（根和莖）中高于在木質(zhì)化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質(zhì)素含量及粒化率較高的成熟期果實(shí)中表達(dá)量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果及PAL 基因表達(dá)量一致，與汁胞?；室泊笾孪喾4H被證明參與了木質(zhì)素生物合成途徑中G 木質(zhì)素單體的產(chǎn)生[21]，小麥中發(fā)現(xiàn)C4H1 基因的表達(dá)與木質(zhì)素含量呈顯著相關(guān)[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進(jìn)木質(zhì)素的合成，導(dǎo)致竹筍組織木質(zhì)化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達(dá)量在成熟期顯著上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，C4H酶活性也隨著果實(shí)的發(fā)育成熟逐漸增強(qiáng)，并與汁胞中木質(zhì)素含量及粒化率變化相一致。4CL 是CCR 上游的一個(gè)酶，4CL 的產(chǎn)物是CCR 的底物，而CCR被認(rèn)為是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[24]。青稞研究中發(fā)現(xiàn)4CL是影響木質(zhì)素合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，4CL活性的提高可以增強(qiáng)莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與qRT-PCR 結(jié)果顯示隨著木質(zhì)素含量的增加及汁胞粒化率的上升，Cr4CL 在蜜柚成熟過(guò)程中也逐漸上調(diào)表達(dá)，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達(dá)相一致，這也與芹菜發(fā)育階段的觀察結(jié)果相似[26]。前人在梨果實(shí)中木質(zhì)素合成的有關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達(dá)趨勢(shì)與果核細(xì)胞的積累和木質(zhì)素含量相關(guān)[27]，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrCCR3 在汁胞中的表達(dá)趨勢(shì)也與木質(zhì)素含量、?；首兓厔?shì)相一致。此外，催化肉桂醛轉(zhuǎn)化為肉桂醇[28]，參與單體木質(zhì)素生物合成最后一步的另一個(gè)關(guān)鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質(zhì)素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因番茄植株中木質(zhì)素的沉積，木質(zhì)素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應(yīng)上升，且與木質(zhì)素含量、木質(zhì)素合成酶基因CrCAD3 的表達(dá)以及?；氏嘁恢?。POD則通過(guò)聚合單體木質(zhì)素催化松柏醇發(fā)生脫氫聚合反應(yīng)形成G 型木質(zhì)素[33]。有報(bào)道對(duì)白樺POD 全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質(zhì)部中高度表達(dá)[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達(dá)水平與木質(zhì)素積累模式一致，說(shuō)明POD在木質(zhì)素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時(shí)，通常會(huì)通過(guò)抑制木質(zhì)素合成相關(guān)酶POD 活性來(lái)減緩木質(zhì)素積累[36]，對(duì)貯藏菜薹進(jìn)行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量下降的同時(shí)BcPOD 的表達(dá)也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達(dá)與POD酶活性以及木質(zhì)素含量和?；首兓喾?，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^(guò)程木質(zhì)素的調(diào)控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個(gè)木質(zhì)素合成基因的表達(dá)及相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化與汁胞木質(zhì)素含量和?；首兓嘁恢?，因此認(rèn)為琯溪蜜柚汁胞?；怯赡举|(zhì)素代謝途徑中的系列關(guān)鍵基因共同調(diào)控的結(jié)果。
4 結(jié)論
在琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中，汁胞粒化率隨著木質(zhì)素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因。這9 個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)，調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強(qiáng)，從而促進(jìn)汁胞木質(zhì)素含量積累，引起汁胞?；l(fā)生。筆者在分子和生理水平上系統(tǒng)地研究了琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育過(guò)程中汁胞木質(zhì)素生物合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)與汁胞?；年P(guān)系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。
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劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來(lái) 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征，以揭示汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素合成的分子調(diào)控機(jī)制。【方法】選取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個(gè)時(shí)期的琯溪蜜柚果實(shí)，測(cè)定汁胞?；始澳举|(zhì)素含量以及分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的木質(zhì)素生物合成途徑關(guān)鍵基因的差異表達(dá)和相關(guān)酶活性變化，并進(jìn)行汁胞細(xì)胞壁木質(zhì)素沉積的顯微觀察?！窘Y(jié)果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實(shí)發(fā)育成熟期，木質(zhì)素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個(gè)基因的表達(dá)量都顯著增強(qiáng)，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。這期間果實(shí)汁胞?；黠@加速，木質(zhì)素合成相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過(guò)氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質(zhì)素含量顯著積累，番紅染色顯示木質(zhì)素在蜜柚汁胞細(xì)胞壁中明顯沉積。【結(jié)論】琯溪蜜柚木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因參與調(diào)控汁胞?；^(guò)程中細(xì)胞壁木質(zhì)素的合成。研究結(jié)果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞粒化；基因調(diào)控；酶活性；木質(zhì)素合成
中圖分類(lèi)號(hào)：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹(shù)，是福建省平和縣乃至全國(guó)具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞?；瘒?yán)重影響到了果實(shí)的生產(chǎn)和銷(xiāo)售，對(duì)琯溪蜜柚的口碑和相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了沖擊，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)民帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失。
琯溪蜜柚成熟過(guò)程中的汁胞?；且环N生理病害，將?；c正常汁胞比較，發(fā)現(xiàn)?；兏伞⒆冇?，呈現(xiàn)渾濁的絮狀物。汁胞?；瘜?duì)果實(shí)汁胞的外觀、質(zhì)地和風(fēng)味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過(guò)觀察琯溪蜜柚汁胞細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)，認(rèn)為汁胞粒化是汁胞細(xì)胞次生壁木質(zhì)化形成厚壁組織的結(jié)果。潘騰飛等[4]的研究發(fā)現(xiàn)琯溪蜜柚汁胞?；笖?shù)與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|(zhì)素合成關(guān)系密切。木質(zhì)素是沉積在植物細(xì)胞壁中的酚類(lèi)聚合物，主要有3 種類(lèi)型[5]，分別是由香豆醇合成的對(duì)羥基苯基木質(zhì)素（H型）、由松伯醇合成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質(zhì)素（S 型）[6]?，g溪蜜柚?；邪l(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素主要為G型木質(zhì)素[7]。研究發(fā)現(xiàn)肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過(guò)氧化物酶（POD）等和木質(zhì)素合成直接相關(guān)[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質(zhì)素含量相關(guān)[9]。目前，對(duì)琯溪蜜柚汁胞粒化與木質(zhì)素代謝關(guān)系的報(bào)道多為對(duì)木質(zhì)素代謝途徑中個(gè)別基因家族的分析或木質(zhì)素相關(guān)合成酶活性對(duì)木質(zhì)素含量的影響，關(guān)于琯溪蜜柚汁胞?；^(guò)程中木質(zhì)素代謝途徑的系列關(guān)鍵基因表達(dá)變化與汁胞粒化關(guān)系的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對(duì)此展開(kāi)系統(tǒng)研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實(shí)汁胞?；F(xiàn)象通常發(fā)生在果實(shí)成熟和采后的貯藏過(guò)程中，有關(guān)采后貯藏汁胞粒化的研究較多，但對(duì)成熟果實(shí)的汁胞粒化研究較少。筆者在本研究中以不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組篩選差異表達(dá)的木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因分析相關(guān)酶活性和木質(zhì)素含量、?；实淖兓?，以期揭示琯溪蜜柚汁胞粒化過(guò)程的生理與分子調(diào)控機(jī)制。
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)材料
琯溪蜜柚果實(shí)樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮(zhèn)舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗(yàn)站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹(shù)齡、樹(shù)勢(shì)一致的健壯樹(shù)體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個(gè)時(shí)期分別隨機(jī)采集大小一致、健康、無(wú)明顯機(jī)械外傷的果實(shí)各9 個(gè)立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行果實(shí)?；实臏y(cè)定和果實(shí)汁胞石蠟切片。每個(gè)時(shí)期每個(gè)果實(shí)各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的測(cè)定和qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)。此外，每個(gè)果實(shí)各取約100 g 置于玻璃瓶?jī)?nèi)于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質(zhì)素含量測(cè)定。以上所有試驗(yàn)均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。
1.2 蜜柚果實(shí)?；?、汁胞木質(zhì)素含量測(cè)定
琯溪蜜柚果實(shí)粒化率測(cè)定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測(cè)定花后4個(gè)時(shí)期的粒化汁胞質(zhì)量和汁胞總質(zhì)量。果實(shí)?；?%=?；|(zhì)量/汁胞總質(zhì)量×100。琯溪蜜柚果實(shí)汁胞木質(zhì)素含量采用AB 法，即乙酰溴法測(cè)定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機(jī)切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹(shù)膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質(zhì)化的細(xì)胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達(dá)分析
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由深圳華大基因研究院完成，統(tǒng)計(jì)和評(píng)估轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量以及組裝效果。
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到基因的表達(dá)水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據(jù)4 個(gè)時(shí)期汁胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質(zhì)素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達(dá)基因。
1.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成差異基因引物設(shè)計(jì)
從轉(zhuǎn)錄組中篩選出13 個(gè)差異表達(dá)基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設(shè)計(jì)程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內(nèi)參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗(yàn)證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，以琯溪蜜柚果實(shí)汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測(cè)定基因的表達(dá)量。
1.7 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性測(cè)定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測(cè)試劑盒（上海優(yōu)選）說(shuō)明對(duì)琯溪蜜柚果實(shí)汁胞進(jìn)行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測(cè)定其活性。
1.8 數(shù)據(jù)處理
采用2-△△Ct方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[13]。利用WPS 表格進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（2019），SPSS 19.0 進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實(shí)?；始爸举|(zhì)素含量的變化
在琯溪蜜柚果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育期間，花后195 d之前的果實(shí)發(fā)育期未見(jiàn)汁胞粒化，但在花后195 d 之后的果實(shí)成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實(shí)的成熟，汁胞木質(zhì)素含量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在花后195 和215 d 汁胞中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量顯著增加（圖1），這些結(jié)果說(shuō)明在蜜柚果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間，隨著木質(zhì)素的積累，果實(shí)汁胞?；室搽S之增加，果實(shí)汁胞?；赡苁悄举|(zhì)素含量過(guò)度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質(zhì)素顯微觀察
對(duì)FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實(shí)汁胞進(jìn)行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內(nèi)部細(xì)胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花后135 和165 d 蜜柚果實(shí)汁胞顏色相似，無(wú)明顯紅色、無(wú)明顯顏色變化（圖2-A、B），說(shuō)明這兩個(gè)時(shí)期汁胞木質(zhì)素含量較低；花后195 d 汁胞內(nèi)部細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細(xì)胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無(wú)明顯變化，但此時(shí)汁胞已出現(xiàn)木質(zhì)化，木質(zhì)素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內(nèi)部細(xì)胞和外表皮層的細(xì)胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說(shuō)明在花后195 d 之后的果實(shí)成熟期汁胞細(xì)胞壁木質(zhì)化程度增加，木質(zhì)素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組木質(zhì)素合成差異基因表達(dá)分析
對(duì)4 個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期琯溪蜜柚果實(shí)汁胞轉(zhuǎn)錄組17 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑中差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖分析（圖3），結(jié)果表明，其中1 個(gè)基因CrCCR1 和另外3 個(gè)基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達(dá)量與這2 個(gè)時(shí)期的木質(zhì)素含量的增加趨勢(shì)不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個(gè)基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育成熟進(jìn)程，在花后165、195 和215 d 差異表達(dá)（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達(dá)水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調(diào)了2 至9 倍，并且和木質(zhì)素含量的變化趨勢(shì)相一致。研究認(rèn)為這13 個(gè)基因可能是蜜柚汁胞木質(zhì)素合成的關(guān)鍵基因，因此篩選這13個(gè)基因用于后續(xù)的qRT-PCR驗(yàn)證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質(zhì)素合成差異基因qRT-PCR驗(yàn)證分析
對(duì)13 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑差異基因進(jìn)行qRT- PCR 驗(yàn)證（ 圖4）。隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個(gè)基因qRTPCR相對(duì)表達(dá)量都上調(diào)表達(dá)，尤其在花后195 至215 d 的果實(shí)成熟期顯著表達(dá)，且與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果一致，證明了這9 個(gè)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。說(shuō)明花后195 至215 d 是蜜柚果實(shí)汁胞?；瘯r(shí)期。另外4 個(gè)基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)酶活性變化分析
分別對(duì)花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實(shí)汁胞中木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，酶活性隨著果實(shí)的發(fā)育成熟呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在花后215 d 達(dá)到峰值（圖5），與木質(zhì)素含量及粒化率的變化規(guī)律基本一致，表明這些酶可能在蜜柚果實(shí)發(fā)育成熟階段的汁胞木質(zhì)素生物合成途徑中起關(guān)鍵作用。
3 討論
木質(zhì)素是植物細(xì)胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產(chǎn)物。木質(zhì)素在果實(shí)汁胞中過(guò)量積累可能會(huì)導(dǎo)致汁胞?；瑫?huì)影響果實(shí)的口感和風(fēng)味，目前在收獲的柑橘果實(shí)中普遍存在汁胞?；@一現(xiàn)象[14]。前人有研究表明木質(zhì)素生物合成與汁胞?；g有著密切關(guān)聯(lián)，?；闹ǔ０l(fā)生木質(zhì)素過(guò)度積累的現(xiàn)象[15]，但總體研究還不夠完整和系統(tǒng)。因此，筆者在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和產(chǎn)物生成3 個(gè)水平展開(kāi)木質(zhì)素代謝與琯溪蜜柚汁胞?；瘷C(jī)制的系統(tǒng)研究。
果實(shí)中木質(zhì)素含量的變化與木質(zhì)素生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質(zhì)素的合成過(guò)程中起著極為重要的調(diào)控作用，且木質(zhì)素合成量與這些基因的表達(dá)量呈正相關(guān)[16-17]。筆者在本研究中通過(guò)琯溪蜜柚汁胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到17 個(gè)木質(zhì)素生物合成途徑的差異表達(dá)基因，其中13 個(gè)基因的表達(dá)量與汁胞?；始澳举|(zhì)素含量變化趨勢(shì)一致，且在花后195至215 d 顯著表達(dá)。qRT- PCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個(gè)基因在蜜柚果實(shí)發(fā)育和成熟期的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果變化趨勢(shì)一致，均隨著果實(shí)的成熟呈顯著上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，同時(shí)相關(guān)酶活性也隨之增強(qiáng)，并與木質(zhì)素生物合成的增加及蜜柚汁胞?；厔?shì)相一致。這一研究結(jié)果表明以上9 個(gè)基因是蜜柚汁胞木質(zhì)素的合成調(diào)控的關(guān)鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞?；倪^(guò)程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它在木質(zhì)素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過(guò)對(duì)5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結(jié)果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達(dá)水平對(duì)梨果中石細(xì)胞和木質(zhì)素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉(zhuǎn)錄水平在木質(zhì)化組織（根和莖）中高于在木質(zhì)化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質(zhì)素含量及粒化率較高的成熟期果實(shí)中表達(dá)量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果及PAL 基因表達(dá)量一致，與汁胞?；室泊笾孪喾4H被證明參與了木質(zhì)素生物合成途徑中G 木質(zhì)素單體的產(chǎn)生[21]，小麥中發(fā)現(xiàn)C4H1 基因的表達(dá)與木質(zhì)素含量呈顯著相關(guān)[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進(jìn)木質(zhì)素的合成，導(dǎo)致竹筍組織木質(zhì)化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達(dá)量在成熟期顯著上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，C4H酶活性也隨著果實(shí)的發(fā)育成熟逐漸增強(qiáng)，并與汁胞中木質(zhì)素含量及粒化率變化相一致。4CL 是CCR 上游的一個(gè)酶，4CL 的產(chǎn)物是CCR 的底物，而CCR被認(rèn)為是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶[24]。青稞研究中發(fā)現(xiàn)4CL是影響木質(zhì)素合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，4CL活性的提高可以增強(qiáng)莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與qRT-PCR 結(jié)果顯示隨著木質(zhì)素含量的增加及汁胞粒化率的上升，Cr4CL 在蜜柚成熟過(guò)程中也逐漸上調(diào)表達(dá)，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達(dá)相一致，這也與芹菜發(fā)育階段的觀察結(jié)果相似[26]。前人在梨果實(shí)中木質(zhì)素合成的有關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達(dá)趨勢(shì)與果核細(xì)胞的積累和木質(zhì)素含量相關(guān)[27]，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)CrCCR3 在汁胞中的表達(dá)趨勢(shì)也與木質(zhì)素含量、?；首兓厔?shì)相一致。此外，催化肉桂醛轉(zhuǎn)化為肉桂醇[28]，參與單體木質(zhì)素生物合成最后一步的另一個(gè)關(guān)鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質(zhì)素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因番茄植株中木質(zhì)素的沉積，木質(zhì)素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應(yīng)上升，且與木質(zhì)素含量、木質(zhì)素合成酶基因CrCAD3 的表達(dá)以及?；氏嘁恢?。POD則通過(guò)聚合單體木質(zhì)素催化松柏醇發(fā)生脫氫聚合反應(yīng)形成G 型木質(zhì)素[33]。有報(bào)道對(duì)白樺POD 全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質(zhì)部中高度表達(dá)[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達(dá)水平與木質(zhì)素積累模式一致，說(shuō)明POD在木質(zhì)素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時(shí)，通常會(huì)通過(guò)抑制木質(zhì)素合成相關(guān)酶POD 活性來(lái)減緩木質(zhì)素積累[36]，對(duì)貯藏菜薹進(jìn)行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量下降的同時(shí)BcPOD 的表達(dá)也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達(dá)與POD酶活性以及木質(zhì)素含量和?；首兓喾?，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^(guò)程木質(zhì)素的調(diào)控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個(gè)木質(zhì)素合成基因的表達(dá)及相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化與汁胞木質(zhì)素含量和?；首兓嘁恢?，因此認(rèn)為琯溪蜜柚汁胞?；怯赡举|(zhì)素代謝途徑中的系列關(guān)鍵基因共同調(diào)控的結(jié)果。
4 結(jié)論
在琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中，汁胞粒化率隨著木質(zhì)素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因。這9 個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)，調(diào)控木質(zhì)素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強(qiáng)，從而促進(jìn)汁胞木質(zhì)素含量積累，引起汁胞?；l(fā)生。筆者在分子和生理水平上系統(tǒng)地研究了琯溪蜜柚果實(shí)發(fā)育過(guò)程中汁胞木質(zhì)素生物合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)與汁胞?；年P(guān)系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎(chǔ)。
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