朱丹桂 徐正圓 董靜怡 張宇燕△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華中醫(yī)院，浙江 金華 321000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

丹參為唇形科植物丹參（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根及其根莖，是傳統(tǒng)中藥，味苦，性微寒，通過分離與鑒定的化學(xué)成分已有百余種，主要包括丹參酮類、丹酚酸類、揮發(fā)油類、多糖類、含氮類化合物等［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參除具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等傳統(tǒng)功效外，還具有抗凝血、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等拓展功效，其活性成分及丹參制劑具有一定的抗動脈粥樣硬化、改善心肌重構(gòu)、抗心肌缺血、抗心律失常的心血管保護作用，因而被廣泛應(yīng)用于心血管疾病及炎癥相關(guān)疾病的治療［1-5］。丹參中主要有效成分有水溶性物質(zhì)和脂溶性物質(zhì)兩大類，其中丹酚酸B 是丹參的主要水溶性復(fù)合物之一，是丹參總酚酸含量最高、活性最強的成分［6］。有研究通過HPLC 法檢測大鼠注射丹紅注射液后血漿中丹酚酸類成分的含量，顯示丹酚酸B 在大鼠血漿中的含量明顯高于其他酚酸類［7］，并篩選抗氧化活性成分發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具較強抗氧化活性［8］。

本研究以丹參主要活性成分丹酚酸B 含量為指標，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化不同的提取工藝，并通過R語言分析正交試驗得到最優(yōu)提取方案，同時探討不同提取工藝下提取液的抗氧化活性，以期為臨床應(yīng)用丹參治療心腦血管等重大疾病及開發(fā)有效的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

丹參藥材購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定均符合《中國藥典》藥材項下的質(zhì)量要求；丹酚酸B（PA0418RA）、DPPH（W10A8E33599）：上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%。VC（TM01162）：上海西隴生化科技有限公司。其余均為分析純。紫外可見分光光度計：UV-2800，上海恒科儀器有限公司。電子天平：FA2104，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B 對照品3.25 mg，純水定容至25mL，得130 μg/mL 的對照品溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制 分別取2.1.1 節(jié)中對照品溶液不同體積，加入5 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，得到梯度濃度。在286 nm 處測定吸光度，以吸光度對濃度進行線性回歸，得到回歸方程y=0.0073x+0.0118，R2=0.9989，線性良好。

2.1.3 精密度試驗 取丹酚酸B 對照品，按2.1.2 節(jié)的方法平行測定5 次，每次吸取1.5 mL，計算得丹酚酸B吸光度RSD為1.14%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取丹酚酸B 對照品，按2.1.2 節(jié)的方法在0、2、4、6、8、10 h進行測定，每次吸取1.5 mL，計算得丹酚酸B吸光度RSD為1.12%。

2.1.5 重復(fù)性試驗 等量精密稱取同批次樣品5 份，按2.1.2 節(jié)的方法測定吸光度，計算丹酚酸B 含量的RSD為6.13%。

2.1.6 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的丹參粉末0.3 g，分別精密吸取2.1.1 節(jié)中對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照2.1.1 節(jié)制備樣品液并測定含量，計算得平均回收率為93.01%。

2.2 丹酚酸B提取單因素實驗

2.2.1 提取時間 稱取10 g 丹參，控制料液比為1∶12，加熱回流，在2 h 內(nèi)每隔5 min 取一次樣，并測定其吸光度值。結(jié)果如圖1 所示，表明隨著時間增長，丹酚酸B 的濃度在逐漸升高，其中在1.5 h 處的樣品增長趨勢很快。為節(jié)約工業(yè)成本，減少人力物力的消耗，優(yōu)選1.5 h。

圖1 提取時間、提取次數(shù)、料液比對丹酚酸B提取的影響

2.2.2 提取次數(shù) 稱取丹參10 g，控制料液比為1∶12，加熱回流提取1 h，過濾，收集濾液，濃縮定容至50 mL，取出少量樣品待測；往濾渣中繼續(xù)加入12 倍體積的蒸餾水，加熱回流1 h，過濾，合并兩次濾液，定容至100 mL，取出少量樣品待測。再如上操作3次，每次收集濾液并取出少量樣品待測。紫外測定5 份溶液的吸光度值并計算濃度。結(jié)果如圖1 所示，隨提取次數(shù)的增加，丹酚酸B 的濃度不斷增高，但是在提取3 次之后增長趨勢變緩。根據(jù)節(jié)約成本的要求，煎煮3 次更符合工業(yè)產(chǎn)業(yè)化。

2.2.3 料液比 稱取10 g丹參，料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加熱回流提取1 h，收集濾液并定容測定吸光度，計算丹酚酸B 濃度。結(jié)果如圖1 所示，丹酚酸B濃度隨料液比增加呈波折上升趨勢，在料液比達1∶12 后丹酚酸B 濃度增加趨勢不大，且有下降趨勢，因此，12倍加水量體積較優(yōu)。

2.3 正交試驗優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)上進一步采用正交試驗優(yōu)化丹參提取工藝，選取提取時間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）、誤差（D）作為考察因素，每個因素各取3 個水平，進行L9（34）正交試驗，篩選最佳工藝條件，因素水平見表1，結(jié)果如表2所示。

表1 正交因素水平設(shè)計

表2 正交試驗結(jié)果

2.4 結(jié)合數(shù)學(xué)模型分析正交試驗

2.4.1 R 語言環(huán)境進行BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模 在R 語言數(shù)據(jù)環(huán)境下建立3層結(jié)構(gòu)（只有1個隱層）的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，輸入層節(jié)點數(shù)設(shè)為4，分別為煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量倍數(shù)及誤差；輸出節(jié)點數(shù)為1，即提取液中丹酚酸B 的提取率。將正交試驗的9 組數(shù)據(jù)分別采用留一法進行交叉驗證，相關(guān)參數(shù)設(shè)置：初始隨機權(quán)（rang）=0.6，參數(shù)重量衰變（decay）=5×10-5，最大迭代次數(shù)（maxit）=900，其他參數(shù)設(shè)置為默認值。在此參數(shù)條件下對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行留一法交叉訓(xùn)練，以平均預(yù)測誤差和平均擬合誤差作為選取隱層神經(jīng)元（size）的依據(jù)標準。

結(jié)果如表3 所示，隱層神經(jīng)元為1 時，平均預(yù)測誤差、平均擬合誤差均小于5%，具統(tǒng)計學(xué)意義；而隱層神經(jīng)元為0、2、3 時，平均預(yù)測誤差和平均擬合誤差未完全符合篩選條件（即小于5%），故排除。且隱層神經(jīng)元數(shù)增加到一定數(shù)目（最高為8）時，可能會產(chǎn)生擬合過度的現(xiàn)象。因此在上述參數(shù)的條件下，以正交試驗的9 組數(shù)據(jù)為樣本，對不同的隱層神經(jīng)元進行擬合誤差的訓(xùn)練，結(jié)果如表4 所示，隨隱層神經(jīng)元個數(shù)增加，擬合誤差呈先升高再降低的趨勢，由此可判斷隱層神經(jīng)元為1 之后，增加隱層神經(jīng)元數(shù)將導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)模型的擬合過度。因此，此次模型的隱層神經(jīng)元設(shè)定為1，此時BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定可靠。

表3 隱層神經(jīng)元（size）訓(xùn)練結(jié)果（%）

表4 隱層神經(jīng)元（size）訓(xùn)練結(jié)果

2.4.2 R 語言環(huán)境中應(yīng)用遺傳算法進行目標優(yōu)化 遺傳算法是一種基于基因遺傳學(xué)原理與自然界優(yōu)勝劣汰的進化規(guī)律的優(yōu)化搜索方法，可以達到全面系統(tǒng)地優(yōu)化搜索，避免數(shù)學(xué)公式復(fù)雜的推導(dǎo)過程以及參數(shù)選擇過程。根據(jù)遺傳算法的基本思想，采用R 語言的代碼進行一系列編程，整合實數(shù)編碼方法，在種群數(shù)大小為900、接近的最大代數(shù)為100 代、最大不可變代數(shù)為10 代時，能夠得到最優(yōu)解，收斂公差是1×10-3，其他參數(shù)均為默認值。由遺傳算法得到的結(jié)果是運行時間為2 s，運行到第12代時找到丹參最佳提取工藝條件為提取1.5 h，提取3次，料液比為1∶8，此條件下得到的丹酚酸B最優(yōu)提取率為95.22 mg/g。

2.5 最優(yōu)工藝驗證

分別稱取等量丹參樣品5 份，按照最佳工藝條件進行提取，紫外測定吸光度并計算含量。結(jié)果如表5所示，相對誤差為4.45%，說明優(yōu)化后實驗測量值和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值較吻合，說明該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定性良好，具有較好的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測性。

表5 最佳工藝驗證結(jié)果

2.6 DPPH法測定體外抗氧化能力

將正交試驗中的9 組樣品稀釋至適當濃度，在96孔板中加入100 μL 樣品溶液和100 μL DPPH 溶液（100 μg/mL），避光反應(yīng)30 min 后在517 nm 波長下測定吸光度值，以Vc作為陽性對照。清除率按下式進行計算。。（其中A0為DPPH+甲醇，A1為待測液+DPPH，A2為待測液+甲醇）

結(jié)果如圖2 所示，第7 組和第5 組的抗氧化能力較好，而第2 組的抗氧化能力較差。進一步進行方差分析后（如表6）發(fā)現(xiàn)，C因素即料液比對提取液的抗氧化影響較大，而A、B因素對提取液的抗氧化影響不大，考慮到藥材、時間的綜合利用，最佳提取條件應(yīng)為A1B1C3，即提取1 h，提取1 次，料液比1∶12，此條件下的提取液抗氧化作用強。

表6 丹酚酸B方差分析表

圖2 不同提取液DPPH自由基清除率

3 討 論

丹參是臨床常用藥材之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用，丹參及其制劑常用于配伍其他藥物治療多種疾病［9］?，F(xiàn)有研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)丹參中的水溶性成分如丹酚酸B 可通過多靶點、多途徑發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用［10］。同時，大量研究表明丹參在多方面表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，這可能就是丹參在治療活性氧誘發(fā)的心腦血管疾病方面有顯著效果的原因之一［11］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液可以有效減輕氧自由基對腦組織細胞的損害，通過HPLC法發(fā)現(xiàn)含量最多的4種成分主要來自丹參，其中包含丹酚酸B，表明丹酚酸B 可能在此發(fā)揮了很大的作用［12-13］。

丹參主要有水溶性和脂溶性成分，其提取方法一般有水提法［14］、醇提法［15］、超聲提取法［16］等。本研究以水溶性成分丹酚酸B 為指標，故采用加熱回流水提法，在單因素實驗的前提下，分析并確定正交分析表的因素和水平，按L9（34）正交試驗表條件提取，得到的結(jié)果應(yīng)為較優(yōu)解。但正交設(shè)計僅考慮三因素的四水平對藥物提取工藝的影響，所得出來的數(shù)據(jù)僅為較優(yōu)解，而不是最優(yōu)解；而R語言具有強大的數(shù)學(xué)統(tǒng)計能力，可以充分分析模塊來實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化，且操作簡便，可以對各種數(shù)據(jù)進行處理，故本實驗帶入正交提取實驗的9組數(shù)據(jù)來進行R 語言分析；R 語言可以從整個實驗區(qū)間進行考慮，分析得出最優(yōu)解。本研究在利用數(shù)學(xué)模型來減少人力物力的同時還可以充分發(fā)掘丹參的最優(yōu)提取組合，以期充分利用中藥資源。

本研究通過DPPH 法將正交試驗得到的提取液進行抗氧化實驗。DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，和乙醇混合后呈深紫色，在可見光區(qū)的吸收光波長為515 nm，當DPPH 溶液與自由基清除劑（本實驗為提取液）混合后時，吸收會減弱甚至消失［17］，因此可用來檢測自由基的清除情況評價某種物質(zhì)的抗氧化作用能力。通過DPPH 實驗發(fā)現(xiàn)，丹參提取液具有良好的體外抗氧化能力，結(jié)合方差分析處理后顯示C 因素即液料比具有顯著差異，而其他兩個因素水平不具有顯著差異，但總體而言，不同提取工藝的提取液的體外抗氧化能力差異較大，需要更深的研究探討。

本實驗建立丹酚酸B 的含量測定方法，并利用R語言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行分析，求得最優(yōu)的丹參提取工藝，此最佳提取工藝的條件為：提取時間1.5 h，提取3 次，料液比1∶8，其丹酚酸B 提取率的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值為95.22 mg/g，具有良好的預(yù)測性。最優(yōu)提取工藝的確定可為臨床充分利用丹參中藥材資源提供基礎(chǔ)，為工業(yè)生產(chǎn)提供建議，為制劑工藝條件優(yōu)化提供參考。不同工藝的活性不同也為臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，有助于指導(dǎo)臨床使用和中藥新藥開發(fā)。