黃 杰 張巧梅 鄧揚(yáng)嘉

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410036；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000；3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400011）

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）指氣管插管或氣管切開患者接受機(jī)械通氣48 h 后發(fā)生的肺炎，是導(dǎo)致患者脫機(jī)困難、住院時(shí)間延長、治療費(fèi)用增加的疾?。?-2］。研究發(fā)現(xiàn)：NETs 水平可作為反映肺組織損傷的重要指標(biāo)［1-3］；腸源性感染患者感染狀態(tài)可用NETs 水平來反映［1］。故我們推測，同樣屬于感染性疾病的VAP，NETs可能參與其發(fā)病機(jī)制。

針灸通過穴位刺激，具有疏通經(jīng)絡(luò)、扶正祛邪等作用［2］。艾灸通過溫?zé)岽碳ぃせ钛ㄎ痪植康臒崦舾忻庖呒?xì)胞、特異感受器等，達(dá)到溫通溫補(bǔ)的作用［3］。劉兵等提出針灸介入防治COVID-19 的可行性與可靠性，并提出了獨(dú)特“針灸方案”［4］。研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上溫和灸治療呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的療效顯著，可減輕肺部感染［5］。本研究利用VAP 模型大鼠，初步探索針灸減少VAP 模型大鼠炎性反應(yīng)的作用機(jī)制，為深入研究針灸、NETs抑制劑預(yù)防和治療VAP患者的可能機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級成年雄性健康大鼠，體質(zhì)量（300±10）g，由成都藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（川）2020-034。SD 大鼠自購回后保持其自由飲水、進(jìn)食，溫度21～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)重慶威斯騰生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審議同意并批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器

NETs 抑制劑（鹽酸尼索西?。?。大鼠CITH3 酶聯(lián)吸附測定試劑盒：江萊生物（中國，JL47058）。MPO 比色法測試盒：伊萊瑞特，武漢（CAT：E-BC-K074-M）。Sytox Green：美國Thermo Fisher（S7020）。PBS：上海生工，中國（B040100）。RPMI-1640 培養(yǎng)基：美國Gibco（A4192301）。一次性毫針（華佗牌，0.25 mm×25 mm），艾條（南陽市漢艾艾制品有限公司）。小動(dòng)物呼吸機(jī)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司（DW-3000 型）。酶聯(lián)免疫檢測儀：美國Thermo Fisher。低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。顯微外科手術(shù)器械包：上海手術(shù)器械廠（SSW-3型）。

1.3 分組與造模

將80 只成年雄性健康SD 大鼠分為對照組、模型組、針灸組、針灸+NETs 抑制劑組，每組20 只。20%烏拉坦腹腔注射麻醉，取仰臥位，使用喉鏡將氣管導(dǎo)管插入聲門，通過聽雙肺呼吸音確定導(dǎo)管插在氣管內(nèi)，于大鼠口腔行氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定為：潮氣量（V）12 mL/kg，呼吸頻率70次/min，吸入氧濃度（FiO2）1.0。連續(xù)通氣48 h后，5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，豎起固定板＞45°，以微量注射器經(jīng)氣管導(dǎo)管注入0.2 mL 3×108cfu/L 銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55 mL 氣體，并保持體位5 min。經(jīng)氣管注入PA 菌液6 h 后，檢測大鼠肺組織病理變化呈小葉性肺炎特征，肺泡灌洗液和肺組織中的PA 細(xì)菌培養(yǎng)陽性［6］，以確保成功誘導(dǎo)出大鼠VAP模型。

1.4 針灸及給藥方法

針灸組、針灸+NETs 抑制劑組取大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位》第2 部分：大鼠［7］。肺俞：第3 胸椎下兩旁肋間，背正中線旁開6 mm。大椎：第7 頸椎與第1 胸椎間，背部正中。風(fēng)門：第2 胸椎下兩旁肋間，背正中線旁開6 mm。大椎直刺5 mm，肺俞、風(fēng)門各斜刺6 mm，留針30 min，運(yùn)用平補(bǔ)平瀉手法每10分鐘行針1次，每日2次，共7次；針刺治療結(jié)束后將點(diǎn)燃的艾條，距相同穴位皮膚表面2 cm 處施溫和灸，施灸15 min，每日2 次，共7 次。針灸+NETs 抑制劑組按體質(zhì)量0.8 μmol/L/290～340 g 的劑量鞘內(nèi)注射NETs抑制劑。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈采血，放于無抗凝管中靜置1～2 h 后離心（3 000 r/min，20 min，4 ℃），吸取上層血清-20 ℃保存用于ELISA 檢測。采用經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行大鼠肺泡灌洗，收集灌洗液，離心后置于-20 ℃保存用于ELISA檢測。

1.5.1 激光共聚焦檢測大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達(dá)差異 佛波酯（PMA）誘導(dǎo)NETs形成：1）將細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔板爬片中，加入PMA使其終濃度為300 ng/mL，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；2）孵育結(jié)束后，加入Sytox Green 和Hochest 混合染色液37 ℃染色5～10 min；3）染色結(jié)束后用PBS 清洗1 次，用4%多聚甲醛室溫固定10 min；4）固定結(jié)束后用PBS 清洗1 次，加入封片劑進(jìn)行封片，共聚焦觀察。

1.5.2 ELISA 檢測大鼠H3 表達(dá) 從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。樣本孔中加入待測樣本50 μL，空白孔加樣本稀釋液50 μL，空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板模封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μL），靜置1 min，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5 次。每孔加入底物A、B 各50 μL，15 min 內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.5.3 MPO 測定 1）對照管：取350 μL 雙蒸水、20 μL待測樣本、20 μL試劑五（澄清劑）加入1.5 mL EP管中。測定管：取20 μL待測樣本、20 μL試劑五，350 μL顯色劑加入1.5 mL EP 管中。2）渦旋混勻3 s，37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)30 min。3）向2）中各管加入5 μL試劑八（酸試劑），渦旋混勻3 s，60 ℃水浴10 min。4）取出后，3 000×g，離心10 min。5）取300 μL 上清液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀460 nm處，測定各孔OD值。

1.5.4 H3 的測定 繪制標(biāo)準(zhǔn)物和OD 值的回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。參照文獻(xiàn)［8］測定MPO。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達(dá)差異

見圖1。激光共聚焦顯微鏡下，中性粒細(xì)胞在接受PMA刺激4 h后，產(chǎn)生大量綠色細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從顯微結(jié)構(gòu)和組成成分上可鑒定為NETs（圖中紅色虛線處）。VAP 大鼠模型外周血和肺泡灌洗液中均存在NETs，外周血中明顯高于肺泡灌洗液中，在4組的分布中，模型組＞針灸組＞針灸+NETs抑制劑組＞對照組。

圖1 各組大鼠外周血及肺泡灌洗液NETs表達(dá)（400倍）

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液中H3、血清中H3水平比較

見表1。與對照組比較，模型組、針灸組、針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3 表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）。與模型組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），針灸組肺泡灌洗液、血清中H3 表達(dá)相近（P＞0.05）。與針灸組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中H3表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液、血清H3、MPO比較

2.3 各組肺泡灌洗液中MPO、血清中MPO比較

見表1。對照組比較，模型組、針灸組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），針灸+NETs抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，針灸組、針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO 表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。與針灸組比較，針灸+NETs 抑制劑組肺泡灌洗液、血清中MPO表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

ICU 中患者常需要接受機(jī)械通氣治療，其可以有效糾正患者呼吸功能障礙，改善患者肺部通氣量，是ICU救治工作中重要組成部分，但患者較易發(fā)生VAP［9-10］。而對于VAP 治療主要是使用抗生素為主的綜合治療，隨著多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，其治療難度增加。Castanheira FVS 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)炎癥反復(fù)發(fā)生或刺激物持續(xù)存在時(shí)，過度的NETs 會(huì)造成組織損傷［11］。研究發(fā)現(xiàn)，NETs 參與急性呼吸窘迫綜合征患者肺損傷的形成機(jī)制［12］。Fousert E 等提出NETs 過量產(chǎn)生或清除不及時(shí)可參與多種炎癥性疾病的發(fā)病過程［13］。VAP 脫機(jī)困難的一個(gè)重要原因即炎癥反復(fù)發(fā)作、抗生素反復(fù)使用致抗感染無效，進(jìn)而發(fā)展成急性肺損傷，因此，我們推測，對于炎癥反復(fù)的VAP，NETs 也參與其發(fā)病機(jī)制。所以如何減少過度的NETs 是治療包括VAP 在內(nèi)的炎性疾病的一種新的研究方向。

中醫(yī)學(xué)尚無關(guān)于VAP 的病名診斷，但根據(jù)其癥狀，可歸屬于“咳嗽”“發(fā)熱”等范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》云“正氣存內(nèi)，邪不可干”，需機(jī)械通氣的患者往往因久病導(dǎo)致其正氣虧虛，御邪無力，邪毒乘虛而入，肺失清肅；肺主宣降，通調(diào)水道，肺失清肅則水道不通，積聚成痰，痰郁而化熱，痰熱互結(jié)，壅閉于肺，患者主要以發(fā)熱、咳嗽、氣促等為臨床表現(xiàn)［14］。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及NETs 在VAP 模型大鼠的可能機(jī)制，我們使用了針灸和NETs 抑制劑兩種方式對VAP模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。本研究針灸選穴肺腧?qū)僮闾柊螂捉?jīng)，刺之可補(bǔ)益肺臟，止咳平喘，起到扶正之功；大椎屬督脈，為手足三陽經(jīng)與督脈的交會(huì)穴，被稱為“諸陽之會(huì)”，統(tǒng)攝一身之陽，是邵老治療肺系病的要穴［15］，刺之可清瀉肺熱，起到祛邪之用，兩個(gè)穴位相互配合，共奏扶正祛邪之效；風(fēng)門屬足太陽膀胱經(jīng)，為風(fēng)邪出入之門戶，搜風(fēng)要穴，主治感冒、咳嗽、發(fā)熱等外感病癥、肺系病癥，刺之可疏風(fēng)解表、宣肺平喘［16］，以上諸穴相互配合，增強(qiáng)VAP 患者正氣，使外邪不再侵入的同時(shí)祛除體內(nèi)毒邪。

本研究發(fā)現(xiàn)NETs 確實(shí)存在于VAP 模型大鼠中，并且導(dǎo)致模型大鼠炎癥惡化。本研究中模型組和針灸組，模型組和針灸+NETs抑制劑組的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平存在明顯差異，而針刺組和針灸+NETs 抑制劑組的肺泡灌洗液、血清中MPO 水平表達(dá)相近，故我們推測針灸對于減少肺泡灌洗液、血清中MPO 水平優(yōu)于NETs 抑制劑；而針灸減少VAP 模型大鼠的NETs的機(jī)制可能是通過降低其肺泡灌洗液、血清中MPO 水平來實(shí)現(xiàn)的。模型組和針灸+NETs抑制劑組的肺泡灌洗液中H3、MPO 水平、血清中H3、MPO 水平均存在明顯差異，故我們推測針灸+NETs 抑制劑協(xié)同減少模型大鼠NETs的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過降低肺泡灌洗液及血清中MPO、H3的水平來實(shí)現(xiàn)的，其中，尤以肺泡灌洗液及血清中MPO水平為著。

本研究的局限和展望：1）盡管鹽酸尼索西汀溶液可有效降低NETs的水平，但使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以進(jìn)一步增加研究結(jié)果的可信度。2）本研究模型組和針灸組肺泡灌洗液及血清中H3水平無明顯差異，而杜沂嵐等發(fā)現(xiàn)經(jīng)肺腧穴中藥離子導(dǎo)入聯(lián)合振動(dòng)排痰干預(yù)慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者療效確切［17］。有研究報(bào)道電針足三里穴預(yù)處理可誘導(dǎo)大鼠對肺損傷的耐受性［18］，可以顯著減輕大鼠肺組織損傷程度，同時(shí)抑制肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-β）的表達(dá)［19］，下一步研究有望通過在針灸的基礎(chǔ)上配合腧穴中藥離子導(dǎo)入及電針治療，可能會(huì)得出更多陽性結(jié)果，進(jìn)一步降低VAP 大鼠NETs 水平，豐富VAP 的治療方式。3）劉芬等通過提取大鼠肺組織胞外囊泡（Ti-EVs）后發(fā)現(xiàn)，Ti-EVs 組肺內(nèi)NETs 熒光強(qiáng)度較膿毒癥組明顯增加，Ti-EVs 加重肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)NETs 形成［20］。這可能提示減少Ti-EVs 也會(huì)減少NETs 的形成，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，對于同樣存在NETs 的VAP，Ti-EVs 可能也存在于其發(fā)病機(jī)制中，下一步研究可以嘗試減少Ti-EVs 的形成，進(jìn)一步探索預(yù)防和治療VAP的新方法。