潘 婷 王海麗 李雪峰 陳春海 陳新華△

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

應(yīng)激性胃潰瘍（SGU）指機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下，胃和十二指腸黏膜出現(xiàn)的糜爛、潰瘍、出血等表現(xiàn)的一種急性胃黏膜病變，某些潰瘍向深部發(fā)展可造成穿孔，其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確［1］。此病的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效的防治方法，許多化學(xué)合成藥物雖可治療和控制胃潰瘍及相關(guān)問(wèn)題，但具有毒副作用，可能引起更多并發(fā)癥［2］。胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“嘈雜”“胃瘍”等范疇，針灸治療SGU 在臨床上已獲得良好的效果。針灸具有良性的雙向調(diào)節(jié)作用，針灸治療胃潰瘍是從多方面、多層次的綜合調(diào)理，起到保護(hù)胃黏膜的作用［3-4］。本研究通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行電針針刺治療后建應(yīng)激性胃潰瘍模型大鼠，觀察各組大鼠胃黏膜損傷和胃組織基因表達(dá)譜的情況，以期為電針治療應(yīng)激性胃潰瘍的應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠24 只，體質(zhì)量180～220 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2020-0002。大鼠在長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心喂養(yǎng)，自然照明，室溫為（25±3）℃，相對(duì)濕度為（55±5）%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，保持自然生物節(jié)律。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行，倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)：2021222。

1.2 試劑及儀器

鼠維持用顆粒飼料（長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司）；不銹鋼無(wú)菌針灸針（貴州安迪藥械有限公司生產(chǎn)，0.18×10 mm，產(chǎn)品批號(hào)：20182270011）；SDZ-V 型電子針療儀（產(chǎn)品批號(hào)：YZB/蘇0691-2013）；小動(dòng)物專(zhuān)用吸入麻醉機(jī)（美國(guó)MATRX VMR）；多聚甲醛固定液（產(chǎn)品編號(hào)：BL539A，Biosharp）；RNAlater 固定液（產(chǎn)品編號(hào)：R0118，Beyotime）；TRIzol（Invitrogen公司，美國(guó)）；NEBNext? Magnesium RNA Fragmentation Module（貨號(hào)E6150S，美國(guó)）；Bioanalyzer 2100（Agilent公司，USA）；Invitrogen SuperScript ⅡReverse Transcriptase（貨號(hào)1896649，美國(guó)）；E.coli DNA polymerase I（NEB，貨號(hào)m0209，美國(guó)）；RNase H（貨號(hào)m0297，美國(guó)）；dUTP Solution（貨號(hào)R0133，美國(guó)）；illumina NovaseqTM6000（LC Bio Technology CO.杭州，中國(guó)）等。

1.3 分組與干預(yù)

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后分隨機(jī)分為空白組（8只）、模型組（8 只）、電針組（8 只）。1）空白組：常規(guī)喂養(yǎng)，無(wú)任何處置。2）模型組：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，與電針組同期使用異氟烷于麻醉機(jī)中進(jìn)行麻醉，每日1 次，每次20 min，共7 次。第8 天采用水浸束縛法（WIRS）進(jìn)行造模。3）電針組：適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將大鼠使用異氟烷于麻醉機(jī)中進(jìn)行麻醉后，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》《大鼠穴位圖譜的研制》記載的腧穴位置，選擇足三里、內(nèi)關(guān)進(jìn)行電針針刺治療。每日1次，每次20 min，共7次，第8 天采用束縛-水浸應(yīng)激法進(jìn)行造模。針刺后分別以單側(cè)內(nèi)關(guān)、足三里為電針連接對(duì)穴，連接華佗牌SDZV型電子針療儀，調(diào)至連續(xù)波，頻率20 Hz，強(qiáng)度為1。

1.4 模型制備

針刺干預(yù)結(jié)束后，將電針組與模型組進(jìn)行WIRS造模［5］。大鼠禁食、不禁水24 h，造模時(shí)用繩子將其四肢縛住，背部固定于在自制金屬網(wǎng)上，使其頭部在上、尾部在下，垂直放入（22±2）℃的恒溫水箱中，保持水的液面始終在大鼠胸骨劍突，水浸時(shí)間為12 h。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1）胃黏膜損傷評(píng)估：各組大鼠在呼吸麻醉狀態(tài)下開(kāi)腹，抽取大鼠腹主動(dòng)脈血，取胃組織，用提前放置在4 度冰箱中的生理鹽水沖凈胃組織表面血跡后，將胃展開(kāi)，用游標(biāo)卡尺將展開(kāi)的胃組織進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量潰瘍面最大長(zhǎng)徑和最大橫徑并計(jì)算出胃黏膜損傷指數(shù)（UI）。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：斑點(diǎn)糜爛1 分；糜爛直徑＜1 mm 2 分；1 mm＜糜爛直徑＜2 mm 3 分；2 mm＜糜爛直徑≤4 mm 4分；糜爛直徑＞4 mm 5分；寬度＞2 mm時(shí)分值×2；最后將分?jǐn)?shù)相加即為潰瘍指數(shù)（UI）。2）HE染色病理分析：完成大鼠胃黏膜損傷評(píng)估后，將1/4胃組織分組放入10 mL試管中，4%多聚甲醛溶液浸泡24 h，脫水，包埋，切片，顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜病理變化，將1/4剩余胃組織于-80 ℃下保存，以便在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。3）將1/2胃組織放入RNAlater 固定液中，常溫放置24 h 后，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)錅y(cè)。對(duì)總樣品的RNA 進(jìn)行分離和純化，對(duì)總RNA 的量與純度進(jìn)行質(zhì)控，然后對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)通過(guò)瓊脂糖電泳的方案進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)兩輪的純化對(duì)其中的帶有多聚腺苷酸的mRNA進(jìn)行特異性捕獲。在高溫條件下將mRNA進(jìn)行片段化，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成cDNA。將處理后的DNA 與RNA 的復(fù)合雙鏈轉(zhuǎn)化成DNA 雙鏈，對(duì)其片段大小進(jìn)行篩選和純化，最終形成片段大小為（300±50）bp 的文庫(kù)。最后，使用illumina NovaseqTM6000 按標(biāo)準(zhǔn)操作對(duì)其進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序模式為PE150。使用R 包對(duì)樣本之間進(jìn)行顯著差異分析，將差異倍數(shù)FC＞2倍或FC ＜0.5倍且P＜0.05的基因定義為差異基因，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠UI比較

見(jiàn)表1。造模過(guò)程中模型組和針刺組各有2 只大鼠掙脫束縛，故排除，最后納入6 只進(jìn)行比較。與空白組相比，模型組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)較空白組高（P＜0.01），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的胃潰瘍大鼠模型較理想。與模型組大鼠相比，電針組胃黏膜損傷指數(shù)有明顯降低（P＜0.01），說(shuō)明預(yù)電針干預(yù)可使SGU 大鼠胃黏膜損傷指數(shù)降低。

表1 各組大鼠UI比較（mm，±s）

表1 各組大鼠UI比較（mm，±s）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01。

UI 0.00±0.00 17.52±2.05**9.46±1.52△△組 別空白組模型組電針組n8 6 6

2.2 各組大鼠胃組織大體形態(tài)比較

見(jiàn)圖1?？瞻捉M胃黏膜肉眼可見(jiàn)光滑完整，顏色呈淡粉色；模型組可見(jiàn)多處出血點(diǎn)（如圖2 模型組黑色箭頭所示），且出血點(diǎn)大小形態(tài)不一。電針組與模型組相比其出血點(diǎn)面積較小，且分布較散（如圖1 電針組黑色箭頭所示）。

圖1 各組大鼠胃組織肉眼大體形態(tài)比較

圖2 各組大鼠胃組織病理結(jié)果比較（HE染色，200倍）

圖3 各組小鼠差異基因表達(dá)的影響比較

2.3 各組大鼠胃組織病理觀察結(jié)果比較

見(jiàn)圖2?？瞻捉M大鼠胃組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)光滑完整、排列整齊有序。模型組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)破損，細(xì)胞排列雜亂無(wú)序，細(xì)胞內(nèi)多處可見(jiàn)充血、毛細(xì)血管出血，在擴(kuò)張的血管內(nèi)可見(jiàn)大量胞漿紅染。電針組胃組織表面有部分脫落，上皮細(xì)胞受損部位表淺且范圍較小，細(xì)胞內(nèi)充血情況較模型組明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少（如圖2黑色箭頭所示）。

2.4 各組大鼠胃組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.4.1 差異基因表達(dá)篩選 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，我們以差異倍數(shù)FC≥2 或FC≤0.5（即log2FC 的絕對(duì)值≥1）且P＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為由此篩選出的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。測(cè)序結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，篩選出的顯著差異基因共1 161 個(gè)，其中上調(diào)基因555個(gè)，下調(diào)基因606 個(gè)，排名前10 的基因見(jiàn)表2。電針組與模型組比較，篩選出的顯著性差異基因共51 個(gè)，其中上調(diào)基因23個(gè)，下調(diào)基因28個(gè)，排名前10的基因見(jiàn)表3。電針組與空白組比較，篩選出的顯著性差異基因共有1 595 個(gè)，其中上調(diào)基因853 個(gè)，下調(diào)基因742 個(gè)，排名前10 的基因見(jiàn)表4。同時(shí)統(tǒng)計(jì)了3 組比較的差異基因，共有7個(gè)，基因名分別為L(zhǎng)OC108348108、LOC299282、Crabp2、Elovl6、RT1-CE10、Steap4、Pfkfb3。

表2 模型組與空白組顯著性差異基因（top10）

表3 電針組與模型組顯著性差異基因（top10）

表4 電針組與空白組顯著性差異基因（top10）

2.4.2 差異基因的GO 富集分類(lèi)分析 對(duì)各組的差異基因進(jìn)行GO富集分析，以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GO富集分析主要包括生物過(guò)程（Biological Process）、細(xì)胞組成（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）。由于在生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能這3 種GO function 上富集的GO Term 數(shù)目比較多，無(wú)法把所有的注釋結(jié)果都展示在一張圖中，因此3 種GO function 我們根據(jù)注釋到GO Term 的差異基因數(shù)目由大到小降序排列，分別挑選Top25、Top15、Top10的GO Term進(jìn)行繪圖展示。通過(guò)GO 富集分析可以看出，電針組和空白組相比，差異基因在細(xì)胞組成中有487 條差異基因富集于細(xì)胞膜（membrane），在分子功能有306 條差異基因富集于蛋白結(jié)合（protein binding），在生物過(guò)程中有112 條差異基因富集于生化過(guò)程（biological_process）圖4b 得到的共表達(dá)差異基因在細(xì)胞組成中富集最多的是細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm），為12 條，而在分子功能中8 條差異基因具有蛋白結(jié)合（protein binding）功能，在生物過(guò)程中差異基因聚集最多的兩個(gè)類(lèi)群是翻譯（translation）和氧化還原（oxidation-reduction process），均為4 條。圖4c 得到的共表達(dá)差異基因在細(xì)胞組成中富集最多的是細(xì)胞膜，有373 條，在分子功能中差異基因聚集最多的兩個(gè)類(lèi)群是蛋白結(jié)合（protein binding）和金屬離子結(jié)合（metal ion binding），分別為221和134條，在生物過(guò)程中富集最多的是生化過(guò)程和氧化還原2個(gè)類(lèi)群，分別為79、72條。

圖4 差異基因GO富集分析

2.4.3 差異基因的KEGG 代謝通路富集分析 對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本KEGG 通路進(jìn)行分析，根據(jù)KEGG 富集的顯著性（pvalue）取Top20 的pathway 進(jìn)行氣泡圖繪圖展示（如圖5 所示）。其中電針組與空白組相比差異轉(zhuǎn)錄本共富集到301條通路，其中排名前5的分別為癌癥通路（Pathways in cancer）、單純皰疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）、人乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）?？瞻捉M與模型組相比差異轉(zhuǎn)錄本共富集到290 條通路，其中排名前5 的分別是癌癥通路（Pathways in cancer）、單純皰疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）、人類(lèi)乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和受體相互作用（Cytokinecytokine）。電針組與模型組相比差異轉(zhuǎn)錄本共富集到66 條通路，其中排名前5 的分別為雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、抗原處理及呈遞（Antigen processing and presentation）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、細(xì)胞黏附分子（Cell adhesion molecules）和內(nèi)吞作用（Endocytosis）。

圖5 各組差異基因KEGG富集分析

3 討 論

SGU 發(fā)病機(jī)制尚不明確，且因其病程較長(zhǎng)沒(méi)有特效藥，所以臨床上有效的治療手段較少。中醫(yī)藥治療SGU多以辨證施治，調(diào)和臟腑機(jī)能，以達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。該病病位在胃，與肝脾相關(guān)，病性多為本虛標(biāo)實(shí)，治療以條暢氣機(jī)、補(bǔ)益氣血為主。針灸以其簡(jiǎn)便易行、安全性高、價(jià)廉效優(yōu)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在治療此類(lèi)疾病上具有明顯優(yōu)勢(shì)，其治療原則為調(diào)和氣血、緩急止痛、疏通經(jīng)脈，治療機(jī)理與發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，主要通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、平衡胃黏膜損傷因子和防御因子的相互關(guān)系從而影響SGU，緩解其癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中選取足三里和內(nèi)關(guān)穴，進(jìn)行按部位上下取穴法。足三里為胃經(jīng)下合穴，具有通降腑氣、扶正祛邪、培補(bǔ)中焦、運(yùn)脾和胃、行氣活血的作用。下合穴是六腑之氣輸注出入的部位，依據(jù)“合治內(nèi)腑”“合主逆氣而泄”“肚腹三里留”的理論可知下合穴用于治療腑病，其中足三里是治療胃腑病的主穴。內(nèi)關(guān)穴為心包經(jīng)絡(luò)穴，又是八脈交會(huì)穴，聯(lián)絡(luò)三焦，通于陰維脈。內(nèi)關(guān)穴可調(diào)暢三焦氣機(jī)，和胃止痛，尤對(duì)氣滯血瘀證之胃脘痛效果更佳［6］。另外，內(nèi)關(guān)穴?？膳c足三里穴合用，調(diào)理脾胃。

本研究通過(guò)構(gòu)建空白組、模型組、電針組胃組織的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，獲得全部基因表達(dá)譜，并對(duì)差異基因進(jìn)行分析，針對(duì)這些差異基因進(jìn)行了GO 功能分類(lèi)，KEGG代謝通路分析，通過(guò)其分析結(jié)果并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在富集通路中與應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的通路有PI3K/Akt 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路［7-11］。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶［12］，Akt 是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡等過(guò)程［13］，PI3K 由催化亞基p110 與調(diào)節(jié)亞基p85 構(gòu)成，其被激活時(shí)，p110 可誘導(dǎo)PIP2 轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP3 與Ak 結(jié)合促使其活化［14-15］，PI3K、Akt 基因及蛋白異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡并推動(dòng)胃潰瘍疾病進(jìn)展。MAPK 通路主要參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和損傷反應(yīng)，通過(guò)干擾基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞増殖、分化和凋亡等，可在傷害性刺激、生長(zhǎng)因子及炎癥介質(zhì)等因素影響下被激活，參與多種神經(jīng)病理痛的形成［16］。

有研究表明理中湯可明顯降低胃潰瘍大鼠血清炎癥水平，下調(diào)大鼠胃組織PI3K、Akt 蛋白表達(dá)，可能與調(diào)控PI3k/Akt 通路有關(guān)［17］；也有研究認(rèn)為，PI3K、Akt基因及蛋白表達(dá)水平異常會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放并誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而加重胃潰瘍病情。PI3K/Akt信號(hào)通路及其上下游分子可能是治療各種炎癥性疾病的靶點(diǎn)［18］。研究表明［19］，p38 MAPK 在被急、慢性炎癥激活以后，可以改變多種細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而影響炎癥病變的預(yù)后；也有研究［20-21］顯示白及多糖可通過(guò)下調(diào)P38 MAPK 基因和蛋白表達(dá)水平，抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）異常分泌而發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)鐵皮石斛多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，降低炎性因子，從而減輕無(wú)水乙醇引起的胃潰瘍損傷［22］。因此，根據(jù)本次研究的結(jié)果，推斷電針對(duì)胃潰瘍的治療可能通過(guò)PI3K-/AKT、MAPK 等信號(hào)通路的介導(dǎo)，從而對(duì)SGU起治療作用。

綜上，本研究觀察電針干預(yù)后對(duì)SGU 模型大鼠的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析其相應(yīng)基因的表達(dá)情況，從基因水平上預(yù)測(cè)了SGU 的形成以及針刺對(duì)胃潰瘍治療的可能作用途徑，為進(jìn)一步解析電針?lè)乐蜸GU 的分子機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究仍存在不足之處，由于此次研究主要是采用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，大量的數(shù)據(jù)結(jié)果是基于計(jì)算機(jī)與數(shù)學(xué)的統(tǒng)計(jì)功能進(jìn)行的預(yù)測(cè)分析，未通過(guò)RT-PCR 等技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性，這也是本課題組接下來(lái)需要完成的工作內(nèi)容，同時(shí)還需要對(duì)發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵信號(hào)通路及其靶點(diǎn)進(jìn)行更全面、更深層次的探究。