岑紅霞 蔡思銘 姜虹羽 廖趙妹

HbE/β-地中海貧血(HbE/β-thal)是一種發(fā)病率與死亡率均較高的血液疾病,在全球3億血紅蛋白病患者中,HbE/β-thal約有100萬(wàn)例,患者往往表現(xiàn)出身體發(fā)育缺陷、嚴(yán)重的慢性貧血,常因并發(fā)心血管疾病和嚴(yán)重感染后死亡[1]。HbE/β-thal患者異常紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)的清除主要是通過(guò)活化的單核細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn),是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分[2,3]。近年來(lái),miRNA在單核細(xì)胞活化和吞噬功能方面的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注。Kuno等[4]研究表明miR-125b在β-thal患者的CD14標(biāo)記陽(yáng)性外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中表達(dá)水平升高,且其表達(dá)量與PBMC的吞噬活性呈正相關(guān),并與貧血嚴(yán)重程度的指標(biāo)。另一項(xiàng)研究指出miR-125b的表達(dá)水平還與巨噬細(xì)胞分化及吞噬活性有關(guān)[5]?？梢?jiàn)miR-125b在活化單核細(xì)胞中的表達(dá)可能是一種與β-thal患者貧血嚴(yán)重程度相關(guān)的遺傳修飾,但其作用機(jī)制仍不清楚。BTB結(jié)構(gòu)域和CNC同系物1(BTB domain and CNC homolog 1,BACH1)是一種調(diào)控多基因表達(dá)的血紅素結(jié)合因子,在血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的調(diào)節(jié)中起重要作用[6]。HO-1在應(yīng)激狀態(tài)下誘導(dǎo)血紅素降解,并具有抗炎、抗氧化與凋亡特性,而B(niǎo)ACH1是眾所周知的HO-1抑制劑[7,8]。血紅素-BACH1/HO-1轉(zhuǎn)錄激活途徑為細(xì)胞環(huán)境提供了一種保護(hù)機(jī)制,當(dāng)血紅蛋白產(chǎn)生組裝活躍時(shí),在紅系分化期間維持平衡的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[9]。Srinoun等[10]研究發(fā)現(xiàn),HbE/β-thal患者PBMC內(nèi)miR-155表達(dá)上調(diào)、BACH1表達(dá)減少和PBMC吞噬活性增加有關(guān),并指出活化的PBMC中miR-155通過(guò)調(diào)節(jié)BACH-1導(dǎo)致吞噬活性的增強(qiáng),為HbE/β-thal異常RBC的吞噬清除提供了新的見(jiàn)解。研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p與BACH1存在靶向結(jié)合位點(diǎn),由此推測(cè)miR-125b-5p有可能是通過(guò)BACH1/HO-1軸增強(qiáng)了單核細(xì)胞吞噬功能[10]。為驗(yàn)證該推測(cè),本研究收集了健康兒童與HbE/β-thal患兒的外周血,分離PBMC測(cè)定其中miR-125b-5p表達(dá)量,分析其與PBMC表型及吞噬活性的關(guān)系,并采用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-125b-5p與BACH1/HO-1軸在HbE/β-thal-PBMC中的作用,以期能進(jìn)一步豐富對(duì)HbE/β-thal疾病發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院收治的15例HbE/β-thal患兒作為研究對(duì)象,均經(jīng)基因檢測(cè)、血紅蛋白分析等實(shí)驗(yàn)室檢查首次診斷為HbE/β-thal,未接受過(guò)輸血與切除術(shù)等治療,年齡≤16歲。另外選取15例健康兒童作為對(duì)照,所有參與研究的兒童家長(zhǎng)知情并同意。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)審批。2組兒童年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),HbE/β-thal患兒RBC、Hb、Hct、MCV、MCH均低于健康兒童(P<0.05),而RDW高于健康兒童(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組受試者臨床資料比較 n=15,

1.2 細(xì)胞與試劑 HEK293細(xì)胞及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司,10% FBS 購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、CFSE 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)GE公司,CD14/CD16微珠購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司, RT-PCR試劑、2×qPCR MasterMix Plus定量PCR試劑、miScript II RT 試劑盒、miScript SYBR green PCR試劑均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司,BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司,熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)購(gòu)自北京普洛麥格公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè):收集所有參與研究?jī)和诳崭範(fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血于EDTA管,使用全自動(dòng)血液分析儀(邁瑞B(yǎng)C-30)檢查血常規(guī),包括RBC數(shù)量、紅細(xì)胞壓積(hematocrit,Hct)、平均紅細(xì)胞體積(mean red blood cell volume,MCV)、平均血紅蛋白含量(Mean hemoglobin content,MCH)、紅細(xì)胞體積分布寬度(red blood corpuscular volume distribution width,RDW)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)等參數(shù)。血液涂片采用吉姆薩染色并用光學(xué)顯微鏡分析。

1.3.2 細(xì)胞分離:取EDTA管血樣在3 000 r/min離心5 min,從中分離棕黃血沉層和成熟RBC,采用密度梯度離心法分離PBMC,將血液用RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶1稀釋,室溫下在Ficoll上分層,400 g離心30 min,去上清,重懸細(xì)胞,400～500 g離心 15 min后去上清,重復(fù)2次,得到PBMC。通過(guò)CD14/CD16微珠與全自動(dòng)磁細(xì)胞分選儀MACS(德國(guó)Miltenyi公司)從PBMC中分離CD14+CD16+單核細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表型:將PBMC采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,分別加入Qdot 605-CD14、PE-Cy7-CD16抗體充分混勻后于4℃孵育30 min,PBS洗滌后加入緩沖液重懸,采用LSR-II-Fortessa流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD生物公司)基于CD14與CD16標(biāo)記對(duì)PBMC進(jìn)行分型:CD14hiCD16-、CD14hiCD16+與CD14lowCD16+ 。

1.3.4 QRT-PCR:TRIzol試劑提取總RNA,miR-125b-5p使用miScript Ⅱ RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、miScript SYBR green PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測(cè),BACH1 mRNA使用 RT-PCR試劑、2×qPCR MasterMix Plus 試劑進(jìn)行PCR檢測(cè),于熒光定量PCR儀7500(美國(guó)ABI公司)上采集數(shù)據(jù),采用2-ΔΔct的方法計(jì)算miR-125b-5p、BACH1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng):將突變/野生型 BACH1 mRNA 3′UTR區(qū)域載入pMIR報(bào)告質(zhì)粒的HindⅢ SpeI限制位點(diǎn),將0.2 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、0.2 μg含有Renilla熒光素酶的對(duì)照載體及50 nmol miR-125b-5p mimic/NC mimic共轉(zhuǎn)染至3×105個(gè)/ml的HEK293細(xì)胞中24 h,以Renilla熒光素酶活性作為內(nèi)參,計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot:RIPA液裂解細(xì)胞,BCA法測(cè)定蛋白濃度,取定量蛋白進(jìn)行蛋白凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色,5%脫脂奶粉封閉,加入一抗(抗BACH1/HO-1抗體)于4℃孵育過(guò)夜,使用凝膠成像分析儀WD-9413A(北京六一儀器廠)拍照并定量分析。

1.3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將NC mimic、miR-125b-5p mimic、pcDNA、pcDNA-BACH1分別轉(zhuǎn)染至健康兒童來(lái)源的CD14+ CD16+ 型PBMC中, NC inhibitor、miR-125b-5p inhibitor、siRNA、siRNA-BACH1分別轉(zhuǎn)染至HbE/β-thal患兒來(lái)源的CD14+ CD16+ 型PBMC中,轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)BACH1 mRNA表達(dá)量以確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.3.8 PBMC對(duì)RBC吞噬活性的測(cè)定:取1×106/ml的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)于添加了1%牛血清白蛋白R(shí)PMI1640培養(yǎng)基內(nèi)16 h,洗去未粘附細(xì)胞,將貼壁細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板,加入200 μl/孔培養(yǎng)基,37℃、5% CO2培養(yǎng)1 h,隨后取2 × 105個(gè)/孔的正常成熟RBC(以20 μmol/L的CFSE探針標(biāo)記)覆蓋培養(yǎng)2 h,加入生物素標(biāo)記抗CD14孵育30 min,使用LSR-II-Fortessa流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù),檢測(cè)吞噬活性為雙陽(yáng)性熒光。

2 結(jié)果

2.1 HbE/β-thal患兒PBMC激活表型特征 收集15名健康兒童與15例HbE/β-thal初診患兒的外周靜脈血,血液涂片染色后于顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)健康兒童外周血內(nèi)RBC呈大小均一的圓形,未見(jiàn)單核細(xì)胞吞噬現(xiàn)象,而HbE/β-thal患兒外周血內(nèi)存在較多大小不等、形態(tài)異常RBC,且偶見(jiàn)單核細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。健康兒童外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為(1.06±0.49)×109/L,HbE/β-thal患兒為(1.24±0.44)×109/L,2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但與健康兒童比較,HbE/β-tha患兒CD14hiCD16+表型PBMC比例增加(P<0.05),CD14hiCD16-與CD14lowCD16+表型PBMC比例無(wú)明顯變化(P>0.05)。表明,HbE/β-thal患兒存在外周血CD14hiCD16+型PBMC激活現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1 HbE/β-thal患兒PBMC激活表型特征;A健康兒童與HbE/β-thal患兒血液涂片觀察;B健康兒童與HbE/β-thal患兒外周血中單核細(xì)胞計(jì)數(shù);C流式細(xì)胞儀分析PBMC表型;D-F健康兒童與HbE/β-thal患兒CD14hiCD16-(D)、CD14hiCD16+(E)與CD14lowCD16+(F)表型PBMC比例的比較

2.2 HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)情況分析 HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)量顯著高于健康兒童(P<0.05);進(jìn)一步分析miR-125b-5p表達(dá)量與HbE/β-thal患兒病情參數(shù)及PBMC激活表型的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-125b-5p的表達(dá)與RBC計(jì)數(shù)、Hb含量、Hct、MCH均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與CD14hiCD16+比例呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)上調(diào),與HbE/β-thal患兒貧血嚴(yán)重程度及激活的單核細(xì)胞密切相關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2 HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)情況分析;A qRT-PCR檢測(cè)HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá); B～H HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)量與RBC計(jì)數(shù)(B)、Hb含量(C)、Hct(D)、MCV(E)、MCH(F)、RDW(G)、CD14hiCD16+比例(H)的關(guān)系

2.3 MiR-125b-5p與BACH1的靶向關(guān)系分析 miR-125b-5p與BACH1 mRNA 3’ UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn),于是針對(duì)該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)突變序列,雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證該靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,帶靶點(diǎn)突變序列的BACH1 與miR-125b-5p共轉(zhuǎn)染未降低熒光素酶活性(P>0.05),而野生型BACH1 與miR-125b-5p共轉(zhuǎn)染顯著降低了熒光素酶活性(P<0.05);采用miR-125b-5p mimic和miR-125b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,結(jié)果顯示,miR-125b-5p mimic能抑制BACH1表達(dá)(P<0.05),而miR-125b-5p inhibitor增強(qiáng)了BACH1表達(dá)(P<0.05)。隨后檢測(cè)了2組兒童PBMC中BACH1與其下游效應(yīng)蛋白HO-1的表達(dá)量,結(jié)果顯示,與正常兒童比較,HbE/β-thal患兒PBMC中BACH1表達(dá)量降低(P<0.05),而HO-1表達(dá)量升高(P<0.05)。推測(cè),miR-125b-5p可能通過(guò)BACH1/HO-1軸影響PBMC的激活。見(jiàn)圖3,表2～4。

圖3 MiR-125b-5p與BACH1的靶向關(guān)系分析;A Starbase 分析miR-125b-5p與BACH1 mRMA的靶向關(guān)系;B Western blot法測(cè)定miR-125b-5p mimic轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對(duì)BACH1表達(dá)的影響;C Western blot法測(cè)定miR-125b-5p inhibitor轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對(duì)BACH1表達(dá)的影響;D Western blot法測(cè)定2組兒童PBMC中BACH1與HO-1表達(dá)量

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 miR-125 mimic與inhibitor對(duì)HEK293細(xì)胞中BACH1表達(dá)的影響

表4 2組兒童PBMC中BACH1與HO-1表達(dá)量比較 n=15,

2.4 MiR-125b-5p通過(guò)抑制BACH1增強(qiáng)HbE/β-thal患兒?jiǎn)魏思?xì)胞吞噬活性 將miR-125b-5p mimic、pcDNA-BACH1轉(zhuǎn)染從健康兒童獲取的CD14hiCD16+型單核細(xì)胞,miR-125b-5p mimic抑制了BACH1 mRNA表達(dá)(P<0.05),并提高了HO-1的表達(dá)量(P<0.05),而pcDNA-BACH1的轉(zhuǎn)染抵消了miR-125b-5p mimic的作用(P<0.05);與此同時(shí),將miR-125b-5p inhibitor、siRNA-BACH1轉(zhuǎn)染HbE/β-thal患兒獲取的CD14hiCD16+型單核細(xì)胞,miR-125b-5p inhibitor增加了BACH1 mRNA表達(dá)(P<0.05),進(jìn)而抑制了HO-1的表達(dá)(P<0.05),siRNA-BACH1轉(zhuǎn)染也能抵消miR-125b-5p inhibitor的作用。隨后檢測(cè)其兩類(lèi)細(xì)胞對(duì)RBC的吞噬情況,結(jié)果顯示,miR-125b-5p mimic可以顯著增強(qiáng)健康兒童來(lái)源單核細(xì)胞對(duì)RBC的吞噬能力(P<0.05),而pcDNA-BACH1能逆轉(zhuǎn)該情況(P<0.05),同時(shí)miR-125b-5p inhibitor降低了具有高吞噬能力的HbE/β-thal患兒來(lái)源單核細(xì)胞對(duì)RBC的攝取能力(P<0.05),而siRNA-BACH1也能逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象(P<0.05)。由此可見(jiàn)miR-125b-5p通過(guò)抑制BACH1來(lái)增強(qiáng)HbE/β-thal患兒?jiǎn)魏思?xì)胞吞噬活性。見(jiàn)圖4,表5、6。

圖4 MiR-125b-5p通過(guò)抑制BACH1增強(qiáng)HbE/β-thal患兒?jiǎn)魏思?xì)胞吞噬活性;A Western blot檢測(cè)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)量;B 流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的CD14/CFSE標(biāo)記

表5 單核細(xì)胞中HO-1表達(dá)與CD14/CFSE標(biāo)記比較

表6 單核細(xì)胞中BACH1 mRNA表達(dá)量比較

3 討論

單核細(xì)胞通過(guò)感知局部環(huán)境清除病原體與死亡細(xì)胞、啟動(dòng)適應(yīng)性免疫、補(bǔ)充巨噬細(xì)胞,在炎癥與免疫防御的平衡中發(fā)揮了重要作用[11]。單核細(xì)胞能被異常RBC來(lái)源血紅素誘導(dǎo)發(fā)展為鐵循環(huán)巨噬細(xì)胞,并在與模式識(shí)別受體結(jié)合后激活,清除衰老和異常的RBC[12,13]。

單核細(xì)胞具有異質(zhì)性與分化可塑性,可以根據(jù)環(huán)境和/或接觸特定病原體后誘發(fā)的免疫反應(yīng)改變表型[14]。本研究中著重探討了miRNA-125b-5p對(duì)HbE/β-tha患兒中PBMC細(xì)胞表型及吞噬活性影響的機(jī)制。結(jié)果顯示,健康兒童與HbE/β-tha患兒PBMC數(shù)量上沒(méi)有明顯差異,但HbE/β-tha患兒CD14hiCD16+表型PBMC比例增加。人類(lèi)單核細(xì)胞被分為了三種亞型:其中經(jīng)典亞型CD14hiCD16-占據(jù)PBMC的80%～90%,中間亞型CD14hiCD16+與非經(jīng)典亞型CD14lowCD16+約占5%～10%[15,16]。CD14hiCD16+是具有較高的抗原遞呈能力,參與感染與炎癥的發(fā)展調(diào)控,同時(shí)具有促炎、吞噬及抗炎的作用,該表型PBMC比例的增加表示患兒體內(nèi)炎癥水平上升[17-19]。HbE/β-thal患兒PBMC內(nèi)miR-125b-5p表達(dá)量顯著高于健康兒童,相關(guān)性分析顯示miR-125b-5p的表達(dá)與RBC計(jì)數(shù)、Hb含量、Hct、MCH均呈負(fù)相關(guān),這些指標(biāo)均表示的是貧血的嚴(yán)重程度,說(shuō)明miR-125b-5p表達(dá)量隨著貧血嚴(yán)重程度的增加而增加;而miR-125b-5p表達(dá)與CD14hiCD16+比例呈現(xiàn)正相關(guān),提示miR-125b-5p的表達(dá)可能參與了CD14hiCD16+表型PBMC的激活。

隨后研究證實(shí)了miR-125b-5p能靶向抑制BACH1表達(dá),且在HbE/β-thal患兒PBMC中也能抑制BACH1表達(dá),而激活HO-1表達(dá)。HO-1已被確認(rèn)具有主要的免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性,而B(niǎo)ACH1是HO-1轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵抑制蛋白,因此miR-125b-5p可以間接上調(diào)HO-1表達(dá)[20-22]。同時(shí)研究觀察到,miR-125b-5p上調(diào)可以顯著增強(qiáng)健康兒童來(lái)源PBMC的吞噬能力,而同時(shí)上調(diào)BACH1能逆轉(zhuǎn)該情況,相反地,抑制miR-125b-5p能降低具有高吞噬能力的HbE/β-thal患兒來(lái)源PBMC的吞噬活性,而抑制BACH1能逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。雙向回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-125b-5p是通過(guò)抑制BACH1、上調(diào)HO-1來(lái)激活HbE/β-thal患兒CD14hiCD16+表型PBMC、并增強(qiáng)吞噬活性。

綜上所述,miR-125b-5p通過(guò)抑制BACH1來(lái)增強(qiáng)HbE/β-thal患兒?jiǎn)魏思?xì)胞吞噬活性。但由于單核細(xì)胞吞噬在HbE/β-thal中存在雙重作用:維持機(jī)體局部環(huán)境穩(wěn)定和可能造成溶血,如何通過(guò)上述靶標(biāo)調(diào)控PBMC吞噬活性并維持雙向平衡還有待研究。