陳勇 何冬雷 周江浩 梁月祥 楊丞

胃癌作為全球第四大常見惡性腫瘤和第三大癌癥相關(guān)死亡原因,手術(shù)是其唯一的根治性療法[1]。目前隨著手術(shù)技術(shù)的提高,早期胃癌患者5年生存率可達(dá)95%以上[2]。然而,胃癌患者的早期診斷率仍較低,意味著大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期,錯(cuò)過了最佳手術(shù)期。晚期胃癌的主要治療方法是新輔助放化療、分子靶向治療和免疫治療相結(jié)合,化療與靶向治療的聯(lián)合使用明顯延長了晚期胃癌患者的總生存期和生活質(zhì)量[3]。然而,胃癌細(xì)胞對化療藥物耐藥性的出現(xiàn)是臨床治療中的主要障礙,這可能導(dǎo)致預(yù)后不良。Numb是一種在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)的進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì),具有多種功能,例如調(diào)控細(xì)胞不對稱自我更新、分裂、增殖、遷移以及其他信號通路[4]。研究表明,Numb可能在各種腫瘤類型中發(fā)揮抑癌作用,例如肺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、乳腺癌等[5-8]。此外,已有研究表明,Numb在胃癌組織中表達(dá)水平下調(diào),其可作為一種潛在的抑癌基因并用于胃癌診斷中[9]。但關(guān)于其是否對包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞的化療敏感性產(chǎn)生影響筆者卻未見報(bào)道。鑒于此,本研究在檢測胃癌患者腫瘤組織內(nèi)Numb表達(dá)變化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究了Numb對化療藥物多柔比星(adriamycin,ADR)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡敏感性的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(武漢華爾納生物科技有限公司),多柔比星(ADR)(美國Sigma公司),胎牛血清、胰酶、RPMI 1640培養(yǎng)液及Polybrene(美國Gibco公司),Trizol、cDNA第一鏈合成試劑盒及熒光定量檢測試劑盒(日本Takara公司),Hoechst 33342染液(上海鈺博生物科技有限公司),Annexin V/FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物公司),RIPA裂解液、NP40裂解液和ECL發(fā)光液(上海碧云天生物研究所),PVDF膜(美國Millipore公司),BCA蛋白測定試劑盒(上海翊圣有限公司),Protein A+G Agarose(上海聯(lián)邁生物公司),一抗抗體Numb、ITGB1、P-gp、PARP、Cleaved-caspase3及Cleaved-caspase9(英國Abcam公司),GAPDH抗體與二抗抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。陰性對照慢病毒與Numb過表達(dá)慢病毒由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司完成載體構(gòu)建、包裝及滴度測定。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:在SGC-7901細(xì)胞中添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液并培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi),常規(guī)傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種在96孔板上,過夜培養(yǎng)后,分別將陰性對照慢病毒、Numb過表達(dá)慢病毒感染至SGC-7901細(xì)胞,感染復(fù)數(shù)設(shè)為100,并添加Polybrene增強(qiáng)感染效果,12 h后,更換為新鮮配制的培養(yǎng)液培養(yǎng),通過2 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選,獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC-7901細(xì)胞株。

1.2.2 Hoechst 33258染色:將SGC-7901細(xì)胞隨機(jī)分為4組進(jìn)行處理:①對照組:SGC-7901細(xì)胞正常培養(yǎng);②ADR組:使用100 nmol/L ADR處理SGC-7901細(xì)胞;③pLVX-Numb組:將Numb過表達(dá)慢病毒感染至SGC-7901細(xì)胞;④pLVX-Numb+ADR組:將Numb過表達(dá)慢病毒感染至SGC-7901細(xì)胞,再用100 nmol/L ADR處理該細(xì)胞。48 h后收集上述4組細(xì)胞,常規(guī)消化、離心,PBS重懸清洗細(xì)胞,加入5 mg/L的Hoechst 33342染液,置于37℃條件下避光孵育30 min,PBS再次洗滌細(xì)胞,離心并重懸,取適量細(xì)胞混懸液制片,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變情況。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù):收集細(xì)胞后常規(guī)消化、離心,PBS清洗,使用1×binding buffer重懸,調(diào)節(jié)密度為1×106個(gè)/ml,吸取100 μl懸液置于流式檢測管中,在管內(nèi)加入5 μl Annexin V/FITC與10 μl碘化丙錠,震蕩混勻,室溫孵育10 min,立即通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.2.4 Western blot法:在細(xì)胞中加RIPA裂解液提取上清,即獲得蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取等量40 μg蛋白經(jīng)過10%SDS-PAGE電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF膜,浸入5%脫脂奶粉封閉2 h。滴加稀釋的一抗,4℃孵育過夜。次日,TBST洗膜,將膜與HRP 標(biāo)記的二抗在室溫下共孵育1 h,TBST再次洗膜,ECL顯影、曝光,Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質(zhì)灰度值,選擇GAPDH抗體作為內(nèi)參蛋白,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):Trizol法提取細(xì)胞的總RNA,NanoDrop2000系統(tǒng)測定RNA濃度與純度。去除RNA中的gDNA后,參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成cDNA,保存于-20℃條件下。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)說明書步驟進(jìn)行,以cDNA為模板,配制擴(kuò)增反應(yīng)體系,在Bio-CFX96系統(tǒng)上測定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量,以內(nèi)參基因GAPDH對表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。

1.2.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞中加入NP40裂解液冰上裂解30 min,置于離心機(jī)上以12 000 r/min低溫離心20 min,吸取上清,移入干凈離心管內(nèi),加入Protein A+G Agarose,4℃條件下封閉2 h,排除非特異性結(jié)合蛋白。以12 000 r/min低溫離心10 min,吸取上清,加入ITGB1一抗抗體,IgG中加入等量同源IgG抗體,4℃條件下孵育過夜。次日,加入Protein A+G Agarose,4℃條件下繼續(xù)孵育4 h,以捕捉抗原-抗體復(fù)合物。再以12 000 r/min低溫離心10 min,棄去上清并保留沉淀,添加NP40蛋白洗脫液后離心,重復(fù)洗脫一次,加入上樣緩沖液,混勻,將蛋白加熱煮沸變性,通過Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 Numb對多柔比星處理下胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.1.1 熒光顯微鏡下觀察:對照組的SGC-7901細(xì)胞胞核外圍輪廓較為清晰,并且形態(tài)、大小一致,無明顯核濃縮現(xiàn)象;ADR組和pLVX-Numb組細(xì)胞出現(xiàn)較多濃縮、碎裂的藍(lán)色凋亡體,說明細(xì)胞凋亡數(shù)目較多;pLVX-Numb+ADR組中核濃縮與碎裂的細(xì)胞較pLVX-Numb組進(jìn)一步增加,說明該組細(xì)胞凋亡數(shù)目更多。見圖1。

圖1 4組SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察(Hoechst 33258染色×100)

2.1.2 與對照組比較,ADR組和pLVX-Numb組的細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.05);與ADR組比較,pLVX-Numb+ADR組細(xì)胞凋亡率則又顯著增加(P<0.05)。見圖2,表1。

表1 4組SGC-7901細(xì)胞凋亡率比較 %,

圖2 4組SGC-7901細(xì)胞凋亡率比較

2.2 Numb對多柔比星處理下胃癌細(xì)胞耐藥蛋白與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 與對照組比較,ADR組和pLVX-Numb組細(xì)胞內(nèi)P-gp和PARP蛋白相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白相對表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05);pLVX-Numb+ADR組細(xì)胞P-gp和PARP蛋白相對表達(dá)量又顯著低于ADR組(P<0.05),Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白相對表達(dá)量均顯著高于ADR組(P<0.05)。見圖3,表2。

表2 4組SGC-7901細(xì)胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)比較

圖3 4組SGC-7901細(xì)胞中P-gp、PARP、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白條帶

2.3 Numb1在蛋白翻譯后水平上調(diào)控ITGB1的表達(dá) 對照組、pLVX-NC組及pLVX-Numb組的SGC-7901細(xì)胞中ITGB1 mRNA相對表達(dá)量間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但pLVX-Numb組的SGC-7901細(xì)胞中ITGB1 蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組和pLVX-NC組的細(xì)胞中ITGB1 蛋白相對表達(dá)量(P<0.05)。SGC-7901細(xì)胞中內(nèi)源性Numb與內(nèi)源性ITGB1能夠形成復(fù)合物,發(fā)生免疫共沉淀;與對照組比較,pLVX-Numb組細(xì)胞中ITGB1蛋白泛素鏈明顯增強(qiáng),說明過表達(dá)Numb增加了ITGB1的泛素化水平。見表3,圖4、5。

表3 3組SGC-7901細(xì)胞中ITGB1 mRNA與蛋白表達(dá)比較

圖4 3組SGC-7901細(xì)胞中ITGB1蛋白條帶

3 討論

Numb定位于極化上皮細(xì)胞的基底層,介導(dǎo)細(xì)胞膜蛋白的內(nèi)吞作用和內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn),并涉及細(xì)胞多種生物學(xué)過程。越來越多的研究揭示了Numb與癌癥發(fā)展之間的關(guān)聯(lián),在各種癌癥類型中Numb表達(dá)降低甚至缺失,且這一現(xiàn)象與促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和干性維持等密切相關(guān)[10,11]。

已有研究表明,SRPK2通過負(fù)調(diào)控Numb和p53在結(jié)直腸癌中促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,并降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對吉西他濱或奧沙利鉑治療的化學(xué)敏感性[12],這一結(jié)果提示,Numb表達(dá)下調(diào)可能與化療敏感性降低也相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,在胃癌細(xì)胞中提高Numb表達(dá)可增強(qiáng)ADR處理下的細(xì)胞增殖抑制率,并促進(jìn)ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞內(nèi)P-gp和PARP蛋白表達(dá)并促進(jìn)Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)。

P-gp作為由多藥耐藥基因編碼的高分子量糖蛋白,其過表達(dá)是產(chǎn)生耐藥的重要原因之一,P-gp進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后與化療藥物分子結(jié)合,利用ATP水解產(chǎn)生的能量將藥物泵出細(xì)胞,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,抑制腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[13]。

PARP在DNA損傷后被激活,可結(jié)合到DNA斷裂部位,參與DNA雙鏈損傷修復(fù),目前以PARP為靶點(diǎn)開發(fā)抑制劑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤的潛在治療策略[14]。化療藥物通過作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA、酶及蛋白等靶分子來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,該作用依賴于Caspase途徑,因此,腫瘤細(xì)胞在化療過程中出現(xiàn)凋亡機(jī)制受阻亦可降低化療敏感性,Cleaved-caspase3與Cleaved-caspase9是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶,其切割水平可以反映細(xì)胞凋亡情況[15]。由此推測,Numb能夠促進(jìn)ADR誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡,提高胃癌細(xì)胞對ADR的化療敏感性。

ITGB1是構(gòu)成整合素的最大亞家族成員,是參與多種生理和病理生理過程的細(xì)胞表面受體,并且越來越多的證據(jù)表明,ITGB1在多種癌癥類型中有異常表達(dá),并通過介導(dǎo)細(xì)胞遷移、侵襲、存活以及凋亡促進(jìn)腫瘤的惡性表型[16,17]。此外,ITGB1還被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對多種抗癌藥物的耐藥性產(chǎn)生,例如,ITGB1通過介導(dǎo)Cdc42 激活PI3K/p110β 信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥性[18];另有證據(jù)表明抑制 ITGB1能夠增強(qiáng)西妥昔單抗對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用,提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗的敏感性進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)ITGB1不僅在胃癌組織內(nèi)高表達(dá),且在胃癌細(xì)胞中提高Numb表達(dá)后抑制了ITGB1表達(dá),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)源性Numb與ITGB1能夠形成復(fù)合物,此外,過表達(dá)Numb增加了ITGB1的泛素化水平而降低ITGB1蛋白表達(dá)水平。該結(jié)果提示,Numb提高胃癌細(xì)胞對ADR敏感性的作用可能與其介導(dǎo)調(diào)控ITGB1蛋白表達(dá)相關(guān)。

綜上所述,本研究證實(shí)Numb能夠增強(qiáng)ADR對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用,促進(jìn)ADR誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡,從而提高了胃癌細(xì)胞對ADR敏感性,且Numb可以調(diào)控ITGB1蛋白表達(dá)水平,這可能與其發(fā)揮的作用相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為提高胃癌化療敏感性的臨床治療提供了一個(gè)新靶點(diǎn)。