陳東 王立津

與牙周炎癥關(guān)系密切的主要細(xì)胞因子中,白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)參與并促進(jìn)了牙周組織特別是牙槽骨的一系列破壞活動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn),IL-6不僅可以通過(guò)作用破骨細(xì)胞前體刺激破骨細(xì)胞的形成,還可以通過(guò)刺激成骨細(xì)胞系表達(dá)RANKL,進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成,其中相關(guān)機(jī)制為IL-6通過(guò)激活Janus 激酶 2(janus kinase 2,JAK2)和人核因子KB受體活化因子配體(human nuclear factor KB receptor activator ligand,RANKL)信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)并增加破骨細(xì)胞分化[1]。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn),唾液中的IL-6水平與C-反應(yīng)蛋白、牙齒數(shù)量、臨床附著喪失(CAL)、牙周袋深度(PPD)和出血部位(FMB)呈負(fù)相關(guān);而牙周炎患者的唾液IL-6水平與口腔牙齒數(shù)量呈負(fù)相關(guān),直接與牙周炎的患病范圍呈正比例相關(guān)[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),阻斷IL-6受體(IL-6R)就可以抑制減少IL-6介導(dǎo)的促炎活性導(dǎo)致的牙槽骨吸收和附著喪失[3]。國(guó)外報(bào)道殼聚糖阿托伐他汀凝膠在體外細(xì)胞模型研究中可以降低IL-6的表達(dá)水平[4],在大鼠牙周炎模型的結(jié)果與體外細(xì)胞模型結(jié)果一致[5]。國(guó)內(nèi)也開展過(guò)羧甲基殼聚糖與IL-6表達(dá)的體外細(xì)胞模型研究[6]。作者前期開展了有關(guān)甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel,M/CMCS)對(duì)大鼠牙周炎模型破骨細(xì)胞和前列腺素E2影響的研究,發(fā)現(xiàn)試藥能夠減輕大鼠牙周炎癥、減少骨吸收、促進(jìn)愈合[7]。本研究考察M/CMCS治療大鼠牙周炎模型過(guò)程中IL-6的相關(guān)表達(dá)變化情況。依照本文作者的前次相關(guān)研究方法[7,8],適當(dāng)予以改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材 麻醉劑2%戊巴比妥鈉;Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);大鼠IL-6 ELISA試劑盒和IL-6免疫組化檢測(cè)試劑盒(均為武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司產(chǎn)品)。

1.2 試驗(yàn)藥物 參照本實(shí)驗(yàn)室前次辦法,自制甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝(含0.75%甲硝唑和20%羧甲基殼聚糖)[8];0.75%甲硝唑凝膠(湖北康正藥業(yè)有限公司)和2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏(日本Sunstar株式會(huì)社,商品名:PERIO?,均商業(yè)采購(gòu)。

1.3 動(dòng)物建模與分組 動(dòng)物模型建立參照本組前次方法進(jìn)行[7,8]。SPF級(jí)75只,8周齡,體重(275±25)g,健康雄性SD大鼠,購(gòu)自華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,在2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后,在大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙齦緣處腭側(cè)打結(jié)結(jié)扎結(jié)扎絲,然后1次/d,連續(xù)3次密度為1×109CFU/ml的200 μl的牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)牙周接種,給與10%葡萄糖飲水。造模后每周檢查1次,第6周結(jié)束前檢查牙周情況,并隨機(jī)抽取3只大鼠施行安樂(lè)死,X線片和HE病理學(xué)檢查評(píng)估。模型成功判定參照文獻(xiàn)與作者過(guò)去的造模標(biāo)準(zhǔn)[9,10]。結(jié)果顯示模型全部成功。然后將剩下72只大鼠隨機(jī)分為4大組,每組18只。MODEL組:陽(yáng)性模型對(duì)照組,上頜第一磨牙齦緣處和牙周袋不涂布任何藥物;M/CMCS組:涂布自制的甲硝唑羧甲基殼聚糖溫敏凝膠;PERIO組:涂布2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏;MNZ組:涂布0.75%甲硝唑凝膠。局部早晚各涂藥1次,持續(xù)至各組動(dòng)物在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),即涂藥開始后滿1周(第8天),滿3周(第22天)和滿5周(第36天),各組分別隨機(jī)抽取6只大鼠,麻醉狀態(tài)下采集全血,然后實(shí)施安樂(lè)死,分離截取上頜骨。一側(cè)上頜骨組織塊供ELISA實(shí)驗(yàn),后續(xù)處理方法見(jiàn)1.4.3;對(duì)側(cè)上頜骨供免疫組化實(shí)驗(yàn),具體方法見(jiàn)1.5 的IL-6免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)部分。

1.4 ELISA法檢測(cè)組織樣本的IL-6濃度

1.4.1 齦溝液測(cè)試樣本制備:在治療開始期滿的第1、3、5周計(jì)劃時(shí)間點(diǎn),依既往辦法采集每組抽取的6只大鼠齦溝液[7]。

1.4.2 全血測(cè)試樣品制備:各時(shí)間點(diǎn)、每組采集齦溝液結(jié)束后的6只大鼠,麻醉狀態(tài)下無(wú)菌切開腹腔,在脊柱下段旁側(cè)用負(fù)壓抗凝管穿刺采取腹主動(dòng)脈血5 ml,低溫離心5 min,取上清液放-80℃冰箱凍存、待測(cè)。

1.4.3 上頜骨牙周軟、硬組織取材與標(biāo)本制備:全血采集后,脊椎脫臼法處死大鼠,剝離完整上頜骨及附帶牙周軟組織,上頜骨截?cái)嘧笥?段,分為2組。一側(cè)頜骨放入4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液中固定,制作石蠟切片供IL-6免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。另一側(cè)頜骨,在拔牙后分離牙槽窩周邊厚約2 mm范圍軟組織(每樣本≥50 mg),置無(wú)菌凍存管液氮冷凍;牙槽骨每樣本≥30 mg標(biāo)記后也立即液氮冷凍,供裂解蛋白提取。

1.4.4 牙周組織與牙槽骨總蛋白提取:分別取出稱重的軟組織和牙槽骨凍存管,置液氮缽中2 min內(nèi)快速加液氮、磨成細(xì)粉末。粉末入離心管后按照20 mg組織配200 μl的比例加入Western及IP細(xì)胞裂解液混勻,冰浴、低溫離心得上清液,轉(zhuǎn)移上清液即分別得到牙周和骨組織總蛋白提取物,分裝標(biāo)記后-80℃冰箱保存。

1.4.5 ELISA法分析IL-6濃度:分別取前述制備凍存的大鼠齦溝液、全血、牙周組織與牙槽骨總蛋白提取上清液標(biāo)本,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)標(biāo)本中IL-6的含量。嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作,終止反應(yīng)后以酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處空白對(duì)照孔調(diào)零后,測(cè)各孔OD值,標(biāo)準(zhǔn)曲線求方程式,計(jì)算濃度。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-6表達(dá) 前述1.3處固定的頜骨組織塊,常規(guī)脫鈣脫水包埋制作石蠟塊,沿上頜骨長(zhǎng)軸作矢狀連續(xù)5 μm切片,取最佳取材位點(diǎn)基本相同位置制備切片備用。按照大鼠白介素IL-6免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。脫水后封片。先用4 X光鏡觀察,然后換400 X采集圖像進(jìn)行定量分析,每張切片中各選取5個(gè)面積相同的視野拍攝圖片Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)處理,計(jì)算平均光密度值(mean optical density,MOD)。

2 結(jié)果

2.1 4種不同樣本的IL-6濃度比較

2.1.1 齦溝液:MODEL組在第1、3、5周3時(shí)間點(diǎn)的IL-6濃度變化不大(P>0.05),藥物干預(yù)后,則M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1周、第3周和第5周較MODEL組同期均明顯下降(P<0.05);3治療組間比較,M/CMCS組和PERIO組的IL-6濃度值在第1、3、5周時(shí)間點(diǎn)均分別比MNZ組同期的濃度值低(P<0.05),在第5周時(shí)間點(diǎn),M/CMCS組IL-6濃度值比PERIO組低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同藥物對(duì)大鼠齦溝液中IL-6影響 n=6,pg/mL,

2.1.2 牙周軟組織:M/CMCS組、PERIO組和MNZ組各組內(nèi)的IL-6濃度值,在各組組內(nèi)第3周和第5周分別較第1周明顯降低(P<0.05);與MODEL組IL-6濃度比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低(P<0.05);M/CMCS組與PERIO組在第3周和第5周均較同期MNZ組為低(P<0.05);M/CMCS組在第5周時(shí)低于PERIO組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同藥物對(duì)大鼠牙周軟組織組織中IL-6的影響 n=6,pg/ml,

2.1.3 牙槽骨:與MODEL組比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1、3、5周各時(shí)間點(diǎn)的IL-6濃度均降低(P<0.05)。M/CMCS組與PERIO組的IL-6濃度值在第1周、第3周和第5周,均分別較MNZ組低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同藥物對(duì)大鼠牙槽骨中IL-6的影響 n=6,pg/ml,

2.1.4 全血血清:M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在第1、3、5周時(shí)間點(diǎn)分別較MODEL組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但M/CMCS組、PERIO組和MNZ組在相同時(shí)間點(diǎn)的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同藥物對(duì)大鼠全血中IL-6的影響 n=6,,pg/ml

2.2 4組內(nèi)不同組織樣本的IL-6濃度比較 M/CMCS組、PERIO組和MNZ組,齡溝液、牙周軟組織和牙槽骨的IL-6濃度在第3、5周時(shí),均低于第1周(P<0.05);PERIO組牙周組織在第3周和第5周時(shí)均高于牙槽骨(P<0.05),MNZ組第3周時(shí)牙周組織的值高于牙槽骨(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 4組不同樣本組織的IL-6濃度結(jié)果比較 n=6,pg/ml,

2.3 牙周組織IL-6的免疫組織化學(xué)結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn),MODEL組牙周組織毀損嚴(yán)重,齦乳頭潰爛且牙周袋異常明顯,附著嚴(yán)重喪失,牙槽骨水平型吸收至根尖;M/CMCS組可見(jiàn)牙齦乳頭形態(tài)較完整且染色明顯局限在上皮組織,牙周袋淺且遠(yuǎn)中健康牙一側(cè)牙周袋較結(jié)扎側(cè)明顯淺,且結(jié)合上皮未見(jiàn)明顯向根部方向退宿,齦牙結(jié)合點(diǎn)較對(duì)側(cè)少許降低但不明顯,齦乳頭下的牙齦纖維致密有序,未見(jiàn)明顯牙槽骨吸收;PERIO組牙周軟組織輕度損傷,但牙槽骨水平型吸收較M/CMCS組嚴(yán)重;MNZ組齦乳頭形態(tài)受損,齦乳頭消失,齦乳頭下的牙齦纖維少許紊亂水腫,結(jié)合上皮附著向根部部分退縮,牙槽骨水平伴垂直線吸收、面積大且深,染色較深。見(jiàn)圖1。

圖1 第5周試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠牙周組織IL-6的免疫組織化學(xué)染色(n=6);淺黃色、棕黃色表示陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度;B:牙槽骨;P:牙周膜;R:牙根

2.4 不同藥物對(duì)大鼠牙周組織的IL-6免疫組化MOD值的影響 MODEL組IL-6一直處于較高的水平且未隨時(shí)間產(chǎn)生明顯變化;與MOPEL組各相同時(shí)間點(diǎn)比較,M/CMCS組、PERIO組和MNZ組分別在第1、3、5周下降明顯(P<0.05),但MNZ組的值又明顯高于其他2組(P<0.05);在第5周時(shí),M/CMCS組的值也低于PERIO組(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 不同時(shí)間點(diǎn)牙周組織IL-6表達(dá)水平(MOD值) n=6,

3 討論

現(xiàn)在普遍認(rèn)為IL-6是破骨細(xì)胞骨吸收的促進(jìn)劑,在慢性和急性炎癥包括牙周炎的過(guò)程中參與骨丟失的發(fā)病機(jī)制[10,11]。此外,IL-6中和抗體抑制TNF-α和IL-1β刺激的破骨細(xì)胞形成[12]。在牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,IL-6與牙槽骨的代謝關(guān)系密切,也是破骨細(xì)胞分化和骨吸收的有效刺激因子。IL-6可刺激基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生破骨細(xì)胞生成因子RANKL,RANKL表達(dá)水平上調(diào)即會(huì)導(dǎo)致牙槽骨丟失[13]。牙周炎等一些炎癥性疾病過(guò)程中,IL-6水平升高[14],且與牙周炎的持續(xù)性牙周組織破壞相關(guān),IL-6表達(dá)強(qiáng)度與附著喪失呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的MODEL組,大鼠上頜骨牙周組織受損嚴(yán)重,牙槽骨呈現(xiàn)水平型吸收幾乎直達(dá)根尖部位,而IL-6在齦溝液、牙周軟組織和牙槽骨的濃度,并沒(méi)有隨著時(shí)間的推移而下降。表現(xiàn)為穩(wěn)定的表達(dá)值。但是,結(jié)果藥物干預(yù)后,IL-6的濃度值在牙周局部組織立即出現(xiàn)了明顯下降。免疫組化結(jié)果顯示,藥物治療后牙周組織的IL-6表達(dá)明顯受到抑制;形態(tài)學(xué)方面,牙齦和牙周膜纖維的損傷,特別是牙槽骨吸收,藥物干預(yù)均有不同程度的改善,顯示3種藥物局部治療均有效,其中MNZ組表現(xiàn)稍差,而M/CMCS組則優(yōu)勢(shì)明顯。

本動(dòng)物模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)齦溝液的IL-6表達(dá)水平較全血為高,但是比牙周組織為低,也存在第3周以后變化不明顯的情況,在未經(jīng)藥物干預(yù)的MODEL組,齦溝液的IL-6表達(dá)水平一直穩(wěn)定且較高。藥物干預(yù)后,同樣的,MNZ組的IL-6表達(dá)水平與其他2組藥物間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而M/CMCS組的結(jié)果最優(yōu)。

甲殼素作為牙周治療的局部藥物載體的研究越來(lái)越多,殼聚糖基生物支架能夠其可以加速新骨再生,促進(jìn)組織新生血管的形成[15]。采用不同類型的殼聚糖(堿溶性和水溶性)制備殼聚糖阿托伐他汀凝膠,體外研究制劑的抗炎作用,利用TNF-α誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞(hGF)模型作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,培養(yǎng)hGF細(xì)胞時(shí)加入殼聚糖阿托伐他汀凝膠后,測(cè)定促炎(IL-1β、IL-6、IL-8)和抗炎(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IL-10)細(xì)胞因子的釋放,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子包括IL-6的水平降低,殼聚糖的抗炎作用增強(qiáng)[4]。在大鼠牙周炎模型,同樣的殼聚糖制劑采用相同的細(xì)胞因子指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析,其結(jié)果與細(xì)胞模型較為一致[5]。國(guó)內(nèi)也開展過(guò)相似的體外細(xì)胞模型研究,發(fā)現(xiàn)不同濃度的羧甲基殼聚糖能夠下調(diào)同一濃度脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLFs)表達(dá)的IL-6,隨著羧甲基殼聚糖濃度增加,IL-6表達(dá)量呈逐漸減弱趨勢(shì)[6]。

總之, 通過(guò)本次三種不同藥物影響牙周炎模型大鼠的IL-6實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在齦溝液、牙周軟組織和牙槽骨,藥物干預(yù)后均出現(xiàn)了IL-6表達(dá)水平均減少的現(xiàn)象,且牙周組織病理形態(tài)較模型對(duì)照組均有不同程度的改善,其中,M/CMCS凝膠表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì),說(shuō)明甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠有一定的抑制牙周炎癥時(shí)相關(guān)組織分泌IL-6的作用,進(jìn)而發(fā)揮出保護(hù)牙周組織、減緩牙槽骨吸收的作用。