趙熙萌，張燕香，馬同輝，胡云富

（北京泛生子基因科技有限公司，北京 102206）

癌癥是一類(lèi)可發(fā)生于多種組織器官的，以細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖失控為主要特征的，由遺傳物質(zhì)改變所引起的疾病。癌癥發(fā)病的根本機(jī)制是多種因素共同作用導(dǎo)致的基因組DNA損傷和基因變異的積累[1]。導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變的因素十分復(fù)雜，包括接觸環(huán)境致癌物（如吸煙、飲酒、過(guò)度加工食物、大氣污染、電離輻射、紫外線等）[2-5]，免疫因素（如炎癥反應(yīng)）[6]，內(nèi)分泌因素（如高雌激素水平）[7]和遺傳因素（如胚系易感基因突變和表觀遺傳學(xué)改變）[8-9]。

對(duì)癌癥遺傳學(xué)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)水平很大程度上依托近幾十年來(lái)各類(lèi)DNA突變分析技術(shù)的高速發(fā)展，高通量測(cè)序或稱下一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)是此過(guò)程中的里程碑事件之一。相較于Sanger測(cè)序，NGS具有通量高、以DNA文庫(kù)代替細(xì)菌克隆的DNA片段、測(cè)序過(guò)程無(wú)需電泳3項(xiàng)重要優(yōu)勢(shì)[10]，極大地降低了測(cè)序所需的時(shí)間及人力成本，故在其發(fā)明后的近20年中獲得了大量推廣應(yīng)用，鑒定出大量疾病相關(guān)基因突變和染色體變異。NGS推動(dòng)癌癥研究及臨床診療進(jìn)入了基因組時(shí)代，也使得基于腫瘤突變特征的個(gè)性化醫(yī)療成為現(xiàn)實(shí)。

NGS在癌癥臨床中的應(yīng)用方式包括全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS）、全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）、靶向基因測(cè)序（targeted gene panel sequencing，TS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表觀遺傳測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序[11]。WGS、WES和TS在應(yīng)用層面上的主要區(qū)別為覆蓋范圍。WGS的覆蓋范圍是全基因組，覆蓋率約為95% ~98%[12]。WES和TS則分別需要在測(cè)序前針對(duì)全外顯子或依據(jù)具體需求選擇性地納入的目的基因，進(jìn)行DNA片段捕獲測(cè)序。由于人類(lèi)基因組僅有約2%為編碼序列，采用WES和TS有利于在節(jié)約成本的前提下增加測(cè)序深度，以保持測(cè)序的精準(zhǔn)和高效。在癌癥相關(guān)的商業(yè)化NGS應(yīng)用中，絕大多數(shù)產(chǎn)品均基于TS方法獲取癌癥相關(guān)基因序列或表觀遺傳信息。隨著近年來(lái)癌癥相關(guān)NGS檢測(cè)理論和技術(shù)的持續(xù)發(fā)展和快速推廣，其實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景已覆蓋癌癥早篩、術(shù)后微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）檢測(cè)、晚期癌癥患者的伴隨診斷等多個(gè)臨床階段（見(jiàn)圖1）。

圖1 NGS在癌癥各臨床階段中的相關(guān)應(yīng)用Figure 1 Related applications of NGS in each clinical stage of cancer

液體活檢是近年來(lái)開(kāi)始發(fā)展的新型癌癥檢測(cè)技術(shù)，即通過(guò)采集患者血液、尿液、胸腔積液、腦脊液、唾液或膽汁等體液，檢測(cè)其中包含的癌癥生物標(biāo)志物。液體活檢相比傳統(tǒng)組織活檢的優(yōu)勢(shì)主要為：1）取材的無(wú)創(chuàng)性或低創(chuàng)性，使其有利于在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。2）減少了傳統(tǒng)組織活檢中由腫瘤內(nèi)異質(zhì)性導(dǎo)致的取樣偏差，故能更好地反映腫瘤整體特征。液體活檢在血液中的分析目標(biāo)包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA （circulating tumor RNA，ctRNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、蛋白質(zhì)、外泌體以及代謝物。其中，外周血ctDNA檢測(cè)是目前較多采用的液體活檢方法。近期發(fā)表的一系列研究結(jié)果顯示，依據(jù)不同癌種獨(dú)特的液體分布特征進(jìn)行液態(tài)樣本活檢是有前景的癌癥診斷發(fā)展方向之一。例如針對(duì)腦脊液ctDNA的膠質(zhì)瘤分子檢測(cè)[13]；針對(duì)尿液細(xì)胞DNA突變和CpG甲基化尿路上皮細(xì)胞癌檢測(cè)[14]；針對(duì)腹膜灌洗液中的腫瘤細(xì)胞，采用個(gè)性化訂制基因panel預(yù)測(cè)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移和預(yù)后[15]；針對(duì)膽汁中的DNA突變和甲基化進(jìn)行胰膽管癌診斷等[16]。

ctDNA是循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）的一部分，一般長(zhǎng)度為132 ~ 145 bp，半衰期一般小于2 h。ctDNA主要由腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡和外分泌過(guò)程進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，其攜帶包括單堿基變異（single nucleotide variation，SNV）、甲基化、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）、結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SV）等腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)特征。在不同腫瘤類(lèi)型、腫瘤體積、腫瘤分期和多種其他因素的影響下，ctDNA含量在個(gè)體間或同一個(gè)體的不同疾病階段均存在巨大變化，其含量范圍可低于0.1%或大于90%[17]。在某些極端情況下，例如在攜帶有低于計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)（computer tomography，CT）分辨率的微小肺癌病灶患者血漿中，ctDNA在cfDNA中的等位基因頻率（allele frequency，AF）可低至0.000 18%[18]。大量源于正常細(xì)胞和白細(xì)胞的cfDNA會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此在檢測(cè)ctDNA時(shí)還需采用外周血白細(xì)胞作為對(duì)照以減少背景信號(hào)。即便如此，高度可變的ctDNA含量仍對(duì)NGS檢測(cè)的靈敏度提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。雖然面臨以上困難，但依賴于NGS檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和液體活檢的固有優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)基于NGS的ctDNA檢測(cè)方法發(fā)展迅速。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）多重?cái)U(kuò)增或雜交捕獲等高深度測(cè)序方法，NGS的ctDNA檢測(cè)極限（limit of detection，LOD）已可低至0.000 1%[19]，具備了相對(duì)于數(shù)字PCR（LOD約為0.1%）更高的靈敏度。

本綜述分別針對(duì)3個(gè)主要臨床階段的癌癥診療，即高危人群的臨床前早篩，術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后預(yù)測(cè)，以及晚期癌癥伴隨診斷，重點(diǎn)介紹近年來(lái)NGS在癌癥診療中的研究及應(yīng)用進(jìn)展，并討論其臨床價(jià)值和發(fā)展前景。

1 基于ctDNA的高危人群早期篩查

依據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在中國(guó)和全球發(fā)達(dá)國(guó)家中，癌癥已超過(guò)心血管疾病，成為導(dǎo)致過(guò)早死亡的最主要因素[20]。據(jù)最新研究估計(jì)，2022年中國(guó)的癌癥發(fā)病和死亡人數(shù)分別可達(dá)4 820 000人和3 210 000人[21]。癌癥的早期診斷是提高患者5年生存期的最重要因素，目前美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）或美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)（American Cancer Society，ACS）指南推薦的癌癥易患人群早期篩查方法包括針對(duì)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的超聲結(jié)合甲胎蛋白（AFP）檢測(cè)；針對(duì)肺癌的低劑量螺旋CT（lowdose helical computed tomography，LDCT）；針對(duì)結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的結(jié)腸鏡檢查；針對(duì)乳腺癌的乳腺X線攝影術(shù)；針對(duì)宮頸癌的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）檢測(cè)；針對(duì)前列腺癌的前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）檢測(cè)；針對(duì)子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)檢查[22]。以上傳統(tǒng)檢查方式的共同缺陷是覆蓋的癌種單一，靈敏度和特異性較低，且多為有創(chuàng)檢查，以致其難以廣泛應(yīng)用于目標(biāo)人群。ctDNA檢測(cè)僅需抽取少量外周血即可完成，目前在多個(gè)單一癌癥類(lèi)型檢測(cè)中已獲得相比傳統(tǒng)篩查方法更高的靈敏度和特異性[23-24]，且具有同時(shí)對(duì)多個(gè)癌種進(jìn)行篩查的能力。ctDNA檢測(cè)的主要生物標(biāo)記包括以下3類(lèi)：1）針對(duì)ctDNA序列突變的測(cè)序和分析；2）針對(duì)以甲基化為主的ctDNA表觀遺傳特征的測(cè)序和分析； 3）針對(duì)cfDNA片段長(zhǎng)度特征的分析。目前，血漿或血清ctDNA含量與早期癌癥的準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)關(guān)系尚不清楚，主流的分析方法通常依賴機(jī)器學(xué)習(xí)建模，并通過(guò)算法優(yōu)化和同時(shí)納入分析多種類(lèi)型的ctDNA特征以提高結(jié)果準(zhǔn)確性。下文選取了HCC、肺癌、CRC這3個(gè)在液體活檢早篩應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)展較快的癌種，結(jié)合與傳統(tǒng)篩查方法的對(duì)比，介紹此ctDNA檢測(cè)技術(shù)的最新進(jìn)展。

1.1 肝細(xì)胞癌

HCC是全球致死人數(shù)排第3位的癌癥[25]。目前針對(duì)HCC的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為影像學(xué)檢查，包括CT、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）結(jié)合血清AFP水平測(cè)定，但以上方法具有明顯局限性。AFP水平作為診斷標(biāo)志物的靈敏度僅為62.4%，易造成假陰性診斷[26]。影像學(xué)檢查的靈敏度和特異性分別約為82%和90%，但僅能檢出直徑大于1cm的病灶[27]。肝臟是人體產(chǎn)生cfDNA最多的器官之一，相應(yīng)地，HCC也是所有癌癥中產(chǎn)生ctDNA最多的癌種[28]，這十分有利于采用ctDNA進(jìn)行HCC篩查?；赾tDNA的表觀遺傳學(xué)特征分析是目前HCC主要早篩方法，其靈敏度普遍高于基于突變特征的分析[29]，并可有效區(qū)分HCC與肝炎、慢性乙肝病毒感染（chronic hepatitis B virus infection，CHB）、肝硬化（liver cirrhosis，LC）等HCC相關(guān)早期病變，以減少過(guò)度診斷。

較早的一項(xiàng)以CpG甲基化作為標(biāo)記的研究采用715例HCC患者與560例健康受試者對(duì)照（healthy controls，HC），通過(guò)靶向重亞硫酸鹽測(cè)序獲取甲基化標(biāo)記信息，并以隨機(jī)森林和LASSO算法共同篩選出10個(gè)標(biāo)記并以此構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，最終在鑒定383例HCC患者與275例HC的模型性能驗(yàn)證中達(dá)到了靈敏度83.3%和特異性90.5%[30]。另一研究采用全基因組5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosines，5hmC）水平作為標(biāo)記，在訓(xùn)練集中納入具有CHB和LC病史的HCC患者335人，CHB或LC患者263人，以及HC 522人，分別針對(duì)HCC與HC和HCC與CHB/LC兩組間進(jìn)行多項(xiàng)邏輯回歸建模分析，鑒定出兩組間共有的32個(gè)HCC的標(biāo)記基因。該研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了wd-score（weighted diagnostic score）算法，依據(jù)32個(gè)標(biāo)記基因的回歸系數(shù)和5hmC值進(jìn)行HCC診斷。該算法在驗(yàn)證集中的靈敏度和特異性分別為82.7%和76.4%[31]。另一項(xiàng)于2021年發(fā)表的研究則同時(shí)采用了全基因組5hmC、核小體足跡（nucleosome footprint）、5’末端模體（5’end motif）和cfDNA片段化特征這4類(lèi)特征，并結(jié)合以上特征達(dá)到了目前基于NGS進(jìn)行HCC診斷的較高靈敏度和特異性，分別為95.8%和95.0%[32]。此外，Qu等[33]發(fā)表的HCCscreenTM技術(shù)是準(zhǔn)確性較高的HCC早篩方法，其通過(guò)檢測(cè)ctDNA中的一系列肝癌特征性突變，結(jié)合血清AFP和異常凝血酶原（DCP）及被測(cè)者性別和年齡，在針對(duì)HBsAg陽(yáng)性且AFP和超聲檢測(cè)陰性的無(wú)HCC癥狀人群前瞻性篩查中，靈敏度和特異性分別達(dá)到100%和94%。該團(tuán)隊(duì)最近發(fā)表的研究則采用了新技術(shù)MCP（mutation capsule plus），此項(xiàng)技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)為在一次反應(yīng)中同時(shí)獲取全基因組序列突變和甲基化信息，同時(shí)保持兩種檢測(cè)的高靈敏度。通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建基于突變結(jié)合甲基化的預(yù)測(cè)模型后，在驗(yàn)證集中區(qū)分HCC組與HC組的靈敏度和特異性分別達(dá)到90%和94%[34]。

1.2 肺癌

肺癌是全球造成死亡人數(shù)最多的癌癥[25]，主要分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。多數(shù)肺癌在出現(xiàn)癥狀并確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，是造成其高死亡率的主要原因。目前針對(duì)高危人群的肺癌早篩常規(guī)方法為低劑量螺旋CT（low-dose spiral CT，LDCT），可有效降低高風(fēng)險(xiǎn)人群死亡率，但其缺陷包括高達(dá)90%的假陽(yáng)性率[35]、具有一定的放射性危害和較低的普及程度。

2020年有研究者采用了基于雜交捕獲和NGS的癌癥個(gè)體化高深度測(cè)序方法（personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq)，整合了ctDNA的突變頻率、突變基因、片段長(zhǎng)度和CNV等信息，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建了lung-CLiP score預(yù)測(cè)模型；在98%特異性下，此方法在驗(yàn)證集中檢驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC的靈敏度分別為41%、54%和67%[36]。然而相較ctDNA突變，更多的肺癌早篩研究基于血漿或血清的ctDNA甲基化特征。早期相關(guān)研究多集中于單一或少量基因的CpG甲基化區(qū)域，利用定量甲基化特異性PCR（quantitative methylation specific PCR，qMSP）鑒定患者和HC之間的基因甲基化水平差異，但靈敏度和特異性通常較低[37-38]。在最近發(fā)表的研究中，Chemi等[39]采用一種高靈敏度的NGS甲基化測(cè)序方法T7-BMD-seq，通過(guò)對(duì)SCLC患者來(lái)源異種移植物（patient-derived xenografts，PDX）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)源外植體（circulating tumor cellderived explant，CDX）與HC肺組織或ctDNA進(jìn)行甲基化差異對(duì)比，鑒定出4 061個(gè)差異化甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）。隨后該研究團(tuán)隊(duì)采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建分類(lèi)模型，并在由41例HC、29例局限期SCLC（LS-SCLC）和49例廣泛期SCLC（ES-SCLC）患者cfDNA組成的驗(yàn)證集中進(jìn)行檢驗(yàn)；此模型成功鑒定了93%的LS-SCLC和100%的ES-SCLC，在100%特異性時(shí)靈敏度達(dá)到了80%以上[39]。另一項(xiàng)研究則采用基于WGS的cfDNA片段分析，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建了算法模型DELFI，并在Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期肺癌檢測(cè)中分別達(dá)到91%、94%的靈敏度和80%的特異性[40]。

1.3 結(jié)直腸癌

CRC是全球死亡人數(shù)排第2位的癌癥[25]。針對(duì)CRC的非侵入性檢查主要為糞便隱血檢測(cè)（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）和糞便免疫組化檢測(cè)（fecal immunohistochemical test，F(xiàn)IT），但因其較低的靈敏度易發(fā)生漏診。

針對(duì)CRC早篩的ctDNA標(biāo)記主要為基因甲基化。2013年Church等[41]針對(duì)單一的SEPT9甲基化標(biāo)記，采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）方法對(duì)CRC進(jìn)行前瞻性檢測(cè)，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期CRC中的靈敏度分別為35%、63%、46%和77.4%，特異性為91.5%。近期發(fā)表的2項(xiàng)研究采用了多個(gè)CRC相關(guān)的甲基化標(biāo)記，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)大幅提升了檢測(cè)性能。其中ColonAiQ算法納入了6個(gè)甲基化標(biāo)記，通過(guò)qPCR獲取各位點(diǎn)甲基化數(shù)據(jù)，在鑒定173例CRC患者與136例HC的模型性能驗(yàn)證中達(dá)到86%靈敏度和92%特異性[42]。另一項(xiàng)研究采用了LASSO算法，從667個(gè)候選的組織甲基化標(biāo)記中篩選出11個(gè)ctDNA甲基化標(biāo)記，并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型；此模型在鑒定123例CRC患者與67例HC的性能驗(yàn)證中的靈敏度和特異性分別為84.6%和86.6%，并可較準(zhǔn)確地篩查Ⅰ期CRC[43]。

1.4 多癌種

基于cfDNA的多癌種早篩（multi-cancer early detection，MCED）可在一次檢測(cè)中同時(shí)篩查多個(gè)器官腫瘤，因此具有極廣泛的應(yīng)用前景。近期的一項(xiàng)研究預(yù)測(cè)，如將MCED納入常規(guī)診療，將有效提高癌癥早期診斷率，并使診斷后5年內(nèi)死亡的患者人數(shù)減少39%[44]。MCED并非單一癌種篩查方法的累加，因其會(huì)同時(shí)累加整體檢出的假陽(yáng)性率和假陰性率，且增加取樣難度和檢測(cè)成本。同時(shí)，MCED需具有進(jìn)行腫瘤組織來(lái)源（tissue of origin，TOO）鑒定的能力。

CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas，NCT02889978）是由加拿大和美國(guó)多個(gè)醫(yī)學(xué)中心推進(jìn)的一項(xiàng)大規(guī)模前瞻性雙臂cfDNA研究，也是目前全球規(guī)模最大的相關(guān)研究。該研究目的為尋找適合的cfDNA癌癥標(biāo)記，并構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型以在人群中進(jìn)行多癌種篩查。第1個(gè)CCGA子項(xiàng)目研究發(fā)現(xiàn)，相比針對(duì)SNV、插入/缺失（indel）、CNV的WGS和靶向測(cè)序，針對(duì)全基因組甲基化模式的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）具有更好的預(yù)測(cè)性能，且在TOO分析方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[29]。隨后該研究團(tuán)隊(duì)使用超過(guò)50個(gè)癌種的2 482名患者和4 207名對(duì)照，進(jìn)行了基于全基因組甲基化模式的機(jī)器學(xué)習(xí)建模，所構(gòu)建的2個(gè)模型分別用于癌癥篩查和預(yù)測(cè)腫瘤TOO。其中，癌癥篩查模型在高于99%的特異性下，對(duì)驗(yàn)證集中Ⅰ~Ⅲ期全癌種篩查的靈敏度達(dá)到43.9%，其靈敏度隨癌癥分期而升高。TOO預(yù)測(cè)模型則在Ⅰ~Ⅳ期癌癥中達(dá)到了93%（321/344）的準(zhǔn)確性[45]。

2 基于ctDNA的術(shù)后微小殘留病灶檢測(cè)

微小殘留病灶或稱分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD）是指非轉(zhuǎn)移性癌癥患者接受手術(shù)、放化療等治療并達(dá)到完全緩解后，仍有相當(dāng)一部分患者的血液中可檢出殘留的腫瘤細(xì)胞或腫瘤分子標(biāo)志物。目前已有大量證據(jù)表明，MRD可用于早期預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。MRD檢測(cè)主要依賴循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）和ctDNA，對(duì)兩者進(jìn)行檢測(cè)分析均可在多種癌癥中有效評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[46]，但目前基于NGS的ctDNA MRD檢測(cè)研究相對(duì)更加廣泛。依據(jù)不同的檢測(cè)時(shí)間和目的，ctDNA MRD檢測(cè)主要分為2種：1）地標(biāo)檢測(cè)（landmark analysis），通常在手術(shù)或放療后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可在術(shù)后快速制定進(jìn)行輔助治療方案的依據(jù)；2）縱向監(jiān)測(cè)（longitudinal surveillance），指在術(shù)后隨訪過(guò)程中的多個(gè)間隔時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以盡早發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的MRD，以便在出現(xiàn)影像學(xué)指征前提早開(kāi)展新一輪輔助治療[26]。

目前已有大量研究顯示，ctDNA MRD可有效預(yù)測(cè)多種癌癥的復(fù)發(fā)和預(yù)后。2017年一項(xiàng)肺癌相關(guān)研究采用CAPP-seq，對(duì)40名Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者接受根治性治療前的ctDNA進(jìn)行突變基因檢測(cè)，并在93%（n= 37）患者中檢出ctDNA；于術(shù)后進(jìn)行的ctDNA MRD縱向監(jiān)測(cè)則在54%（n= 20）的術(shù)前陽(yáng)性患者中再次檢出ctDNA。進(jìn)一步隨訪發(fā)現(xiàn)，術(shù)后ctDNA陽(yáng)性患者最終全部復(fù)發(fā)，且多數(shù)患者檢出ctDNA的時(shí)間點(diǎn)比影像學(xué)更早。相較于術(shù)后ctDNA陰性患者，陽(yáng)性患者的無(wú)進(jìn)展期和生存期均顯著縮短。此外，該研究中有53%患者在ctDNA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了與酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）或免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）用藥相關(guān)的突變[47]。Xia等[48]最近發(fā)表的前瞻性、多中心、隊(duì)列研究納入了330名Ⅰ~Ⅲ期肺癌患者，于術(shù)前、術(shù)后3天和術(shù)后1個(gè)月分別采集患者血漿樣本，并使用覆蓋769基因的panel進(jìn)行cfDNA測(cè)序。結(jié)果顯示，術(shù)后ctDNA陽(yáng)性是復(fù)發(fā)的有效指標(biāo)[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）= 11.1，P＜0.001]，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高于TNM分期。該研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后ctDNA陰性患者接受輔助治療可顯著增加其無(wú)復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）（HR = 0.3，P= 0.008）。在接受新輔助治療后的早期三陰乳腺癌患者中，ctDNA MRD檢測(cè)成功預(yù)測(cè)了79%患者的復(fù)發(fā)，ctDNA陰性和陽(yáng)性患者達(dá)到24個(gè)月無(wú)遠(yuǎn)端疾病生存期（distant disease-free survival，DDFS）的比例分別為56%和81%，且陰性患者具有顯著較低的無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）[49]。Li等[50]在接受過(guò)一線治療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）患者中，采用Onco-LymScan panel進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，證明基于ctDNA的MRD檢測(cè)可有效實(shí)現(xiàn)DLBCL的預(yù)后預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)和療效評(píng)估。

為了在保持ctDNA MRD檢出準(zhǔn)確性的同時(shí)提高檢測(cè)率，可在患者術(shù)后對(duì)其腫瘤組織和正常白細(xì)胞進(jìn)行平行測(cè)序，識(shí)別腫瘤組織特異突變，并針對(duì)每位患者的腫瘤突變譜訂制個(gè)性化panel用于后續(xù)的一系列ctDNA檢測(cè)。Gale等[51]近期發(fā)表的研究入組了88名Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者，于患者術(shù)后采用WES對(duì)其原發(fā)腫瘤和血液白細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，并針對(duì)突變基因頻率排位前47 ~ 48的突變?cè)O(shè)計(jì)引物，在ctDNA檢測(cè)中進(jìn)行多重PCR和NGS；在該panel中還包含部分正常人群攜帶的SNP，以便對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。結(jié)果顯示，術(shù)后2周至4個(gè)月期間，17%患者中檢出ctDNA，此部分患者的RFS（HR =14.8，P＜0.000 01）和OS（HR = 5.48，P＜0.000 3）均顯著較短。在復(fù)發(fā)的患者中，有64.3%提前檢出了ctDNA，相比傳統(tǒng)臨床檢測(cè)方法的檢出時(shí)間中位數(shù)提前212.5天。Liu等[52]發(fā)表的局部進(jìn)展期直腸癌（LARC）相關(guān)研究入組了60名LARC患者，在其接受新輔助治療（neoadjuvant therapy，NAT）的前、中、后期和全直腸系膜切除術(shù)（TME）前4個(gè)階段進(jìn)行血樣采集，對(duì)其腫瘤組織和血液白細(xì)胞進(jìn)行WES或包含509基因的通用panel測(cè)序，并采用多至22個(gè)體細(xì)胞突變?cè)O(shè)計(jì)個(gè)性化panel用于cfDNA測(cè)序。結(jié)果顯示，NAT后的ctDNA水平預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的靈敏度和特異性分別達(dá)到76.47%和97.67%，其預(yù)測(cè)性能高于所有經(jīng)典的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平、癌抗原19-9（carcinoma antigen 19-9，CA19-9）水平和依據(jù)歐洲腫瘤學(xué)會(huì)（European Society for Medical Oncology，ESMO）指南評(píng)估的臨床風(fēng)險(xiǎn)。NAT后MRD陽(yáng)性患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著高于MRD陰性患者（HR = 27.38，P＜0.000 1），且在3年隨訪中顯示了更短的OS（HR=17.78，P= 0.000 54）以及RFS。該研究還顯示，通過(guò)全基因組低深度測(cè)序獲得的基線（即NAT治療前）CNV也可預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，其靈敏度和特異性分別為66.67%和100%。如結(jié)合個(gè)性化panel結(jié)果，則可將靈敏度和特異性提升至82.35%和97.67%（HR = 35.89，P＜0.000 1）。

3 晚期癌癥患者的伴隨診斷

近年來(lái)，NGS因其不斷提高通量、降低成本，在癌癥的伴隨診斷（companion diagnostics，CDx）中已廣泛應(yīng)用于鑒定驅(qū)動(dòng)基因突變、可靶突變和耐藥位點(diǎn)，并持續(xù)取得進(jìn)展。NGS鑒定的突變類(lèi)型主要包括SNV、插入/缺失、染色質(zhì)重排、CNV、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤突變負(fù)荷等。目前已有一系列基于NGS的CDx產(chǎn)品獲得美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)，包括用于檢測(cè)實(shí)體瘤組織樣本的FoundationOne CDx（F1CDx）、FoundationFocus CDx BRCA、Oncomine Dx Target Test、Praxis Extended RAS panel、Myriad myChoice CDx、ONCO/Reveal Dx Lung &Colon Cancer Assay（O/RDx-LCCA）和檢測(cè)血液樣本的FoundationOne Liquid CDx、Guardant360 CDx、Agilent Resolution ctDx FIRST assaym等[53]。2020年，ESMO發(fā)布了關(guān)于轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的NGS應(yīng)用指南，指出多基因panel可應(yīng)用于肺腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膽管癌、卵巢癌的體細(xì)胞突變檢測(cè)，大panel可應(yīng)用于未知原發(fā)灶腫瘤的檢測(cè)，以及宮頸癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、中等分化至高度分化的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和會(huì)陰癌的腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）檢測(cè)[54]。ESMO同時(shí)發(fā)布了依據(jù)其分子靶點(diǎn)臨床可操作性量表（ESMO Scale for Clinical Actionability of Molecular Targets，ESCAT）[55]分級(jí)的多個(gè)晚期癌種可靶突變，為臨床實(shí)踐提供了進(jìn)一步詳細(xì)指導(dǎo)。近期研究顯示，全基因組-轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析（whole-genome and transcriptome sequencing and analysis，WGTA）可在83%的晚期轉(zhuǎn)移性泛癌種患者中檢出可臨床干預(yù)靶點(diǎn)，而在接受靶向治療的患者中有46%取得了臨床獲益[56]，這進(jìn)一步肯定了NGS在晚期腫瘤臨床干預(yù)中的重要地位。近期的相關(guān)研究主要集中于進(jìn)一步補(bǔ)充潛在治療靶點(diǎn)，并在臨床試驗(yàn)中明確靶藥的治療效果。隨著未來(lái)更多靶向藥物的獲批上市，NGS用于CDx的價(jià)值將得到進(jìn)一步提升。

3.1 肺癌

NGS技術(shù)使肺癌的精準(zhǔn)治療獲得極大發(fā)展，目前經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證的肺癌可靶向突變多存在于NSCLC的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LADC）分型中，LADC約占全部NSCLC的60%，是占比最高的肺癌分型[57]。EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、MET、RET、HER2和NTRK突變是NSCLC主要治療靶點(diǎn)[58]。2023年第2版NCCN指南推薦使用NGS panel對(duì)所有NSCLC進(jìn)行檢測(cè)，并指出應(yīng)在未檢出驅(qū)動(dòng)基因突變時(shí)考慮采用RNA測(cè)序以最大化檢出融合基因。美國(guó)FDA于2021年批準(zhǔn)EGFR/MET雙特異性抗體amivantamab用于治療攜帶EGFR20號(hào)外顯子插入突變的NSCLC，同時(shí)批準(zhǔn)Guardant360 CDx作為其伴隨診斷方法。2022年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)cemiplimab結(jié)合化療用于治療無(wú)EGFR、ALK、ROS1突變的晚期成人NSCLC。近期的研究和臨床試驗(yàn)仍在不斷完善針對(duì)以上靶點(diǎn)用藥的治療效果。Yu等[59]發(fā)表的一項(xiàng)真實(shí)世界研究納入了2 864名攜帶EGFR體細(xì)胞突變的進(jìn)展期中國(guó)NSCLC患者，以驗(yàn)證EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）的治療效果。結(jié)果顯示，接受EGFR-TKI治療的患者OS顯著高于其他治療方式患者，其OS中位數(shù)增加6.8個(gè)月。此外，接受第1代或第2代EGFR-TKI一線治療后疾病進(jìn)展并轉(zhuǎn)用第3代EGFR-TKI治療的患者，其OS顯著高于接受第3代EGFR-TKI一線治療和進(jìn)展后未接受第3代EGFR-TKI治療的患者，進(jìn)一步明確了EGFR-TKI對(duì)中國(guó)NSCLC患者的臨床價(jià)值。ALK融合是臨床指南中推薦的重要NSCLC生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，針對(duì)ALK激酶區(qū)的靶向抑制劑，包括克唑替尼（crizotinib）和第2代抑制劑色瑞替尼（ceritinib）、阿萊替尼（alectinib）、布加替尼（brigatinib），以及第3代抑制劑勞拉替尼（lorlatinib）均已應(yīng)用于治療ALK融合陽(yáng)性NSCLC患者。最近一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示，第2代ALK抑制劑恩莎替尼（ensartinib）相比克唑替尼對(duì)全身病灶，尤其針對(duì)顱內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶有更高的反應(yīng)率（63.6%vs21.1%），提示ensartinib有潛力成為新的一線治療藥物[60]。Shi等[61]針對(duì)多癌種的回顧性RET融合研究同時(shí)采用DNA和RNA NGS測(cè)序，在肺癌中鑒定出GLI3-RET和MALRD1-RET 2個(gè)新的功能性融合，進(jìn)一步完善了潛在的靶向RET融合突變譜。

KRAS是另一常見(jiàn)的NSCLC驅(qū)動(dòng)突變基因，其在LADC中的發(fā)生率約為35%[62]。然而由于KRAS具有非常強(qiáng)的三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）親和性，加之較小的催化結(jié)構(gòu)域使其難以結(jié)合小分子，導(dǎo)致直接針對(duì)KRAS靶向藥物研發(fā)十分困難。與此同時(shí)，較早的針對(duì)KRAS協(xié)同通路[63]或下游通路[64]進(jìn)行的靶向治療臨床試驗(yàn)同樣未取得良好效果。最近，針對(duì)KRAS p.G12C新靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的藥物索托拉西布（sotorasib）在臨床試驗(yàn)中被證明有效[65]，并獲得FDA快速通道批準(zhǔn)，用于已接受過(guò)至少一次系統(tǒng)治療的KRASG12C突變攜帶者[66]。同時(shí)獲批的伴隨診斷試劑為QIAGEN therascreen?KRAS RGQ PCR kit與Guardant360?CDx，分別用于檢測(cè)組織和血漿樣本。此外，針對(duì)KRAS突變熱點(diǎn)表達(dá)的腫瘤新抗原（tumor neo-antigen，TNA）開(kāi)發(fā)mRNA疫苗是具有良好前景的新型治療方法，但其有效性尚待臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步研究支持[67]。

3.2 結(jié)直腸癌

近年來(lái)，隨著中國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和民眾飲食習(xí)慣改變，CRC的發(fā)病率和死亡率不斷升高。2020年，中國(guó)新增CRC患者555 477人，相關(guān)死亡人數(shù)為286 162人，分別占全球CRC的28.8%和30.6%[68]。

2021年第2版NCCN指南推薦采用NGS或其他方法檢測(cè)轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）生物標(biāo)志物，包括KRAS/NRAS突變，BRAFV600E突變，HER2擴(kuò)增或過(guò)表達(dá)，缺陷錯(cuò)配修復(fù)（deficient mismatch repair，dMMR）/高頻率微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（high microsatellite instability，MSI-H）狀態(tài)和NTRK融合。該指南建議所有mCRC患者均應(yīng)進(jìn)行分子檢測(cè)，以識(shí)別林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）相關(guān)的dMMR/MSI-H，約有5%的mCRC攜帶此標(biāo)志物。除與LS相關(guān)外，dMMR/MSI-H還可提示免疫治療有效性[69]。Zhao等[70]最近發(fā)表的研究對(duì)罕見(jiàn)的同步多原發(fā)結(jié)直腸癌（synchronous multiple primary colorectal cancer，sMPCC）和單原發(fā)結(jié)直腸癌（single primary CRC，SPCRC）的分子特征進(jìn)行了分析，對(duì)78名sMPCC的158個(gè)病灶和111名SPCRC患者的腫瘤組織進(jìn)行NGS panel測(cè)序，證實(shí)sMPCC具有更高的dMMR/MSI-H與高腫瘤突變負(fù)荷（high tumor mutation burden，TMB-H）發(fā)生率，提示sMPCC患者更可能獲益于免疫治療。

另外，NCCN發(fā)布的遺傳/家族性高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：結(jié)直腸（Genetic/Familial High-Risk Assessment:Colorectal）指南2022年第2版[71]則推薦對(duì)高CRC遺傳風(fēng)險(xiǎn)的人群進(jìn)行基于多基因panel的遺傳突變檢測(cè)，其中應(yīng)至少包含以下風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因：APC，MUTYH，MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，PECAM，BMPR，SMAD4，PTEN和STK11。目前，NCCN指南中推薦的遺傳性突變篩查年齡為小于50歲的CRC患者，而Jiang等[72]最近發(fā)表的CRC胚系突變篩查研究則顯示，年齡至70歲及以下的CRC患者均可能攜帶癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因胚系突變。

與NSCLC類(lèi)似，KRAS在mCRC中具有高達(dá)44%的突變率，但針對(duì)KRASG12C的靶向抑制劑在mCRC臨床試驗(yàn)中未取得與NSCLC相近的反應(yīng)率[73]。Amodio等[74]針對(duì)NSCLC和CRC細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，CRC細(xì)胞系具有更高的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）基線活性水平，并可被上游生長(zhǎng)因子激活。該研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR信號(hào)通路激活是CRC對(duì)KRASG12C抑制劑耐藥的重要機(jī)制，同時(shí)應(yīng)用EGFR和KRASG12C抑制劑AMG150在CRC細(xì)胞系、CRC腫瘤類(lèi)器官和異種移植體中均取得顯著治療效果，使其成為有前景的KRASG12C突變靶向治療方法?；诖私Y(jié)論，2023年1月J?nne等[75]報(bào)告的Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗(yàn)對(duì)KRASG12C抑制劑adagrasib（MRTX849）單一用藥和adagrasib聯(lián)合EGFR抑制劑cetuximab治療KRASG12C突變型mCRC進(jìn)行對(duì)比。該研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥獲得了更高的反應(yīng)率（46%vs19%）、更長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）（6.9 個(gè)月vs5.6 個(gè)月）和更低的3/4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生率（16%vs34%），驗(yàn)證了KRASG12C抑制劑和EGFR抑制劑聯(lián)合用藥的臨床價(jià)值。

3.3 乳腺癌

女性乳腺癌（breast cancer，BC）是目前所有癌癥中發(fā)病率最高的種類(lèi)，約占所有癌癥發(fā)病人數(shù)的11.7%，而在女性癌癥中可達(dá)24.5%[25]。通過(guò)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和HER2等分子分型可將乳腺癌分為4類(lèi)：管腔A型（luminal A：ER+，PR+，HER2-，Ki67低表達(dá)），管腔B型（luminal B：ER+，PR+，HER2-，Ki67高表達(dá)），HER2過(guò)表達(dá)型和三陰乳腺癌（TNBC：ER-，PR-，HER2-）。其中管腔A/B型亦可稱為激素受體陽(yáng)性、HER2陰性（HR+，HER2-）型[76]。針對(duì)HR+乳腺癌目前主要應(yīng)用內(nèi)分泌療法，針對(duì)HER2+乳腺癌主要采用HER2靶向治療結(jié)合化療，而TNBC缺少以上治療靶點(diǎn)，故主要采用化療且預(yù)后不佳[77]。2020年，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology，ASCO）/美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（college of american pathologists，CAP）更新了乳腺癌HR表達(dá)檢測(cè)的相關(guān)指南，由于采用激素療法治療ER細(xì)胞表達(dá)率為1% ~ 10%的乳腺癌的療效證據(jù)有限，故將此部分ER+乳腺癌定義為低ER表達(dá)乳腺癌[78]。臨床中通常采用免疫組化（IHC）進(jìn)行上述分型。

目前，NGS主要應(yīng)用于BC的遺傳易感基因檢測(cè)。全部BC中約有10%具有家族史或遺傳易感突變，其中最常見(jiàn)的易感突變基因?yàn)锽RCA1和BRCA2，其易感突變基因攜帶者至80歲時(shí)BC累積患病風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)70%[79]。依據(jù)2023年更新的NCCN遺傳性癌癥檢測(cè)指南[80]，發(fā)病年齡為50歲及以下或經(jīng)評(píng)估具有家族史的BC患者應(yīng)進(jìn)行遺傳易感基因突變檢測(cè)，包括BRCA1，BRCA2，CDH1，PALB2，PTEN和TP53。

由于BC篩查方法的進(jìn)步，依據(jù)監(jiān)測(cè)，流行病學(xué)和最終結(jié)果（Surveillance，Epidemiology，and End Results，SEER）項(xiàng)目公布的數(shù)據(jù)顯示，2019年美國(guó)僅有7.5%BC患者診斷時(shí)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。然而，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致BC患者死亡的主要原因[81]。針對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌（mBC）的部分患者，目前已有部分治療方法經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，如PI3K抑制劑alpelisib可用于治療攜帶PIK3CA熱點(diǎn)突變的HR+/HER2-mBC[82]。mBC中還可檢測(cè)到部分罕見(jiàn)體細(xì)胞突變，如MSI-H，NTRK融合，分別可采用相應(yīng)的泛實(shí)體瘤靶向藥物進(jìn)行治療[83-84]。近期發(fā)表的部分相關(guān)研究旨在進(jìn)一步探索mBC治療靶點(diǎn)，并驗(yàn)證NGS在mBC臨床干預(yù)中的作用。Kawaji等[85]采用F1CDx對(duì)109名mBC患者腫瘤進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有76%患者攜帶可臨床干預(yù)的突變，但未對(duì)患者實(shí)施干預(yù)并分析預(yù)后。另一項(xiàng)研究中，Andre等[86]入組了1 462名HER2-mBC患者，采用多基因panel結(jié)合比較基因組雜交（CGH）對(duì)腫瘤進(jìn)行突變分析；研究者將總計(jì)238名攜帶可臨床干預(yù)突變且希望接受治療的患者，其中115名攜帶ESCAT Ⅰ/Ⅱ級(jí)突變的患者，隨機(jī)分為2組，在組內(nèi)分別進(jìn)行維持性化療和與突變匹配的多種靶向治療。結(jié)果顯示，兩組內(nèi)接受靶向治療的患者PFS均顯著長(zhǎng)于接受化療的患者。此結(jié)果在ESCATⅠ/Ⅱ級(jí)突變攜帶者中尤為顯著，攜帶此類(lèi)突變并接受靶向治療的患者（n= 75）相比接受維持性化療的患者（n= 40），其PFS中位數(shù)延長(zhǎng)了6.3個(gè)月（9.1個(gè)月vs2.8個(gè)月，P＜0.001）；而在攜帶非ESCATⅠ/Ⅱ級(jí)突變的患者中，2種治療方法的PFS無(wú)顯著差異。提示，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐蛔兎旨?jí)指導(dǎo)下，以NGS為基礎(chǔ)的靶點(diǎn)檢測(cè)和靶向治療對(duì)mBC的預(yù)后改善具有重要意義。

3.4 腦膠質(zhì)瘤

成人彌漫性膠質(zhì)瘤（diffuse glioma）是最常見(jiàn)的成人腦實(shí)質(zhì)腫瘤，其占比大于70%[87]。在2021年發(fā)布的第5版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)（WHO CNS 5）中，分子診斷的重要性得到了大幅提升[88]。依據(jù)突變類(lèi)型，成人彌漫性膠質(zhì)瘤可分為以下3類(lèi)：1）星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，IDH突變型；2）少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，IDH突變和染色體1p/19q共缺失型；3）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，IDH野生型?？梢?jiàn)，IDH突變?nèi)詾樽钪匾姆中鸵罁?jù)。歐洲神經(jīng)腫瘤協(xié)會(huì)（European Association for Neuro Oncology，EANO）建議，對(duì)于小于55歲且IHC檢測(cè)IDH1 R132H陰性的WHO 2/3級(jí)彌漫性星形膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)瘤和全部膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，應(yīng)采用測(cè)序進(jìn)行IDH突變檢測(cè)[89]。另有研究顯示，依據(jù)現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用NGS檢測(cè)IDH1、IDH2突變的可靠性優(yōu)于IHC[90]，結(jié)合目前大幅增加的分子分型標(biāo)記種類(lèi)，提示NGS有潛力成為膠質(zhì)瘤分型的首選檢測(cè)方法，從而提升分子診斷的準(zhǔn)確性并指導(dǎo)臨床干預(yù)。

目前的膠質(zhì)瘤治療方法主要為手術(shù)切除和術(shù)后放化療，但一系列研究和臨床試驗(yàn)為針對(duì)膠質(zhì)瘤突變的靶向治療提供了新的可能性。Ivosidenib是一種IDH1靶向抑制劑，目前已由FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性或難治性IDH1突變型急性髓系白血病和IDH1突變型局部晚期或轉(zhuǎn)移性膽管癌。近期的一項(xiàng)多中心Ⅰ期臨床試驗(yàn)納入了66名進(jìn)展期膠質(zhì)瘤患者，其中46例納入劑量擴(kuò)展階段（dose expansion phase），接受500 mg、1次/日用藥，最佳響應(yīng)為1名患者的部分緩解和44名患者的病情穩(wěn)定。該研究還依據(jù)對(duì)比增強(qiáng)MRI T1加權(quán)像將患者分為增強(qiáng)組和非增強(qiáng)組，并發(fā)現(xiàn)非增強(qiáng)組經(jīng)治療后的PFS中位數(shù)長(zhǎng)于增強(qiáng)組（13.6個(gè)月vs1.4個(gè)月）[91]。Vorasidenib是一種IDH1/2雙抑制劑，針對(duì)其開(kāi)展的Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示，vorasidenib治療非增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的客觀緩解率為18%，非增強(qiáng)組與增強(qiáng)組的PFS中位數(shù)分別為36.8個(gè)月和3.6個(gè)月[92]。然而，IDH1抑制劑的治療效果仍需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)評(píng)估。

MET14號(hào)外顯子跳躍（METex14）較常見(jiàn)于繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其發(fā)生率約為14%。METex14和功能性MET融合均可導(dǎo)致MET和STAT3通路異常激活[92]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。MET抑制劑已在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中被證明對(duì)攜帶METex14突變或PTPRZ1-MET融合的患者有效[93]。Yang等[94]的近期研究顯示，MET融合在腦癌中的攜帶率為1.1%，除相對(duì)常見(jiàn)的PTPRZ1-MET和CAPZA2-MET外，在腦癌中還發(fā)現(xiàn)了ST7-MET，BMT2-MET，DNAJB6-MET和CHRM2-MET罕見(jiàn)融合，進(jìn)一步為MET抑制劑應(yīng)用于腦癌治療提供了基礎(chǔ)，并明確了NGS在MET融合鑒定中的價(jià)值。

4 結(jié)語(yǔ)

NGS技術(shù)的發(fā)展極大地提高了人們對(duì)于腫瘤基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)腫瘤的個(gè)體間異質(zhì)性、腫瘤內(nèi)時(shí)空異質(zhì)性和腫瘤耐藥性形成機(jī)制的理解。對(duì)各癌種體細(xì)胞突變譜和驅(qū)動(dòng)基因突變致癌、促癌機(jī)制的深入研究，為靶向藥物的研發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。目前，已有上百種癌癥靶向藥獲批上市，并在NSCLC、CRC、BC等癌癥的輔助治療中取得了突出成效。NGS又可廣泛應(yīng)用于伴隨診斷，其高靈敏度、高通量、高覆蓋率地檢測(cè)序列突變、CNV以及基因融合，相較其他方法具有許多不可替代的優(yōu)勢(shì)。在伴隨診斷應(yīng)用中，ctDNA檢測(cè)已被納入多個(gè)國(guó)內(nèi)外癌癥診療指南或?qū)＜夜沧R(shí)，可在適當(dāng)前提下替代組織活檢樣本。同樣，基于ctDNA的MRD檢測(cè)則依靠CAPP-seq方法獲得極高靈敏度，可更早地預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后，同時(shí)獲取復(fù)發(fā)病灶突變信息以指導(dǎo)臨床干預(yù)。

近年來(lái)，基于液體活檢的早篩方法依托其采樣簡(jiǎn)單、低創(chuàng)傷性、高靈敏度和多癌種同時(shí)檢測(cè)溯源等內(nèi)在優(yōu)勢(shì)，獲得了較快發(fā)展。然而，由于癌癥早篩的目標(biāo)人群基數(shù)龐大，即使篩查方法具有較高的特異性，仍將產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的假陽(yáng)性結(jié)果，導(dǎo)致過(guò)度診斷。其次，較高的檢測(cè)成本同樣限制了此項(xiàng)技術(shù)在易感人群中的普及。未來(lái)隨著NGS技術(shù)可靠性的進(jìn)一步提升和成本的降低，結(jié)合癌癥特異性生物標(biāo)志物的優(yōu)化選擇和機(jī)器學(xué)習(xí)算法的快速發(fā)展，加之相關(guān)政策法規(guī)的進(jìn)一步完善，液體活檢早篩的優(yōu)勢(shì)將進(jìn)一步體現(xiàn)，并有望廣泛地投入臨床應(yīng)用。