柳曉蕊 ，許智朝 ，王兆濤 ，張媚媚 ，簡曉順 ，彭懷東 （.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 50095；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州 5060；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 5060）

腦出血是指非外傷導(dǎo)致的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂出血，具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率等特點(diǎn)[1]。在腦出血的急性期，過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，進(jìn)而產(chǎn)生大量毒性促炎因子，破壞血腦屏障并加劇腦水腫，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[2—3]。因此，抑制腦出血后急性期過度的炎癥反應(yīng)可能是治療腦出血的有效途徑[4]。腦出血后的炎癥損傷機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)分子和信號通路。其中，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種保守的天然免疫受體，在腦出血后的炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其表達(dá)下調(diào)與抑制腦出血后炎癥反應(yīng)有關(guān)，是治療腦出血的有效手段[5—6]。毛蕊異黃酮（calycosin，CA）是從中藥材黃芪中提取的黃酮類成分，具有抗炎、抗氧化作用，對受損腦組織具有保護(hù)的作用[7—8]?；诖耍狙芯客ㄟ^構(gòu)建腦出血小鼠模型，初步探討CA 對腦出血的改善作用，并通過體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞和原代神經(jīng)元進(jìn)一步探討該成分是否能通過抑制TLR4 表達(dá)而減輕腦出血后繼發(fā)的急性炎癥損傷，為進(jìn)一步開發(fā)CA用于臨床治療腦出血提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

68025型腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；2406-2 型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；LX71型熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；LB 942 型多功能酶標(biāo)儀購自德國Berthold Technologies 公司；Transwell 板（12 孔，孔徑0.4 μm）購自美國Corning公司；ChemiScope 6100型熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

CA 對照品（貨號WXHY-000687，純度＞98%）購自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、牛血清白蛋白（BSA）、Ⅶ型膠原酶（貨號分別為E607008、A600332、A005332）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、B27 添加劑、Neurobasal培養(yǎng)基（貨號分別為11995040、10099141、17504044、21103049）均購自美國Gibco 公司；一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Triton X-100 試劑、鼠源β-actin 單克隆抗體、紅細(xì)胞（RBC）裂解液（貨號分別為C1088、P0096、AA128、C3702）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ACCUTASE 細(xì)胞消化液、多聚甲醛（貨號分別為A6964、P6148）均購自美國Sigma公司；兔源離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule 1，Iba1）多克隆抗體（貨號019-19741）購自日本W(wǎng)AKO公司；兔源TLR4、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron specific nuclear protein，NeuN）多克隆抗體（貨號分別為ab13556、ab1234437、ab104225）均購自英國Abcam 公司；兔源腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric-oxide synthase，iNOS）多克隆抗體和Alexa Fluor 555 標(biāo)記的驢抗兔IgG 二抗（貨號分別為11948S、13120S、4413）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號分別為115-035-146、111-035-003）均購自美國Jackson ImmunoResearch 公司；4′，6-二脒基-2 苯基吲哚（DAPI）、RIPA裂解和提取緩沖液（貨號分別為62248、89900）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6小鼠（雄性，體重22～25 g，8～10周齡）、孕小鼠（體重40～48 g，8 周齡，其出生1～3 d 的乳鼠用于提取原代小膠質(zhì)細(xì)胞）均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002。所有動物均飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心（環(huán)境溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替），自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（審查編號A2021-006）。

2 方法

2.1 CA藥液的配制

取CA對照品適量，溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成CA儲備液。取上述CA儲備液適量，用9倍體積的PBS 稀釋至DMSO 含量為1%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，再用PBS或培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度。

2.2 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 小鼠分組、腦出血模型的構(gòu)建和給藥

將雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和不同劑量CA組。腦出血模型的制備參考文獻(xiàn)方法[9]：將小鼠用異氟醚麻醉后固定于腦立體定位儀（腦立體定位儀坐標(biāo)為前囟右側(cè)2.0 mm，前囟前0.5 mm，腹側(cè)2.8 mm）上，將0.2 U的Ⅶ型膠原酶（0.5 μL）緩慢注射到右側(cè)基底節(jié)區(qū)，注射時(shí)間為1 min；假手術(shù)組小鼠同法注射PBS（0.5 μL）。注射后，針頭于注射部位保持5 min后拔出，用骨蠟密封，再用絲線縫合。上述過程中，小鼠體溫應(yīng)維持在37 ℃左右，并于術(shù)后自由攝食、飲水。以小鼠蘇醒后行為和功能異常，且改良神經(jīng)功能缺損程度（modified neurological severity score，mNSS）評分明顯下降為造模成功[10]。在誘導(dǎo)腦出血20 min后，假手術(shù)組和模型組小鼠一次性腹膜內(nèi)注射PBS，不同劑量CA 組小鼠分別一次性注射相應(yīng)劑量的藥物（根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置給藥劑量分別為15、30、60、120 mg/kg）。小鼠腦出血造模實(shí)驗(yàn)平行2 批進(jìn)行，每批每組12 只（其中2～3 只備用）：第1批小鼠用于mNSS評分、腦出血體積計(jì)算和腦含水量測量實(shí)驗(yàn)，第2批小鼠用于其余實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 小鼠mNSS評分的測定

取假手術(shù)組、模型組和15、30、60、120 mg/kg CA 組小鼠各8只（第1批編號前8只），分別于手術(shù)24、48、72 h后對其進(jìn)行mNSS 評分。mNSS 評分由運(yùn)動實(shí)驗(yàn)，感覺實(shí)驗(yàn)，反射喪失和不正常運(yùn)動，以及癲病、肌陣攣、肌張力障礙4個(gè)部分組成，4個(gè)部分得分相加即為總分（最高18分），總分越高則神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重[10]。

2.2.3 小鼠腦出血體積的計(jì)算

取假手術(shù)組、模型組和30、60 mg/kg CA組（CA組劑量參考“2.2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置，下同）小鼠各4 只（第1 批編號前4只），于手術(shù)72 h后處死，取出腦組織，用PBS稀釋的4%多聚甲醛固定后，制備連續(xù)腦切片（厚度約1 mm）并進(jìn)行數(shù)字?jǐn)z影，使用Image-Pro Plus（Media Cybernetics）軟件計(jì)算腦出血體積：腦出血體積＝每個(gè)切片血凝塊面積×切片厚度。

2.2.4 小鼠腦含水量的測定

取假手術(shù)組、模型組和30、60 mg/kg CA 組小鼠各5只（第1 批編號第5～9 只），于手術(shù)72 h 后處死，迅速取出腦組織并稱重，得濕重；隨后，將腦組織于160 ℃下干燥24 h，再次稱重，得干重，按下式計(jì)算腦含水量：腦含水量（%）＝（濕重—干重）/濕重×100%。

2.2.5 小鼠腦組織中Iba1蛋白表達(dá)陽性率的檢測

采用免疫熒光染色法進(jìn)行檢測。取假手術(shù)組、模型組和30、60 mg/kg CA 組小鼠各3 只（第2 批編號前3只），于手術(shù)72 h后處死，取出腦組織，經(jīng)固定、脫水后切片（厚度約15 μm）。上述切片用PBS 稀釋的3%Triton X-100試劑在室溫下孵育15 min，洗滌后再用PBS稀釋的5%BSA封閉1 h；加入Iba1一抗（稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；加入Alexa Fluor 555 標(biāo)記的IgG 二抗（稀釋比例為1∶ 1 000），在室溫下孵育2 h；用PBS洗滌3次，用DAPI 復(fù)染細(xì)胞核10 min，封片后使用顯微鏡觀察。除假手術(shù)組選擇小鼠大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)的腦組織外，其余各組隨機(jī)選擇每張切片腦出血病變及周邊區(qū)域（包括腦出血損傷周圍1 mm區(qū)域）5個(gè)不重疊的高倍（×200）視野拍攝，計(jì)算每個(gè)視野中被染成紅色的細(xì)胞數(shù)與被染成藍(lán)色的有核細(xì)胞數(shù)的比值，其平均值即為Iba1蛋白的表達(dá)陽性率，以該表達(dá)陽性率表示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。

2.2.6 小鼠腦組織中TLR4及其下游炎癥因子蛋白表達(dá)的檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測。取假手術(shù)組、模型組和30、60 mg/kg CA 組小鼠各4 只（第2 批編號第4～7只），于手術(shù)72 h 后處死，取出腦組織，除假手術(shù)組選擇小鼠大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)的腦組織外，其余各組選擇小鼠腦出血病變及周邊區(qū)域腦組織（包括腦出血損傷周圍1 mm區(qū)域），用RIPA裂解，收集蛋白樣品；以BCA法測定蛋白濃度后，于100 ℃變性5 min；取變性蛋白樣品（30 μg）進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5%BSA 的1×TBST 緩沖液于室溫下封閉1 h；加入TLR4、TNF-α、iNOS、IL-1β、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；加入相應(yīng)IgG 二抗（稀釋比例均為1∶10 000），孵育1 h；以ECL 試劑顯色后，使用熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的條帶灰度值比值，再以假手術(shù)組為標(biāo)準(zhǔn)作歸一化處理，即得目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

2.2.7 小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞陽性率的檢測

采用凋亡染色法進(jìn)行檢測。取假手術(shù)組、模型組和30、60 mg/kg CA 組小鼠各3 只（第2 批編號第8～10只），于手術(shù)72 h 后處死，取出腦組織并制作腦冰凍切片。將上述切片放至濕盒中復(fù)溫后，用PBS洗滌2次，再用4%多聚甲醛固定30 min；用PBS 洗滌2 次，加入PBS稀釋的0.5%Triton X-100 試劑，于室溫下孵育5 min；用PBS 洗滌2 次，加入TUNEL 檢測液，于37 ℃下孵育60 min；用DAPI 室溫避光孵育5 min；用PBS 洗滌4 次，滴加含熒光淬滅劑的封片劑后封片，使用顯微鏡觀察。除假手術(shù)組選擇小鼠大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)的腦組織外，其余各組隨機(jī)選取每張切片腦出血病變及周邊區(qū)域（包括腦出血損傷周圍1 mm 區(qū)域）5 個(gè)不重疊的高倍（×200）視野拍攝，計(jì)算每個(gè)視野中被染成綠色的細(xì)胞數(shù)與被染成藍(lán)色的有核細(xì)胞數(shù)的比值，其平均值即為凋亡細(xì)胞陽性率，以該陽性率表示細(xì)胞的凋亡程度。

2.3 體外細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.3.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4及其下游炎癥因子蛋白表達(dá)的檢測

取剛出生1～3 d的C57BL/6乳鼠，分離出其大腦皮層。將皮層組織在含有20%FBS和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中剪碎，用含有100 U/mL DNA酶Ⅰ的ACCUTASE 細(xì)胞消化液消化并重懸后，將所得細(xì)胞接種到聚-D-賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7 d；分離雜質(zhì)并更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，收集小膠質(zhì)細(xì)胞。將小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔100 000個(gè)接種于6 孔板中，分為對照組、RBC 組和20、40 μmol/L CA組（根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置藥物濃度）。RBC組細(xì)胞加入1 μg/mL的RBC裂解液以模擬體內(nèi)腦出血狀態(tài)，CA組細(xì)胞加入RBC裂解液和相應(yīng)濃度的藥液；培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞，按“2.2.6”項(xiàng)下蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞中TLR4、TNF-α、iNOS、IL-1β蛋白的相對表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.3.2 原代神經(jīng)元與原代小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中神經(jīng)元凋亡程度的檢測

從15～18 d孕齡的C57BL/6孕小鼠中取出胚胎，分離出胚胎鼠的大腦皮層。將皮層組織在含有20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中剪碎，用含有100 U/mL DNA酶Ⅰ的ACCUTASE細(xì)胞消化液消化并重懸后離心、過濾；用含有2%B27和1%谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基重懸后，將所得神經(jīng)元接種到聚-D-賴氨酸包被的12 孔板中。原代小膠質(zhì)細(xì)胞提取和培養(yǎng)同“2.3.1”項(xiàng)下。使用Transwell小室共培養(yǎng)原代神經(jīng)元和原代小膠質(zhì)細(xì)胞：在Transwell上室接種20 000個(gè)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，下室接種10 000個(gè)原代神經(jīng)元。按“2.3.1”項(xiàng)下分組和給藥，培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min后，用PBS 稀釋的0.3%Triton X-100 通透20 min；用PBS 洗滌后，用含5%BSA 的PBS 封閉1 h；加入NeuN 一抗（稀釋比例為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1∶1 000），繼續(xù)孵育2 h；用PBS 洗滌3 次后，滴加DAPI 避光孵育5 min，PBS 洗滌后封片并使用顯微鏡觀察。隨機(jī)選取每張熒光染色圖片5個(gè)不重疊的高倍（×200）視野拍攝，計(jì)算每個(gè)視野中被染成紅色的細(xì)胞數(shù)與被染成藍(lán)色的有核細(xì)胞數(shù)的比值，其平均值即為原代神經(jīng)元的存活率。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA 分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 CA對小鼠mNSS評分的影響

手術(shù)24、48、72 h 后，15 mg/kg CA 組小鼠的mNSS評分與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；30、60、120 mg/kg CA 組小鼠的mNSS 評分均較模型組顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖1。120 mg/kg CA組小鼠的mNSS評分與60 mg/kg CA組差異較小，因此選取30、60 mg/kg作為CA的干預(yù)劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CA對小鼠腦出血后mNSS評分的影響（±s，n＝8）

3.1.2 CA對小鼠腦出血體積和腦含水量的影響

假手術(shù)組小鼠無明顯的腦出血區(qū)域；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠可見腦出血現(xiàn)象，其腦出血體積為（7.82±0.52）mm3；與模型組比較，30、60 mg/kg CA 組小鼠的腦出血區(qū)域有所縮小，其腦出血體積[分別為（4.81±0.26）mm3、（2.33±0.19）mm3]均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠代表性腦切片圖

與假手術(shù)組小鼠的腦含水量[（78.22±1.66）%]比較，模型組小鼠的腦含水量[（85.22±2.85）%]顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，30、60 mg/kg CA組小鼠的腦含水量[分別為（81.12±2.63）%、（80.26±2.59）%]均顯著降低（P＜0.05）。

3.1.3 CA對小鼠腦組織中Iba1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組小鼠腦組織中Iba1 蛋白的表達(dá)陽性率[（4.84±0.78）%]比較，模型組小鼠腦組織中Iba1蛋白呈聚集現(xiàn)象，其表達(dá)陽性率[（42.18±2.32）%]顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，30、60 mg/kg CA組小鼠腦組織中Iba1蛋白有所減少，其表達(dá)陽性率[分別為（17.38±1.86）%、（9.27±1.61）%]均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 CA對小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞激活影響的免疫熒光染色圖（Iba1標(biāo)記，×200）

3.1.4 CA 對小鼠腦組織中TLR4 及其下游炎癥因子表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中TLR4 及其下游炎癥因子TNF-α、iNOS、IL-1β蛋白的相對表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，30、60 mg/kg CA組小鼠腦組織中上述蛋白的相對表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 CA 對小鼠腦組織中TLR4 及其下游炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

3.1.5 CA對小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組小鼠腦組織中凋亡細(xì)胞陽性率[（4.74±0.57）%]比較，模型組小鼠相應(yīng)部位凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞陽性率[（45.18±2.74）%]顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，30、60 mg/kg CA組小鼠相應(yīng)部位凋亡細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞陽性率[分別為（23.38±1.86）%、（10.87±2.04）%]均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 CA對小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL染色，×200）

3.2 體外細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 CA 對原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4 及其下游炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，RBC 組細(xì)胞中TLR4 及其下游炎癥因子TNF-α、iNOS和IL-1β蛋白的相對表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.05）；與RBC 組比較，20、40 μmol/L CA 組細(xì)胞中TLR4 及其下游炎癥因子TNF-α、iNOS 和IL-1β 蛋白的相對表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），結(jié)果見圖6。

圖6 CA對原代小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4及其下游炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

3.2.2 CA對原代神經(jīng)元和原代小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元凋亡的影響

與對照組共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元的存活率[（88.15±4.42）%]比較，RBC 組共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元的存活率[（32.85±3.45）%]顯著降低（P＜0.05）；而與RBC 組比較，20、40 μmol/L CA 組共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元的存活率[分別為（53.38±4.57）%、（69.94±4.66）%]均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖7。

圖7 CA對原代神經(jīng)元凋亡影響的免疫熒光染色圖（NeuN標(biāo)記，×200）

4 討論

腦出血是一種極具破壞性的卒中亞型，可導(dǎo)致原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[1—2]。原發(fā)性腦損傷通常由于血腫形成、壓迫相鄰的腦組織而造成機(jī)械性損傷；繼發(fā)性腦損傷則與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、鐵的細(xì)胞毒性和凝血酶等有關(guān)[11—12]。目前，微創(chuàng)手術(shù)可減少患者的原發(fā)性腦損傷，但尚無有效手段緩解腦出血后繼發(fā)性腦損傷。

炎癥反應(yīng)在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中起關(guān)鍵作用[2，4]。當(dāng)腦出血發(fā)生后，大量的RBC進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，并逐漸裂解釋放各種有毒物質(zhì)（如游離血紅素、鐵離子等），進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLR4參與各種炎癥介質(zhì)的分泌過程和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程，該分子及其下游信號通路都是導(dǎo)致腦出血后炎癥損傷的關(guān)鍵因素[5—6]。已有動物實(shí)驗(yàn)表明，一方面血紅素以TLR4 依賴性方式激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后其特異性的標(biāo)記蛋白Iba1表達(dá)顯著升高[13]；另一方面血紅素也可顯著上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4和TNF-α等促炎因子的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，被激活后可分泌大量促炎因子（TLR4、TNF-α、IL-1β 等），從而加重炎癥損傷，可見激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是腦出血后促炎因子的主要來源[14—15]，也是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的重要原因[11，16]。敲除TLR4基因或應(yīng)用TLR4 抗體可抑制血紅素誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，可顯著改善小鼠的神經(jīng)功能缺損和腦水腫情況[17—18]。因此，TLR4 是誘導(dǎo)腦出血后急性炎癥反應(yīng)的主要信號分子，抑制TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是治療腦出血的重要有效途徑[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CA 能在體內(nèi)下調(diào)腦出血病變及周邊組織中TLR4及其下游促炎因子的表達(dá)，抑制小鼠腦出血病變及周邊組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活；在體外下調(diào)RBC裂解液激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4 及其下游促炎因子的表達(dá)，減少了原代神經(jīng)元與原代小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元的凋亡，這些可能是腦出血后CA發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制。

目前，腦出血仍缺乏有效的治療藥物，尋找有效、低毒的治療藥物是臨床亟待解決的問題。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血模型小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CA 能夠減少其腦出血體積、腦含水量、腦出血后的神經(jīng)功能缺損；同時(shí)，在模擬腦出血的原代神經(jīng)元與原代小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)中，CA能夠減少神經(jīng)元的凋亡。

上述結(jié)果都證實(shí)了CA在腦出血中可發(fā)揮腦保護(hù)作用，且這種作用與其抑制TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，可見CA具有治療腦出血的潛力。本研究存在一定的局限性：TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號通路的激活和調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，本研究未深入研究CA 調(diào)控TLR4 的具體機(jī)制，也未使用TLR4基因敲除動物進(jìn)行驗(yàn)證。總之，CA可以通過抑制TLR4 減少腦出血后繼發(fā)的急性炎癥損傷，但更為詳細(xì)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。