駢永茹 李婧怡 李勤奮 王歡 李玉 楊陽(yáng)

摘 要：? 為優(yōu)化巨大側(cè)耳原生質(zhì)體的制備條件，該研究以兩株不同溫型的巨大側(cè)耳菌株P(guān)G46和PG79為材料，采用單因素和正交試驗(yàn)方法對(duì)原生質(zhì)體制備的菌絲體菌齡、穩(wěn)滲劑種類、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）在單因素實(shí)驗(yàn)中，巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備的適宜條件為菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1甘露醇，32 ℃（PG46）或27～35 ℃（PG79）酶解4 h。（2）正交試驗(yàn)驗(yàn)證并優(yōu)化了單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，組合2（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32 ℃酶解4 h）可同時(shí)作為PG46和PG79原生質(zhì)體制備的最適條件，原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為11.22×106 CFU·mL-1和7.28×106 CFU·mL-1。（3）F-test檢驗(yàn)中，各因素對(duì)原生質(zhì)體制備的影響程度依次為菌齡＞溶壁酶濃度＞酶解溫度＞酶解時(shí)間（PG46），菌齡＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞溶壁酶濃度（PG79）。綜上所述，兩株不同溫型巨大側(cè)耳菌株的原生質(zhì)體制備條件基本一致，菌齡對(duì)兩菌株原生質(zhì)體得率的影響程度最顯著。該研究結(jié)果可為后續(xù)巨大側(cè)耳的雜交育種、遺傳轉(zhuǎn)化、全基因組測(cè)序等工作奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步推動(dòng)巨大側(cè)耳分子遺傳學(xué)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞： 巨大側(cè)耳， 不同溫型， 熱區(qū)， 原生質(zhì)體產(chǎn)量， 制備條件

中圖分類號(hào)：? Q94

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2023）07-1308-09

收稿日期：? 2022-11-10

基金項(xiàng)目：? 海南省自然科學(xué)基金（322QN365）； 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1630042022003， 1630042022020）。

第一作者： 駢永茹（1999-），碩士研究生，研究方向?yàn)槭秤镁z傳育種，（E-mail）pianyongru@163.com。

通信作者：? 楊陽(yáng)，博士，助理研究員，研究方向?yàn)槭秤镁N質(zhì)資源評(píng)價(jià)和遺傳育種，（E-mail）yyjob1992@163.com。

Optimization of protoplast preparation conditions

of Pleurotus giganteus

PIAN Yongru1，2， LI Jingyi1，3， LI Qinfen1，3， WANG Huan4， LI Yu5， YANG Yang1，3*

（ 1. Key Laboratory of Low Carbon Green Agriculture in Tropical China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Environment

and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China; 2. Institute of Applied Mycology，

College of Plant Science Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China; 3. National Agricultural Experimental

Station for Agricultural Environment， Danzhou 571700， Hainan， China; 4. Changchun University of Chinese Medicine，

Changchun 130117， China; 5. Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and

Medicinal Fungi， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China ）

Abstract：? In order to obtain the optimal conditions for the protoplast preparation of Pleurotus giganteus， two strains， PG46 and PG79， with different temperature types， were selected as materials to study the effects of five factors （mycelial age， osmotic stabilizer type， lywallzyme concentration， enzymatic hydrolysis duration and enzymatic hydrolysis temperature） based on single factor and orthogonal experimental methods. The results were as follows： （1） In the single factor test， the optimal conditions for the protoplast preparation of P. giganteus were mycelial culture for 5 d， using 2.5% lywallzyme with 0.6 mol·L-1 mannitol， incubated for 4 h at 32 ℃ （PG46） or 27-35 ℃ （PG79）. （2） Orthogonal experiment verified and optimized the single factor test results. Combination 2 （mycelial age 5 d， lywallzyme concentration 2.5%， 0.6 mol·L-1 mannitol， incubated for 4 h at 32 ℃） could be used as the optimal condition for the protoplast preparation of PG46 and PG79 at the same time， and the protoplast yields were 11.22 × 106 CFU·mL-1 and 7.28 × 106 CFU·mL-1， respectively. （3） For F-test， the influence degree of various factor on the protoplast preparation were mycelial age>lywallzyme concentration>enzymatic hydrolysis temperature>enzymatic hydrolysis duration （PG46）， and mycelial age>enzymatic hydrolysis duration>enzymatic hydrolysis temperature>lywallzyme concentration （PG79）， respectively. In conclusion， the protoplast preparation conditions of the two P. giganteus strains with different temperature types were basically the same， and the effects of mycelial age on the protoplasts yield of the two strains were the most significant. The results can lay a foundation for further cross-breeding， genetic transformation， whole genome sequencing and promote the molecular genetics development of P. giganteus.

Key words： Pleurotus giganteus， different temperature types， tropics， protoplast yield， preparation condition

巨大側(cè)耳（Pleurotus giganteus），是國(guó)內(nèi)開發(fā)的一種珍稀食用菌，其口感和風(fēng)味獨(dú)特，有豬肚般的滑膩，因而具有商品名“豬肚菇”（董洪新等，2010；Karunarathna et al.， 2012）。巨大側(cè)耳營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌、保護(hù)肝臟等多種藥用功效，深受消費(fèi)者喜愛（Phan et al.， 2014；Paravamsivam et al.， 2016）。于海龍等（2021）

研究發(fā)現(xiàn)，巨大側(cè)耳環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高，并且適宜在溫度較高的夏季栽培，對(duì)調(diào)節(jié)食用菌市場(chǎng)供應(yīng)和反季節(jié)栽培，特別是熱區(qū)食用菌生產(chǎn)具有重要意義。隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，巨大側(cè)耳的遺傳育種工作尤為重要（吳碧君，2020）。原生質(zhì)體是指完整細(xì)胞去除細(xì)胞壁后，裸露出的一個(gè)具有生理功能的圓球體，仍含有整套的遺傳信息，并且具有較好的生理活性，是食用菌分子遺傳學(xué)研究的良好材料（Muralidhar & Panda， 2000））。近年來(lái)，原生質(zhì)體單核化技術(shù)，已成功應(yīng)用到食用菌生理生化、菌種復(fù)壯、遺傳轉(zhuǎn)化、遺傳育種和全基因組測(cè)序等工作中（Dai et al.， 2017；Sugano et al.， 2017；Raman et al.， 2021；劉海娟，2021），極大地推進(jìn)了食用菌研究的深入開展。因此，對(duì)巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備進(jìn)行系統(tǒng)研究，有助于進(jìn)一步推進(jìn)巨大側(cè)耳遺傳育種工作的開展。

目前，關(guān)于原生質(zhì)體的制備在糙皮側(cè)耳（Peng et al.， 1993）、刺芹側(cè)耳（Obatake et al.， 2003）、黃白側(cè)耳（Mizoguchi et al.， 2006）、靈芝（李欽艷等，2016）、木耳（崔瑋潔等，2019）和雙孢蘑菇（李良敏等，2020）等多個(gè)食用菌物種中得到廣泛研究。崔瑋潔等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體的制備屬于一種酶促反應(yīng)過(guò)程，其影響因素十分復(fù)雜，不同菌株甚至同一菌株不同生理狀態(tài)下，其原生質(zhì)體制備條件也不盡相同。蘇文英等（2020）發(fā)現(xiàn)菌齡是原生質(zhì)體制備的重要因素，玉木耳菌株在不同菌齡下，其原生質(zhì)體制備條件存在較大差異。彭智華等（2000）基于單一變量原則，對(duì)1株野生巨大側(cè)耳菌株的原生質(zhì)體分離條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體產(chǎn)量會(huì)受到酶解液、穩(wěn)滲劑、菌齡和pH的影響，并篩選到適宜的原生質(zhì)體制備條件，但其制備率和再生率仍不高。鄒彰毅和鄧百萬(wàn)（2020）、孫佳星等（2022）基于正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法，進(jìn)一步優(yōu)化了單因素結(jié)果，分別獲得了姬松茸和玉木耳原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件，極大地提高了原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量。可見，原生質(zhì)體的制備受到多種因素的影響，且各因素間的交互作用也十分重要。然而，關(guān)于巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備的研究較少，各因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響程度及各因素間的交互作用也尚不明確，在一定程度上限制了巨大側(cè)耳遺傳育種工作的快速發(fā)展。

因此，本研究以前期篩選到的兩株不同溫型的巨大側(cè)耳菌株為材料，采用單因素和正交試驗(yàn)的方法，對(duì)巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備中的菌絲體菌齡、溶壁酶濃度、穩(wěn)滲劑種類、酶解溫度和時(shí)間共5個(gè)關(guān)鍵影響因子進(jìn)行研究。以期明確兩株不同溫型巨大側(cè)耳菌株的原生質(zhì)體制備條件及差異，針對(duì)性提高巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備效率。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步開展巨大側(cè)耳的雜交育種、全基因組測(cè)序和品種改良等奠定良好基礎(chǔ)，進(jìn)而有效推動(dòng)巨大側(cè)耳遺傳育種工作的深入開展。

1 材料與方法

1.1 材料

兩株不同溫型的巨大側(cè)耳菌株，分別為高溫型菌株P(guān)G46和中溫型菌株P(guān)G79（表1）。菌種現(xiàn)保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所菌種保藏中心。

MYG液體培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，加水混勻后，定容至1 L。

再生培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，瓊脂20 g，0.6 mol·L-1甘露醇，加水混勻后，定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 將活化好的菌絲體接入MYG液體培養(yǎng)基中，于轉(zhuǎn)速150 r·min-1、26 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d。無(wú)菌條件下，過(guò)濾菌絲體，并先后用無(wú)菌水和穩(wěn)滲劑（0.6 mol·L-1的甘露醇）各沖洗2次。將菌絲體置于濾紙上吸干，并稱取300 mg左右放入1.5 mL離心管中，加入3倍體積的2.0%濃度的溶壁酶溶液（0.02 g溶壁酶，1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇）。輕攪混勻后放入30 ℃的恒溫金屬浴中，酶解4 h得到原生質(zhì)體粗提液。用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾后，3 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液。用0.6 mol·L-1的甘露醇輕輕沖洗管壁2次，去除多余酶解液，加入1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇以懸浮沉淀，制成原生質(zhì)體原液。

1.2.2 原生質(zhì)體再生 用0.6 mol·L-1的穩(wěn)滲劑，將原生質(zhì)體原液稀釋不同倍數(shù)，并在血球計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)。分別吸取200 μL各稀釋倍數(shù)的原生質(zhì)體溶液，均勻涂布到再生培養(yǎng)基上，無(wú)菌水稀釋的原生質(zhì)體作對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均置于26 ℃恒溫暗培養(yǎng)，每天觀察菌落再生情況。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)置菌齡（3、5、7、9、11 d）、溶壁酶濃度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、穩(wěn)滲劑種類（甘露醇、山梨醇、蔗糖、硫酸鎂、氯化鉀）、酶解溫度（25、27、30、32、35、38 ℃）和酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）共5個(gè)處理因素（崔瑋潔等，2019；蘇文英等，2020），每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)各因素對(duì)不同溫型巨大側(cè)耳菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別選取菌齡、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間為考察因素，以原生質(zhì)體產(chǎn)量為響應(yīng)值，組成4因素3水平的正交試驗(yàn)（表2），以確定巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備的最適條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的釋放

將兩菌株的菌絲體置于溶壁酶溶液中，在適宜溫度下進(jìn)行酶解。每隔半小時(shí)取一次樣，置于血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放情況。結(jié)果顯示，巨大側(cè)耳的原生質(zhì)體釋放分為3個(gè)階段（圖1）：前期，少量原生質(zhì)體從菌絲體尖端釋放；中期，部分菌絲體側(cè)壁破裂，原生質(zhì)體從菌絲體側(cè)面釋放；后期，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多數(shù)菌絲體細(xì)胞壁破裂，大量原生質(zhì)體釋放出來(lái)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 菌絲體菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 由圖2：A可知，巨大側(cè)耳的原生質(zhì)體產(chǎn)量，隨著菌齡的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在5 d時(shí)，PG46和PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為4.82×106 CFU·mL-1和2.74×106 CFU·mL-1，且與其他菌齡的產(chǎn)量差異顯著；菌齡超過(guò)5 d后，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，特別是11 d時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最低，且低于最開始3 d的產(chǎn)量，分別為0.62×106 CFU·mL-1和0.86×106 CFU·mL-1。綜上可知，兩菌株制備原生質(zhì)體的菌絲體最適菌齡為5 d。

2.2.2 穩(wěn)滲劑種類對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

由圖2：B可知，不同穩(wěn)滲劑中，PG46的原生質(zhì)體產(chǎn)量由高到低依次為甘露醇>山梨醇>蔗糖>硫酸鎂>氯化鉀，最高產(chǎn)量為2.74×106 CFU·mL-1，其中甘露醇、山梨醇和蔗糖三者中的原生質(zhì)體產(chǎn)量無(wú)顯著差異，但均顯著高于硫酸鎂和氯化鉀；PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量由高到低依次為蔗糖>甘露醇>山梨醇>氯化鉀>硫酸鎂，最高產(chǎn)量為1.88×106 CFU·mL-1，前三者產(chǎn)量無(wú)顯著差異，但均顯著高于硫酸鎂和氯化鉀?？梢?，穩(wěn)滲劑類別對(duì)PG46和PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量影響顯著，有機(jī)糖醇類穩(wěn)滲劑甘露醇、山梨醇和蔗糖均為制備巨大側(cè)耳原生質(zhì)體的適宜穩(wěn)滲劑。

2.2.3 溶壁酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

由圖2：C可知，隨著溶壁酶濃度的增加，PG46和PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低。當(dāng)溶壁酶濃度為2.5%時(shí)，兩菌株的原生質(zhì)體產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為7.64×106 CFU·mL-1和7.38×106 CFU·mL-1；當(dāng)濃度為3.0%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降且與2.5%濃度的原生質(zhì)體產(chǎn)量具有顯著差異?？梢姡苽渚薮髠?cè)耳原生質(zhì)體的最適溶壁酶濃度為2.5%。

2.2.4 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響 由圖2：D可知，隨著酶解溫度的升高，PG46和PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度為32 ℃時(shí)，PG46的原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最高，為6.22×106 CFU·mL-1，且與其他酶解溫度差異顯著；PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量也在32 ℃時(shí)達(dá)到最高，為3.54 ×106 CFU·mL-1，但與27、30、35 ℃的原生質(zhì)體產(chǎn)量無(wú)顯著差異。綜上可見，PG46原生質(zhì)體制備的最適酶解溫度為32 ℃，PG79原生質(zhì)體制備的適宜酶解溫度較廣，為27～35 ℃。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

由圖2：E可知，PG46和PG79的原生質(zhì)體產(chǎn)量，隨酶解時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，兩菌株的原生質(zhì)體產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為9.12×106 CFU·mL-1和6.48×106 CFU·mL-1，但均與酶解時(shí)間5 h無(wú)顯著差異；當(dāng)酶解時(shí)間大于5 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著下降。因此，4～5 h為制備巨大側(cè)耳原生質(zhì)體的適宜酶解時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)交互作用分析結(jié)果

為探究不同因素對(duì)原生質(zhì)體制備的交互影響，采用正交試驗(yàn)的方法，進(jìn)一步探究制備巨大側(cè)耳原生質(zhì)體的最適條件。由表3可知，9種正交組合均可用于PG46的原生質(zhì)體制備和再生。其中，原生質(zhì)體得率最高的為組合2（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.5%，0.6 mol·L-1的甘露醇，32 ℃酶解4 h），原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)11.22×106 CFU·mL-1，顯著高于其他組合。原生質(zhì)體再生率最高的為組合1（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30 ℃酶解3 h），再生率達(dá)1.20%?？梢?，PG46原生質(zhì)體再生與原生質(zhì)體制備的最適條件存在一定差異。由表3和表4可知，4個(gè)主要因素對(duì)PG46原生質(zhì)體制備的影響程度大小依次為菌齡>溶壁酶濃度>酶解溫度>酶解時(shí)間，且各因素影響差異極顯著（P<0.001）。

由表5可知，9種正交組合均可用于PG79的原生質(zhì)體制備，但部分組合不適宜其原生質(zhì)體再生。其中，PG79原生質(zhì)體得率最高的為組合3（菌齡5 d，溶壁酶濃度3.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，35 ℃酶解5 h），原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)7.28×106 CFU·mL-1，但與組合1和組合2的原生質(zhì)體得率無(wú)顯著差異。原生質(zhì)體再生率最高的為組合1（菌齡5 d，溶壁酶濃度2.0%，0.6 mol·L-1的甘露醇，30 ℃酶解3 h），再生率為0.45%。但是，在原生質(zhì)體最適制備條件下，原生質(zhì)體再生率為0。由表5和表6可知，各因素對(duì)PG79原生質(zhì)體制備的影響程度依次為菌齡>酶解時(shí)間>酶解溫度>溶壁酶濃度，且各因素影響差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法，對(duì)2株不同溫型的巨大側(cè)耳菌株原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素（菌絲體菌齡、穩(wěn)滲劑種類、溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，以期明確巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備的適宜條件。結(jié)果表明，組合2是PG46的最適組合，組合1、2、3是PG79的適宜條件組合，而組合3條件下再生率為0，因此PG79的最適條件是組合1和組合2。因此，組合2可同時(shí)作為PG46和PG79的適宜條件。同時(shí)也說(shuō)明，各影響因素間存在一定的交互作用，在進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)不可忽略。F-test分析顯示，菌絲體菌齡對(duì)兩株巨大側(cè)耳菌株的原生質(zhì)體產(chǎn)量影響均為極顯著，但溶壁酶濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)兩菌株的影響程度存在差異。推測(cè)是由于巨大側(cè)耳的遺傳多樣性豐富，PG46和PG79菌株間產(chǎn)生了遺傳分化（Dai et al.， 2019）。

菌株的生理狀態(tài)和不同的酶解條件，對(duì)食用菌原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量均具有不同程度的影響（孫佳星等，2022）。在本研究中，菌絲體的菌齡，是影響巨大側(cè)耳原生質(zhì)體制備的最主要因素。不同時(shí)期的菌絲體，細(xì)胞壁厚度和生長(zhǎng)活力不同，對(duì)溶壁酶的敏感性也存在差異（張文學(xué)等，2003）。在菌絲生長(zhǎng)前期，細(xì)胞壁較薄，更易被溶壁酶降解，隨著菌齡的繼續(xù)增加，細(xì)胞壁逐漸加厚且產(chǎn)生的次生物質(zhì)增多，酶解效率降低，進(jìn)而導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量下降（Kim et al.， 2000）。本研究前期對(duì)巨大側(cè)耳菌絲體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)第5天正是巨大側(cè)耳菌絲體生長(zhǎng)的指數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞壁厚度和菌絲體活力均適宜，可作為原生質(zhì)體制備的理想時(shí)期和材料。

由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁，對(duì)外界環(huán)境十分敏感，穩(wěn)滲劑可保持原生質(zhì)體內(nèi)外的壓力平衡，避免其破裂或皺縮（Pasternak et al.， 2002）。同時(shí)，穩(wěn)滲劑在細(xì)胞與溶壁酶的反應(yīng)中起媒介作用，其性質(zhì)影響溶壁酶的反應(yīng)活性，因此穩(wěn)滲劑的選擇非常重要（劉玉霞等，2009）。本研究中，以甘露醇、山梨醇和蔗糖為穩(wěn)滲劑時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量均較高，且顯著高于硫酸鎂和氯化鉀。前人研究也發(fā)現(xiàn)，有機(jī)糖醇穩(wěn)滲劑和無(wú)機(jī)鹽穩(wěn)滲劑在食用菌原生質(zhì)體制備中影響差異很大（鄒彰毅等，2020；孫佳星等，2022）。產(chǎn)生這一結(jié)果可能是因?yàn)橛袡C(jī)糖醇不僅能維持滲透壓平衡，還能促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，進(jìn)而提高了酶促反應(yīng)的產(chǎn)量（譚文輝等，2006）。

溶壁酶是裂解細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體的關(guān)鍵，酶的類型和濃度可以影響原生質(zhì)體的活力和數(shù)量（Kanchanapoom & Jantaro， 2001）。

李光環(huán)（2018）研究發(fā)現(xiàn)，單一的溶壁酶適合多種食用菌的原生質(zhì)體制備，在保證較高效率的同時(shí)成本也較低。但由于不同真菌的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)不同，不同濃度的溶壁酶的酶解效果也會(huì)有所差異。本研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，溶壁酶濃度越高，原生質(zhì)體產(chǎn)量越高，但濃度超過(guò)2.5%后，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始下降。這可能是因?yàn)槊笣舛冗^(guò)高會(huì)對(duì)原生質(zhì)體的膜造成影響，使得細(xì)胞脫壁太徹底，后期也會(huì)影響原生質(zhì)體的再生（孫劍秋和周東波，2002）。

在相同的溶壁酶濃度下，酶解溫度和酶解時(shí)間是影響破壁效果的關(guān)鍵。根據(jù)酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)原理，酶解溫度直接影響酶促反應(yīng)的速度，還會(huì)影響細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，適宜的酶解溫度有助于溶壁酶發(fā)揮最佳的裂解作用。本研究中，32 ℃為兩菌株的最適酶解溫度，低于該溫度時(shí)需適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間來(lái)獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量，高于該溫度時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量下降且再生率也降低。一方面，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)低時(shí)，酶活力不足，且菌絲生理代謝慢，導(dǎo)致酶解反應(yīng)較慢；溫度過(guò)高，會(huì)破壞酶的穩(wěn)定性，降低溶壁酶活性和損傷已游離的原生質(zhì)體，進(jìn)一步影響細(xì)胞再生率（張麗霞和郭成金，2008；賀婷和郭成金，2012）。另一方面，酶解時(shí)間可以影響酶促反應(yīng)的程度，適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間可獲得較高的原生質(zhì)體釋放量。本研究中，兩菌株的最適酶解時(shí)間均為4 h，超過(guò)4 h原生質(zhì)體產(chǎn)量開始下降。推測(cè)是因?yàn)槭ゼ?xì)胞壁的原生質(zhì)體穩(wěn)定性下降，由于酶的作用及滲透作用，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。并且原生質(zhì)體再生時(shí)需要一定量的細(xì)胞壁酶解殘余物，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶解殘余物過(guò)少甚至消失（郭成金和趙潤(rùn)，2009）。王昱等（2013）研究也發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，較早釋放出的原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)而破裂，其活性下降難于再生。因此，適宜的酶解時(shí)間尤為重要。

綜上所述，兩株不同溫型巨大側(cè)耳菌株的原生質(zhì)體制備的最適條件相同，但各因素對(duì)兩菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響不同。因此，在制備巨大側(cè)耳不同菌株的原生質(zhì)體時(shí)，應(yīng)按照各菌株情況和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。本研究結(jié)果可為后續(xù)的巨大側(cè)耳雜交育種、遺傳轉(zhuǎn)化、全基因組測(cè)序等工作奠定基礎(chǔ)，有利于推動(dòng)巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）