金萍，楊洪霄，任雪嬌

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

番石榴又叫拿果、嗽叭果、芭樂(lè)、拔子、雞矢果等[1]，具有極佳的風(fēng)味，口感清爽，是一種生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)的水果[2]。番石榴營(yíng)養(yǎng)豐富，可補(bǔ)充多種維生素及鉀、葉酸、多糖、有機(jī)酸等微量元素，還可改善胰島的功效，因此番石榴具有抗菌、健腦的及提高免疫力的功效及其他多種保健功能[3]。

多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒抗癌及降血糖等多種功效[4]。國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究結(jié)果也表明多糖在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖、抗病毒等方面具有十分良好的活性作用[5-8]。因此如何能夠提高番石榴多糖提取率成為研究課題之一。番石榴多糖提取常用的方法有水溶劑提取法、酶解法、微波輔助提取法、超聲輔助提取[9-10]。試驗(yàn)探究水溶劑提取番石榴多糖后使用乙醇沉淀法的工藝最優(yōu)條件。

試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、料液比4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳提取番石榴多糖的工藝，為大規(guī)模提取番石榴多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

番石榴（市售）。

1.2 試劑

三氯乙酸、活性炭、正丁醇、98%硫酸、苯酚、葡萄糖（AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠）。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、3-HPA粉碎機(jī)（上海棱光技術(shù)有限公司）；EPPENDORFCENTRIFUGE5415D離心機(jī)、SHZ-D-3循環(huán)水式真空泵、SKFG-01電熱恒溫干燥箱（鞏義市宇翔儀器有限公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（浙江力辰儀器科技有限公司）；電動(dòng)攪拌器（上海坤天試驗(yàn)室儀器有限公司）；SHA-B恒溫水浴振蕩器、YP-B電子天平（浙江力辰儀器科技有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度分別為0.00，10.00，20.00，40.00，50.00，60.00和70.00 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL至潔凈試管中，繼續(xù)依次加入1.00 mL 5%苯酚溶液、5.00 mL濃硫酸，振蕩均勻，在室溫靜置6 min，用水浴鍋沸水繼續(xù)反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后取出，將溶液冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定其體系吸光度。以吸光度A對(duì)葡萄糖濃度c（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=3.62×10-3c-6.43×10-4，R2=0.996 5。

1.4.2 番石榴多糖的提取工藝流程

質(zhì)地良好的番石榴→挖出果肉→烘干→磨成粉末→采用水溶劑提取法提取→利用活性炭進(jìn)行脫色→Sevage法脫蛋白→過(guò)濾→測(cè)定吸光度。

1.4.3 番石榴多糖提取率的測(cè)定

用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定多糖提取率時(shí)將吸光度帶入方程中，按照式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：c為提取液多糖濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為番石榴粉末質(zhì)量，mg。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

1.4.4.1 不同提取溫度對(duì)番石榴多糖提取率的影響

精確稱取1.0 g番石榴粉末，固定液料比35∶1（mL/g）、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)3次，研究不同溫度（35，45，55，65和75 ℃）對(duì)多糖提取率的影響效果。

1.4.4.2 不同液料比對(duì)番石榴多糖提取率的影響

精確稱取番石榴粉末，固定提取溫度55 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)3次，研究不同液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1 mL/g）對(duì)多糖提取率影響。

1.4.4.3 不同提取時(shí)間對(duì)番石榴多糖提取率的影響

稱取1.0 g番石榴粉末，固定提取溫度55 ℃、液料比25∶1（mL/g）、提取次數(shù)3次，研究不同提取時(shí)間（25，30，35，40和45 min）對(duì)多糖提取率的影響。

1.4.4.4 不同提取次數(shù)對(duì)番石榴多糖提取率的影響

精確稱取1.0 g番石榴粉末，固定提取溫度55 ℃、液料比35∶1（mL/g）、提取時(shí)間40 min，研究不同提取次數(shù)（1，2，3，4和5次）對(duì)多糖提取率的影響。

1.4.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

1.4.6 試驗(yàn)指標(biāo)

試驗(yàn)以粗多糖提取率為指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對(duì)粗多糖提取率的影響

圖1表明，在35～55 ℃范圍內(nèi)，番石榴中多糖提取率與溫度的高低呈正比，提取溫度55 ℃時(shí)，多糖提取率6.24%達(dá)到峰值。55～75 ℃時(shí)，多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于溫度的升高，多糖分子會(huì)遭到破壞使其喪失活性從而降低提取率。因此，最適提取溫度為55 ℃。

圖1 提取溫度變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

2.1.2 液料比變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

圖2表明，整體來(lái)看，番石榴的多糖提取率與液料比呈線性關(guān)系，液料比35∶1（mL/g）時(shí)，番石榴中多糖提取率為6.44%，達(dá)到峰值。隨著液料比增大，多糖提取率趨于不變或有下降趨勢(shì)。這是由于隨著體積的增大，多糖分子會(huì)向體系外擴(kuò)散，從而使提取率上升。體積繼續(xù)增大會(huì)有各種雜質(zhì)增多，從而使提取率下降。所以，最適液料比為35∶1 （mL/g）。

圖2 液料比變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

圖3表明，提取時(shí)間20～40 min時(shí)，多糖提取率隨著時(shí)間的增加而增大。提取時(shí)間40 min時(shí)，番石榴多糖提取率為6.235%，達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移，多糖提取率反而降低，這是因?yàn)樘崛r(shí)間增加，使雜質(zhì)進(jìn)入，因此使提取率降低。所以，最適提取時(shí)間設(shè)定為40 min。

圖3 提取時(shí)間變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

圖4表明，提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖提取率為6.287 5%，達(dá)到峰值。提取次數(shù)大于2次時(shí)多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。然而提取次數(shù)變多，溶劑量也隨之變多，可能導(dǎo)致溶出的多糖中帶有雜質(zhì)，并且加大濃縮工作難度。綜合上述情況，番石榴多糖最適提取次數(shù)為2次。

圖4 提取次數(shù)變化對(duì)番石榴多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

響應(yīng)面結(jié)果與分析如表2所示。

表2 響應(yīng)面的結(jié)果與分析

以溫度、時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為自變量，以提取率為響應(yīng)值。對(duì)各因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立番石榴多糖提取與提取率的二次多項(xiàng)式方程：Y=6.75+0.16A+0.25B-0.18C+0.32D-0.26AB+0.20AC+0.18AD-1.13BC-0.13BD+0.65CD-0.57A2-0.67B2-0.85C2-0.84D2。由表3可看出：所建立模型的P＜0.01，極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，可看出模型可靠。經(jīng)過(guò)方差分析，根據(jù)F值可看出4個(gè)因素對(duì)膽固醇降低率影響的主次順序?yàn)橐毫媳龋咎崛r(shí)間＞提取次數(shù)＞提取溫度。

表3 響應(yīng)面方差分析

根據(jù)圖5響應(yīng)面圖和3D圖可進(jìn)行分析交互作用及變化趨勢(shì)。由圖5（a）可知，隨著提取次數(shù)和液料比的升高，番石榴多糖提取率為先增加后降低趨勢(shì)，并且響應(yīng)面呈現(xiàn)凸型，等高線為橢圓形，說(shuō)明提取次數(shù)和料液比交互作用較強(qiáng)且有最大值。由圖5（b）可知，隨著提取時(shí)間和液料比增加，多糖提取率出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，響應(yīng)面呈凸形，等高線為橢圓形，表明提取時(shí)間和料液比交互作用有最大值。由圖5（c）可知，隨著提取時(shí)間和提取次數(shù)的增加，多糖提取率出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，響應(yīng)面呈現(xiàn)凸型，并且等高線為橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間和提取次數(shù)交互作用較強(qiáng)且有最大值。由圖5（d）可以看出，隨著溫度與料液比的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，響應(yīng)面呈凸型并且等高線為橢圓形，說(shuō)明溫度和料液比交互作用較強(qiáng)且有最大值。由圖5（e）可看出，隨著溫度和提取次數(shù)的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，響應(yīng)面呈現(xiàn)凸型，并且等高線為偏橢圓形。由圖5（f）可以看出，隨著溫度和提取時(shí)間的增加，多糖提取率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，且響應(yīng)面呈現(xiàn)凸型。

圖5 響應(yīng)面圖與3D圖

2.3 最佳提取條件的確定

通過(guò)Design Expert 8.0軟件求解所得回歸方程，得出最佳提取的工藝參數(shù)：提取溫度56.26 ℃、提取時(shí)間40.73 min、提取次數(shù)1.97、液料比36.84∶1（mL/g），預(yù)測(cè)的提取率為6.812 92%?？紤]到在試驗(yàn)過(guò)程的可操作性，將番石榴多糖提取最優(yōu)工藝調(diào)整為提取溫度55 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)2次、料液比35∶1（mL/g），按照最佳工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，用以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度，共設(shè)置5次平行試驗(yàn)，番石榴多糖的提取率都為6.82%，證明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度較高，與預(yù)測(cè)值基本相符，表明方法可行。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面試驗(yàn)法和單因素試驗(yàn)法，研究從番石榴中分離出的粗多糖的最佳工藝參數(shù)。提出的優(yōu)化生產(chǎn)工藝參數(shù)為提取溫度55 ℃、液料比35∶1（mL/g）、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)2次，此時(shí)粗多糖提取率最高，為6.82%，含量測(cè)定則通過(guò)苯酚-硫酸法。水溶劑提取法可較為有效地提取出番石榴多糖。