何榮強(qiáng)

海南省食品藥品檢驗(yàn)所三亞分所（三亞 572000）

大腸菌群是需氧和兼性厭氧，在一定條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，生化反應(yīng)為觸酶陽(yáng)性、氧化酶陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希菌（Escherichia）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella）等。大腸菌群作為衡量食品的一個(gè)重要衛(wèi)生指標(biāo)，其含量表明食品被糞便污染的程度和有無(wú)腸道致病菌污染的可能，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。據(jù)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2007—2017年，5.6%的國(guó)內(nèi)微生物食源性疾病事件是由大腸菌群引起的[1]。

快速檢測(cè)紙片是將選擇性培養(yǎng)基和目標(biāo)菌株的顯色底物混合后依附于濾紙片上制成的檢測(cè)紙片，菌體通過(guò)吸收濾紙片的培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖。因檢測(cè)前處理簡(jiǎn)單，處理時(shí)間短，檢測(cè)后無(wú)污染性物質(zhì)，符合環(huán)保要求，具有方便、快捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，給檢驗(yàn)工作帶來(lái)很大便利?？焖偌埰赏瑫r(shí)進(jìn)行取樣和接種工作，減少二者操作的時(shí)間差進(jìn)而在一定范圍內(nèi)避免不必要的細(xì)菌增殖帶來(lái)的污染，從而得到更加真實(shí)的檢驗(yàn)結(jié)果?？焖偌埰诠?jié)省人力、物力上也提供技術(shù)保障，許多一線檢測(cè)機(jī)構(gòu)因場(chǎng)地所限，不便購(gòu)買更多儀器設(shè)備來(lái)滿足檢測(cè)需求，而采用紙片法則很好地解決這個(gè)問(wèn)題[2]。美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）官方方法990.12《食品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)再水化干膜法》[3]和加拿大的MFHPB-33食品菌落總數(shù)3M法[4]都采用紙片法檢測(cè)食品中菌落總數(shù)。但國(guó)內(nèi)實(shí)踐中，只有GB 14934—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 消毒餐（飲）具》附錄B大腸菌群檢驗(yàn)[5]及GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》4.2菌落總數(shù)測(cè)試片[6]，采用快速紙片法檢驗(yàn)。盡管快速紙片法和國(guó)標(biāo)傳統(tǒng)方法檢驗(yàn)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)中沒(méi)有太大差別[7]，但是實(shí)踐發(fā)現(xiàn)快速紙片法檢驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)結(jié)果模糊不清，不易判斷，檢驗(yàn)結(jié)果少于實(shí)際菌落數(shù)等情況[8]，故對(duì)此問(wèn)題影響因素進(jìn)行一些深入探討。

1 產(chǎn)品研發(fā)工藝影響

國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的大腸菌群檢測(cè)紙片質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)企業(yè)無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)一有效的生產(chǎn)質(zhì)控。此外，不同生產(chǎn)企業(yè)有著各自的產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)路線，難免會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成不同程度影響。

1.1 紙片配方的成分影響

有試驗(yàn)采用紙片配方的正交試驗(yàn)分析對(duì)測(cè)定大腸菌群影響較大的4個(gè)因素，分別是乳糖、膽鹽、蛋白胨和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC），即提供細(xì)菌充足的碳源、氮源，同時(shí)合適濃度的膽鹽和TTC，對(duì)保持大腸菌群的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)同時(shí)抑制其他細(xì)菌并在紙片上有很好的顯現(xiàn)是非常必要的[9]。菊粉添加到大腸菌群檢測(cè)紙片中可以明顯提高飼料大腸菌群檢測(cè)紙片的靈敏度和準(zhǔn)確性，且陽(yáng)性樣本檢出率明顯提高[10]?？焖贉y(cè)試紙片配方上的不斷改進(jìn)是影響檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一。

1.2 添加劑的影響

添加適量的增稠劑可以使紙片浸液體系具有優(yōu)良的增稠性、穩(wěn)定性和水溶性，如0.1%～0.2%質(zhì)量體積比的卡拉膠或魔芋膠、0.1%～0.3%黃原膠等增稠劑的使用均可起到良好的效果[11]。添加乳化劑可使紙片各溶質(zhì)處于良好的分散狀態(tài)，會(huì)增加紙片測(cè)試的均勻度和顯色效果[12]。

1.3 pH對(duì)紙片的影響

紙片浸液在pH 6.5～7.0時(shí)，靈敏度最高，若pH低于6.0，紙片整體顏色偏黃，難以辨明是否有黃暈。在大腸菌群脫氫酶作用下，紙片浸液中的TTC接受氫生成紅色的三苯甲胺和菌落周圍產(chǎn)生的大量黃暈相疊加易呈現(xiàn)橙色[13]，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或抑制菌落生長(zhǎng)而出現(xiàn)假陰性；若高于pH 7.0，大腸菌落數(shù)量少時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸不足，出現(xiàn)可能檢不出的假陰性。

1.4 酸堿指示劑的影響

應(yīng)從反應(yīng)底物以及指示劑變色范圍內(nèi)的pH考慮選擇合適的酸堿指示劑。如溴甲酚紫pH變色范圍5.2～6.8，大腸菌群通過(guò)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使紙片pH下降，可使其顯示黃色，反之為紫色。由于指示劑濃度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響紙片顯色變化的效果，從而影響判斷，故溴甲酚紫質(zhì)量濃度要控制在一定合理范圍內(nèi)，既不會(huì)濃度偏高而抑制大腸菌群的生長(zhǎng)，也不會(huì)因濃度過(guò)低，使紙片上菌落紅點(diǎn)清晰，但菌落周圍產(chǎn)生的黃暈不明顯，而造成假陰性[14]。

1.5 紙片制作參數(shù)影響

濾紙品質(zhì)、吸附能力、表面密度等均會(huì)對(duì)紙片結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，如：濾紙孔過(guò)大，紙片雙面都有菌落生長(zhǎng)而無(wú)法計(jì)數(shù)；濾紙保水性差，無(wú)法保持充分濕度，不利于菌體生長(zhǎng)；濾紙表面密度不均，培養(yǎng)基浸液分布不均，采樣后也無(wú)法很好的擴(kuò)散，致菌體生長(zhǎng)分布不均。此外，2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC）用量要求需嚴(yán)格保證既不能抑制菌體生長(zhǎng)，又能使現(xiàn)象顯著能夠觀察[15]。紙片制作滅菌溫度過(guò)高，培養(yǎng)基浸液溫度過(guò)低，烘干溫度偏高等也可影響紙片的質(zhì)量，如出現(xiàn)紙片顏色不一致、色斑等。

2 檢測(cè)方式方法影響

2.1 不同類型檢品影響

快速紙片法在檢測(cè)餐具、糕點(diǎn)、水質(zhì)與發(fā)酵法檢測(cè)結(jié)果符合率可達(dá)95%以上，但冷凍飲品、鹵菜等檢測(cè)結(jié)果符合率較低[16]。不同類型的檢品因其成分不同，pH不同，會(huì)對(duì)該方法有影響，即檢品成分越復(fù)雜，干擾因素則越多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響就越大。餐具、水質(zhì)其成分對(duì)方法的干擾小，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度就高；反之，冷凍飲品、鹵菜在pH、色素、鹽度方面差異較大，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度就低。

2.2 采樣操作和人員影響

有國(guó)標(biāo)法的應(yīng)嚴(yán)格按照其進(jìn)行采樣[如GB 14934—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 消毒餐（飲）具》]?，F(xiàn)場(chǎng)采樣人員的無(wú)菌操作、是否按紙片操作說(shuō)明流程、操作粘貼時(shí)間的長(zhǎng)短、是否夾取紙片出現(xiàn)破損、是否作空白對(duì)照、檢驗(yàn)人員的高度主觀分析判斷能力及專業(yè)熟練度等都會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 接種方式和接種量影響

濕式紙片接種方式和接種量一般應(yīng)嚴(yán)格按照其產(chǎn)品說(shuō)明書或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，尤其注意接種時(shí)紙片的黏貼或涂抹位置應(yīng)具有代表性。

干式紙片（以FilmplateTM為例）按“5點(diǎn)法”滴加接種，有試驗(yàn)表明：接種量（稀釋后）1.0±0.1 mL時(shí)，紙片上形成單個(gè)紅色菌落并顯示出典型特征；接種量≤0.7 mL時(shí)，紙片易干，色澤暗淡且反應(yīng)不典型；接種量1.3 mL時(shí)，紙片全為淡紫色并有紅暈狀；接種量≥1.5 mL時(shí)，紙片全為淡紫且無(wú)紅暈。紙片吸水量與反應(yīng)結(jié)果密切相關(guān)，應(yīng)以紙片被檢液浸透而又無(wú)多余水分滲出為宜，一般每張（25 cm2）紙片可吸收約1 mL檢液[17]?！?點(diǎn)法”滴加接種并控制接種量1 mL，可使菌落生長(zhǎng)更清晰、更典型，從而增加大腸菌群計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和一致性。

2.4 紙片重疊數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間影響

采樣或點(diǎn)樣結(jié)束后，應(yīng)控制紙片的重疊數(shù)量，一般重疊數(shù)量小于10張，紙片經(jīng)培養(yǎng)均可形成典型的大腸菌落。若重疊數(shù)量過(guò)多，可能出現(xiàn)菌落融合、擴(kuò)散，邊界不清的現(xiàn)象，會(huì)影響到大腸菌群計(jì)數(shù)。在36±1 ℃條件下，培養(yǎng)16～18 h即可觀察結(jié)果。在實(shí)際檢測(cè)中，培養(yǎng)約14 h時(shí)，可對(duì)紙片進(jìn)行一次觀察，若已出現(xiàn)少量典型菌落可繼續(xù)培養(yǎng)至16 h。若菌落數(shù)較多，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)同樣也可能出現(xiàn)菌落融合，邊界不清的現(xiàn)象，從而影響大腸菌群計(jì)數(shù)。

2.5 檢驗(yàn)結(jié)果不典型影響

在紙片法觀察結(jié)果時(shí)，必須考慮樣品的各種因素。雖然生物酶作用特異性和培養(yǎng)液的選擇性對(duì)紙片法較高的準(zhǔn)確性提供保證，能夠很好的觀察典型的陽(yáng)性或陰性反應(yīng)，但無(wú)法觀察是否產(chǎn)氣是紙片法重要的缺陷，而產(chǎn)氣是大腸菌群對(duì)乳糖發(fā)酵主要特征之一。美國(guó)3M公司的PetrifilmTM大腸菌群測(cè)試片含有VRB（Violet Red Bile）培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠以及氯化三苯四氮唑（TTC）作為菌落指示劑，三者增強(qiáng)了大腸菌群計(jì)數(shù)效果。測(cè)試片表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落數(shù)為大腸菌群數(shù)，陽(yáng)性菌落在測(cè)試片上為紅色，同時(shí)耐熱大腸菌群發(fā)酵產(chǎn)生的氣體也可直接被觀察到[18]。在結(jié)果判斷上，大腸菌群檢測(cè)紙片若保持紫色不變?yōu)殛幮?；紙片變黃并在黃色背景上有片狀紅暈或紅色斑點(diǎn)為陽(yáng)性，但對(duì)紙片為紫色，在紫色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)則不太好判斷[19]。有試驗(yàn)表明，在紫色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)的紙片中，用發(fā)酵法確證有50%左右的陽(yáng)性率。此時(shí)，若僅憑個(gè)人經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷陽(yáng)性或陰性可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，要考慮樣品的pH和非發(fā)酵菌的存在，在判斷疑似結(jié)果時(shí)，應(yīng)做發(fā)酵法確證試驗(yàn)來(lái)確定非常有必要。此外，還要考慮檢驗(yàn)采取的方法檢驗(yàn)結(jié)果偏離是否在可接受的范圍內(nèi)，對(duì)這些方法進(jìn)行一致性驗(yàn)證，評(píng)價(jià)檢驗(yàn)的各項(xiàng)參數(shù)，從而確定方法有效性。

3 結(jié)語(yǔ)和展望

快速紙片法顯色劑系統(tǒng)單一，不能對(duì)細(xì)菌有針對(duì)性區(qū)別計(jì)數(shù)，開(kāi)發(fā)更穩(wěn)定高效顯色物質(zhì)十分重要。基于新型熒光染料其熒光特性及在活細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，通過(guò)固定染色溫度，時(shí)間在20～30 min范圍即可快速檢測(cè)[20]，與傳統(tǒng)方法比較具有一致性，且具有較高精密度和準(zhǔn)確度[21]。將快速紙片結(jié)合熒光法檢測(cè)的應(yīng)用可對(duì)微生物進(jìn)行高效檢測(cè)，該方法比美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）規(guī)定方法更加節(jié)省時(shí)間，進(jìn)一步簡(jiǎn)化試驗(yàn)準(zhǔn)備，便于攜帶，更適用于危害分析及關(guān)鍵控制點(diǎn)（HACCP）的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)管。由于酶解產(chǎn)物均以熒光顯示，并將特定物質(zhì)固定化，同時(shí)能夠?qū)κ称分形⑸锖块_(kāi)展定量分析，故有著更廣泛的應(yīng)用前景，但紙片熒光法操作時(shí)仍要注意避免外源熒光物質(zhì)的非特異性干擾，并做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

快速紙片法雖具有方便、快捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)受到各類因素的影響，遇到判斷結(jié)果有可疑的情況，要全面分析，必要時(shí)要做確證試驗(yàn)來(lái)提高大腸菌群檢測(cè)的準(zhǔn)確性，提升食品安全檢測(cè)有效性。各種類型的大腸菌群快速檢測(cè)紙片要質(zhì)量穩(wěn)定可靠，就必須保證其檢測(cè)的特異性、敏感性、抗干擾性、采樣后穩(wěn)定性[22]等指標(biāo)有高標(biāo)準(zhǔn)的全面質(zhì)量控制，能更好保證大腸菌群快檢紙片結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。