姜習(xí)振　楊晨凱　鄒湘香　李洋洋　張慶富　任曉敏　晏偉杰　姚未遠(yuǎn)　賀新穎　胡日生　戶正榮

摘要：為了探究低溫脅迫誘導(dǎo)煙草早花的分子機(jī)制，以低溫敏感品種云煙87為試驗(yàn)材料，在12 ℃低溫條件下處理煙苗14 d ，取莖頂端組織進(jìn)行煙草開(kāi)花調(diào)控基因分析，并調(diào)查統(tǒng)計(jì)了煙株中心花開(kāi)放時(shí)間和葉數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，低溫脅迫導(dǎo)致煙株中心花開(kāi)放時(shí)間平均提前7 d，葉數(shù)平均減少5片?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，低溫脅迫下開(kāi)花調(diào)控基因NtMADS4， NtMADS11，NtAP1，NtSOC1，NtFUL，NtNFL1，NtFT1，NtFT3，NtFT4，NtFT5表達(dá)水平明顯高于對(duì)照，在正常環(huán)境中恢復(fù)生長(zhǎng)7～14 d，表達(dá)量下降至與對(duì)照相近的水平。以上結(jié)果表明，低溫誘發(fā)煙草早花可能與這些基因上調(diào)表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：煙草；低溫脅迫；早花； MADS-box 家族；NtFTs；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S572.03???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A???????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）03-0010-06

Expression Analysis of Flowering Regulatory Genes in Tobacco under Low Temperature Stress

JIANG Xizhen1， YANG Chenkai1，2， ZOU Xiangxiang3， LI Yangyang2， ZHANG Qingfu4， REN Xiaomin5， YAN Weijie6， YAO Weiyuan4， HE Xinying4， HU Risheng2， HU Zhengrong2*

（1. College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;2. Hunan Tobacco Research Institute， Changsha410004， China;3. China Tobacco Hunan Industrial Co.， Ltd.， Changsha 410007， China;4. Ningxiang Branch of Changsha TobaccoCompany， Changsha 410600， China;5. Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205，China;6. Shimen County Branch of Changde Tobacco Company， Changde， Hunan 415300， China）

Abstract： To investigate the molecular regulatory mechanism of low temperature induced early flowering， a cold-sensitive tobacco cultivar Yunyan 87 was treated with cold stress of 12 ℃ for 14 days. The shoot apical tissues of plants were collected for flowering-regulatory gene expression analysis. The time of central flower opening and the total number of leaves were investigated. The results showed that central flower opening date of the cold-treated tobacco plants was 7 days earlier than that of the control， and total leaf number of the treated plants was 5 leaves less than that of the control. Besides， the expression levels of 10 flowering-regulatory genes were increased by cold stress when compared to the control， including NtMADS4， NtMADS11， NtAP1， NtSOC1， NtFUL， NtNFL1， NtFT1， NtFT3， NtFT4 and NtFT5; and then decreased to similar levels of the control after recovery under normal conditions for 7-14 days. These results suggested that cold-induced tobacco early flowering may be related to the up-regulation of these flowering regulatory genes.

Keywords： tobacco; low temperature stress; early flowering; MADS-box family; NtFTs; gene expression

煙草屬喜溫作物，連續(xù)低溫會(huì)導(dǎo)致其早花[1]，達(dá)不到應(yīng)有的株高、葉數(shù)和葉片大小[2]，嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)質(zhì)量[3]。探索低溫脅迫下煙草基因表達(dá)變化，闡明低溫早花的分子調(diào)控機(jī)理，對(duì)選育耐低溫抗早花煙草品種具有重要意義。

MADS-box 家族基因在生殖生長(zhǎng)調(diào)控中起到了非常重要的作用[4-5]。AGL2亞家族的 NtMADS4基因和 SQUA（squamosa）亞家族的 NtMADS11基因參與花分生組織和花器官的識(shí)別。過(guò)表達(dá)NtMADS4和 NtMADS11基因均會(huì)導(dǎo)致煙草提前開(kāi)花[6-8]。 SOC1 （suppressor of overexpression of constans 1）也屬于 MADS-box 基因家族，在擬南芥中過(guò)表達(dá)白菜 BrcSOC1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)間顯著早于野生型[9]。由 FT（flowering locus T）基因編碼的 FT 蛋白是成花素的主要成分[10]，Harig 等[11] 在煙草中鑒定到4個(gè)FT 基因NtFT1、NtFT2、NtFT3、NtFT4，發(fā)現(xiàn) NtFT1、NtFT2、NtFT3抑制煙草開(kāi)花，而 NtFT4則誘導(dǎo)開(kāi)花。高玉龍等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥 FT 基因在烤煙品種中的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致煙草早花。AP1（apetala1）和 FUL（fruitfull）在花分生組織轉(zhuǎn)換過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[13]，研究發(fā)現(xiàn)在煙草中過(guò)表達(dá)NtFUL和楊樹(shù) PsnAP1基因，均能導(dǎo)致煙草早花[14]。煙草 NtNFL1是擬南芥 LFY （leafy）的同源基因，NtNFL1與NtAP1都是分生組織特異性基因，并且 NtNFL1基因起著調(diào)控花器官形成和莖側(cè)端分生組織形成腋芽的作用[15]。目前關(guān)于低溫脅迫下煙草開(kāi)花調(diào)控基因表達(dá)模式的相關(guān)研究卻少有報(bào)道。

烤煙品種云煙87易受低溫誘導(dǎo)開(kāi)花[16]，本研究以云煙87為試驗(yàn)材料，利用qRT-PCR 技術(shù)對(duì) NtMADS4、NtMADS11、NtSOC1、NtFT1、NtFT3、 NtFT4、NtFT5、NtAP1、NtFUL、NtNFL1共10個(gè)煙草開(kāi)花調(diào)控基因在正常條件和低溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在探究煙草低溫早花調(diào)控機(jī)制，為培育耐低溫抗早花烤煙新品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及種植培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用的煙草品種為云煙87，由中國(guó)煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站提供。種植于湖南省煙草科學(xué)研究所人工氣候室。種子清洗后放入2 mL 離心管中，加入1.5 mL 無(wú)菌水，于4℃冰箱中處理2 d，以促進(jìn)種子發(fā)芽同步化。在容積為1 L 的底部有透水孔的方盒中裝入煙草育苗基質(zhì)，放置于水中，讓基質(zhì)充分吸收水分。種子在冰箱中處理完成后，均勻地撒播于基質(zhì)上。種子萌發(fā)并生長(zhǎng)至兩片子葉完全展開(kāi)時(shí)，選取健康幼苗定植于上述基質(zhì)盒中，在25℃、相對(duì)濕度65%、光照16 h/d 條件下培養(yǎng)至苗齡41 d （7葉），開(kāi)始處理。

1.2 試驗(yàn)處理

挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，分為2組。處理組：煙苗在人工氣候室中12℃低溫處理14 d，然后在常溫25℃條件下恢復(fù)14 d，期間相對(duì)濕度保持在65%、光照16 h/d。對(duì)照組：煙苗一直在正常條件下（25℃ ， 相對(duì)濕度65%、光照16 h/d）培養(yǎng)。處理組和對(duì)照組的煙苗每7 d 取一次樣用于基因表達(dá)分析。具體取樣方法：取煙苗莖頂端組織（包含頂端3片幼葉），迅速用錫紙包好并放入液氮速凍，立即于-80℃冰箱中保存。每3株混合作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。其他煙株（處理組和對(duì)照組均預(yù)留15株）用于開(kāi)花期和葉數(shù)的調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

1.3 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄

采用朱曉宇等[17]改進(jìn)的 CTAB 法提取 RNA 。 RNA 反轉(zhuǎn)錄參照iScript? gDNA Clear cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 qRT-PCR 相對(duì)定量

采用 ABI 公司生產(chǎn)的QuantStudio 6 Flex 熒光定量 PCR 儀，使用 Takara 公司生產(chǎn)的 SYBR Premix EX Taq 對(duì)各基因的表達(dá)量進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)，以NtActin為內(nèi)參基因。 qPCR 所用引物信息見(jiàn)表1。

qRT-PCR 反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 10?L、上下游引物（10?mol/L）各0.5?L、cDNA 0.5?L，ddH2O 補(bǔ)足至20?L。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s、60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線采集階段95℃15 s ，60℃60 s ，95℃15 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

用 SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)多重比較及差異顯著性檢測(cè)，p＜0.05，用 Excel 2016作圖。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫后開(kāi)花期及葉數(shù)

由圖1可見(jiàn)，云煙87在經(jīng)過(guò)14 d 的低溫處理后，平均提前7 d 開(kāi)花，顯著早于對(duì)照。同時(shí)，低溫處理的葉片平均減少5片，顯著少于對(duì)照。表明，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致敏感煙草品種提前開(kāi)花，葉數(shù)減少。

2.2 低溫脅迫后開(kāi)花調(diào)控基因表達(dá)分析

以常溫為對(duì)照，對(duì)煙株低溫（12℃）處理7 d、14 d 和常溫（25℃）恢復(fù)后7 d、14 d 進(jìn)行表達(dá)量測(cè)定。結(jié)果顯示（圖2），對(duì)照組 NtMADS4的表達(dá)量前期一直處于較低水平，后期明顯升高。與對(duì)照組相比，NtMADS4受低溫脅迫顯著上調(diào)表達(dá)，恢復(fù)7 d 時(shí)表達(dá)量有所下降但仍高于對(duì)照，恢復(fù)14 d 后其表達(dá)水平明顯低于對(duì)照。NtMADS11在低溫處理時(shí)表達(dá)量上調(diào)并于14 d 時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照組的4.5倍，常溫恢復(fù)后表達(dá)量明顯下降，在恢復(fù)14 d 時(shí)其表達(dá)水平顯著低于對(duì)照。此外， NtSOC1在低溫處理后上調(diào)表達(dá)，在處理14 d 時(shí)達(dá)到峰值，其表達(dá)量是對(duì)照組的4.7倍，常溫恢復(fù)后 NtSOC1表達(dá)量下降，與對(duì)照的差值逐漸減小。綜合來(lái)看，在低溫處理下 NtMADS4、NtMADS11和 NtSOC1的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，而常溫恢復(fù)后其表達(dá)量便明顯降低。表明，正常條件下 NtMADS4、NtMADS11和 NtSOC1在苗期維持在較低水平，但低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

如圖3所示，對(duì)照組的 NtFT1、NtFT3、NtFT5在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均處于較低水平， NtFT4在7 d 時(shí)的表達(dá)量較高，隨后也降至較低水平。但與對(duì)照組相比，低溫處理組 NtFT1、NtFT3、NtFT4和 NtFT5表達(dá)量明顯升高，其中 NtFT1、NtFT4和 NtFT5在低溫處理7 d 時(shí)達(dá)到峰值， NtFT3在處理14 d 時(shí)達(dá)到峰值。在正常條件下恢復(fù)后，這4個(gè)NtFT基因的表達(dá)量明顯下降至與對(duì)照組相近的水平。以上結(jié)果表明，正常條件下4個(gè) FT 基因的表達(dá)量維持在較低水平，但低溫脅迫會(huì)特異性激活其表達(dá)。

如圖4所示，與對(duì)照組相比，低溫處理后 NtAP1、NtFUL和 NtNFL1表達(dá)量均升高， NtAP1、NtFUL在處理14 d 時(shí)達(dá)到峰值，NtNFL1在處理7 d 達(dá)到峰值。3個(gè)基因表達(dá)量在常溫恢復(fù)后下降至與對(duì)照組相近水平。該結(jié)果表明，低溫脅迫會(huì)激活 NtAP1、NtFUL和 NtFL1基因表達(dá)，在常溫恢復(fù)后其表達(dá)量會(huì)恢復(fù)至正常水平。 AP1、FUL 同屬于 MADS-box 基因家族中的 AP1/FUL 亞家族，處于開(kāi)花調(diào)控途徑的下游，起著整合開(kāi)花信息的作用。

3 討論

植物根據(jù)內(nèi)源和環(huán)境信號(hào)調(diào)整花期轉(zhuǎn)換[18]，一些 MADS-box 基因的過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)其他內(nèi)源開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)煙草提前開(kāi)花[19]。前人研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) PsnAP1 的煙株中 NtMADS4 和 NtMADS11的表達(dá)量均比野生型高出10倍[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NtMADS4和 NtMADS11基因均受低溫脅迫上調(diào)表達(dá)，其中 NtMADS11在低溫處理14 d 時(shí)的表達(dá)量上調(diào)了14倍。因此，推測(cè) NtMADAS4和 NtMADS11可能參與了低溫誘導(dǎo)煙草早花調(diào)控過(guò)程，但其具體的作用機(jī)理還需進(jìn)一步探究。SOC1作為開(kāi)花調(diào)控整合因子，既受 FLC（flowering locus C）調(diào)控參與春化成花途徑，亦受 FT 和 FD 蛋白結(jié)合的復(fù)合體調(diào)控參與光周期成花途徑[20]。本研究發(fā)現(xiàn) NtSOC1基因表達(dá)量在低溫處理后上調(diào)，處理14 d 時(shí)達(dá)到峰值，但常溫恢復(fù)后其表達(dá)量又迅速降低，這充分說(shuō)明 NtSOC1的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)。

FT 基因受 CO 信號(hào)和 FLC 調(diào)控，進(jìn)而激活 SOC1和 AP1的表達(dá)誘導(dǎo)植物開(kāi)花，在光周期途徑和春化途徑促進(jìn)開(kāi)花過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[21]。前人研究表明，NtFT1、NtFT2和 NtFT3是開(kāi)花抑制子，僅有 NtFT4為開(kāi)花誘導(dǎo)子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，NtFT1、NtFT3、NtFT4的表達(dá)量迅速上調(diào)，且NtFT1、NtFT3和NtFT5的表達(dá)量明顯高于NtFT4，但 FT 下游的 SOC1卻上調(diào)表達(dá)，且植株開(kāi)花明顯提前。NtFT1、NtFT3和 NtFT4通過(guò)競(jìng)爭(zhēng) FD 蛋白來(lái)共同調(diào)控下游基因[11]，研究發(fā)現(xiàn)， FD 蛋白會(huì)更傾向于與開(kāi)花誘導(dǎo)子NtFT4結(jié)合來(lái)激活下游基因的表達(dá)，進(jìn)而使 NtFT4在蛋白質(zhì)水平上比其他抑制子更具有競(jìng)爭(zhēng)力[22]。本試驗(yàn)中低溫處理階段 NtFT4的表達(dá)量在7 d 時(shí)達(dá)到峰值后呈下降趨勢(shì)，而 NtSOC1 則是逐步上調(diào)表達(dá)，在14 d 達(dá)到峰值，推測(cè) NtFT4 迅速響應(yīng)低溫并先于 NtSOC1上調(diào)表達(dá)。 NtFT5也是開(kāi)花誘導(dǎo)基因，它的表達(dá)幾乎不受光周期的影響，在開(kāi)花過(guò)程中起著比 NtFT4更重要的作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，NtFT5在低溫處理時(shí)有較高的表達(dá)量，常溫恢復(fù)后表達(dá)量下降至對(duì)照水平，說(shuō)明 NtFT5同樣受低溫誘導(dǎo)，與 NtFT4共同激活下游基因表達(dá)，促進(jìn)植物成花。

AP1處于各種成花途徑調(diào)控的下游，并在誘導(dǎo)開(kāi)花的調(diào)控中起到核心作用。AP1可以被 FT-FD 和 LFY 激活表達(dá)，從而促進(jìn)成花[23]。FUL 基因編碼一個(gè)含有 MADS 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)促進(jìn)花分生組織識(shí)別和花期轉(zhuǎn)換[24]。NtFUL基因受 FT-FD 復(fù)合體的誘導(dǎo)表達(dá)參與成花，且其表達(dá)量會(huì)隨著煙株的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸升高，并在成花階段維持較高表達(dá)量[14，25]，在本試驗(yàn)中， NtAP1、NtFUL基因均受低溫脅迫上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)水平顯著高于對(duì)照；正常溫度恢復(fù)后，其表達(dá)量與對(duì)照之間的差值縮小且保持上升趨勢(shì)，推測(cè)低溫會(huì)誘導(dǎo) NtAP1和NtFUL的表達(dá)，并且其表達(dá)量隨著煙株生長(zhǎng)發(fā)育而逐步上調(diào)，在進(jìn)入花器官的識(shí)別和建成階段時(shí)達(dá)到最高水平，從而促進(jìn)植物開(kāi)花。 NtNFL1同樣受低溫誘導(dǎo)而高量表達(dá)，并在正常溫度恢復(fù)后表達(dá)量降低至對(duì)照水平，其變化趨勢(shì)與 NtFT4和 NtFT5相似，不同于 NtSOC1、NtAP1和NtFUL。NtNFL1的表達(dá)受 FT-FD 復(fù)合物和NtSOC1的調(diào)控，相比于NtAP1和NtFUL， NtNFL1可能更易被NtFTs基因激活。

4 結(jié)論

本研究驗(yàn)證了低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)敏感煙草品種提前開(kāi)花導(dǎo)致葉數(shù)減少，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)開(kāi)花調(diào)控基因 NtMADS4，NtMADS11，NtSOC1，NtFT1， NtFT3，NtFT4，NtFT5，NtAP1，NtFUL，NtNFL1的表達(dá)。低溫誘導(dǎo)煙草早花具體的調(diào)控機(jī)制還需要通過(guò)基因敲除或過(guò)表達(dá)等方式來(lái)進(jìn)一步探究。

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