索文龍　王國平　牛永志　李元君　許杰　喬雨　鄭昀曄

摘要：為探究煙草種子萌發(fā)過程對低溫脅迫的響應，對萌發(fā)1 d 、2 d 和3 d 的種子分別進行2 d 低溫處理（LT1、LT2和 LT3），分析不同萌發(fā)時期種子遇到低溫的蛋白與多肽變化，分別以萌發(fā)2 d、3 d 和4 d 的種子為對照（GS2、GS3和 GS4），形成3個組合 GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3。結果顯示， GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3的差異多肽集合的交集共計20個多肽， GO 和 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)3個組合的差異蛋白均與碳代謝、氨基酸生物合成相關；此外鑒定到8個參與到低溫應答的多肽，其中 Nitab4.5_0002257g0090多肽在3個組合中同時被鑒定到，可能在低溫應答過程中存在重要的功能。本研究為后續(xù)挖掘多肽在低溫應答過程的功能提供了研究基礎。

關鍵詞：煙草種子；低溫；蛋白；多肽

中圖分類號： S572.01???????? 文獻標識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0031-08

Study on Differentially Expressed Proteins and Polypeptides in Response to Low Temperature Stress during Tobacco Seed Germination

SUO Wenlong， WANG Guoping， NIU Yongzhi， LI Yuanjun， XU Jie， QIAO Yu， ZHENG Yunye*

（Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ltd， Yuxi， Yunnan 653100， China）

Abstract： To investigate the response of tobacco seed germination process to low temperature stress， the seeds germinated for 1， 2 and 3 days were treated with low temperature for 2 days （samples were named LT1， LT2 and LT3 respectively）， and the changes of proteins and polypeptides in seeds exposed to low temperature at different stages of germination were analyzed. The seeds germinated for 2， 3 and 4 days were used as control （samples were named GS2， GS3 and GS4 respectively）， forming three combinations of treatment GS2 vs LT1， GS3 vs LT2 and GS4 vs LT3. The results showed that the intersection of differentially expressed protein of GS2 vs. LT1， GS3 vs. LT2 and GS4 vs. LT3 had a total of 20 polypeptides. The results of GO and KEGG enrichment analysis indicated that the differential polypeptides of the three combinations were related to carbon metabolism and amino acid biosynthesis. In addition， eight peptides were identified to be involved in low temperature response， and the peptide Nitab4.5_0002257g0090 was identified in three combinations at the same time， suggesting that it may have an important function in low temperature response. This study revealed the responsiveness of tobacco seeds to low temperature signaling pathways， and provided a data basis for the subsequent mining of peptides in the low temperature response process.

Keywords： tobacco seeds; low temperature; protein; peptipide

煙草（Nicotiana tabacum）是一種特殊的經(jīng)濟作物，對我國的國民經(jīng)濟起到重要作用。目前，我國大部分煙葉產(chǎn)區(qū)在育苗過程中經(jīng)常遇到低溫，對煙草種子正常萌發(fā)造成不利影響，從而影響育苗進程和育苗質量。研究煙草種子萌發(fā)期間對低溫應答相關機制對調控種子萌發(fā)具有重要意義。

蛋白質差異表達是生物體自身基因表達模式在多變的環(huán)境條件下的綜合體現(xiàn)，有助于人們更全面地了解低溫脅迫的傷害機制和植物的適應機理[1]。目前關于植物低溫脅迫的蛋白質應答研究較多，在番茄、馬鈴薯、小麥、玉米等有相關報道[2-5]，關于種子萌發(fā)過程中蛋白質的變化在大豆、燕麥、水稻、小麥、玉米等[1，6-9]也有相關研究報道。煙草種子蛋白質的研究主要集中在種子成熟過程[10]以及不同類型煙草種子蛋白比較[11]，而關于低溫脅迫對煙草種子萌發(fā)過程中蛋白質的影響尚未見報道。

植物多肽分子是植物細胞信號轉導的重要媒介，具有廣泛的生物學功能，近年來隨著檢測技術的進步，多肽分子鑒定與功能分析技術逐步成熟，多肽分子鑒定與功能研究成為熱點，研究發(fā)現(xiàn)多肽分子廣泛參與植物細胞的增殖、花粉調控、氣孔調控、根系發(fā)育、抵御病蟲害等生長發(fā)育和環(huán)境適應性調控過程[12-16]，而參與煙草種子萌發(fā)過程低溫響應的多肽分子尚未見研究報道。

本研究通過分析低溫脅迫下煙草種子萌發(fā)過程中差異蛋白和多肽，以期篩選潛在的煙草種子萌發(fā)過程響應低溫的多肽分子，為后續(xù)研究相關多肽在低溫響應中的功能及多肽產(chǎn)品開發(fā)提供基礎，為解決低溫天氣對煙草種子萌發(fā)影響提供有效方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為煙草品種 K326，由玉溪中煙種子有限責任公司提供。

將煙草種子均勻播撒到墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，放置于人工氣候箱內(nèi)進行萌發(fā)。本研究對25℃萌發(fā)1、2和3 d 的種子分別再進行8℃、2 d 的低溫處理，樣品命名為 LT1、LT2和 LT3；對照按照生長狀態(tài)一致的標準進行取樣，分別為25℃下萌發(fā)2、3和4 d 的樣品，命名為 GS2、GS3和 GS4。最后形成3個組合 GS2 vs LT1、GS3 vs LT2和 GS4 vs LT3。將萌發(fā)不同天數(shù)的種子樣品保存于?80℃冰箱備用。每個樣品3個重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗氧化酶活性測定稱取0.05 g 樣品，利用試劑盒（分光光度法，北京索萊寶科技有限公司）測定不同樣品種子的過氧化氫酶（CAT）活性。

1.2.2 蛋白質提取與制備向樣品中加入裂解液[1%十二烷基硫酸鈉，8 mol/L 尿素，1×蛋白酶抑制劑混合物（Roche Ltd. Basel， Switzerland）]，振蕩研磨3×400 s ，冰上裂解30 min。高速離心15 min （15000 r/min，4℃）后取上清。采用10 K 超濾管（Millipore， Billerica）于4℃下8000 g 離心30 min 去除高分子量的蛋白。收集流穿液，流穿液用離心濃縮儀濃縮抽干，用100 mmol/L 三乙胺-碳酸緩沖液復溶。采用 C18除鹽柱除鹽后，肽段洗脫液真空抽干，?80℃保存。

1.2.3 多肽檢測將?80 ℃凍存的樣品用 LC-MS/MS 進行分析。 LC-MS/MS 為串聯(lián) EASY-nanoLC 1000的 Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀（Thermo Fisher Scientific， MA， USA），配備在線納噴離子源。上樣量5μL，分析柱 Acclaim PepMap C18，75μm×25 cm，柱流量400 nL/min，柱溫55℃ ， 電噴霧電壓2 kV，色譜梯度如下：流動相 A 相，0.1%甲酸水溶液； B 相，含0.1%甲酸的 ACN 溶液；以120 min 的梯度分離樣品，柱流量控制在400 nL/min，柱溫為55℃ ， 梯度從4%的B 相起始，在110 min 以非線性梯度升高到60%，8 min 內(nèi)升高到100%，維持8 min。

質譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在 MS 和 MS/MS 采集間切換。質譜參數(shù)設置如下：

（1）MS：掃描范圍（m/z）=200～1500，分辨率=120000，AGC target=4e5，最大注入時間=50 ms，掃描電荷=1～7。（2）HCD-MS/MS（top 10）：分辨率=15000，隔離窗口 m/z=3，AGC target=5e4，最大注入時間=35 ms，碰撞能量=35，動態(tài)排除時間=30 s。

1.2.4 多肽組樣本搜庫完成質譜分析后，串聯(lián)質譜的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過 PEAKS Studio version X+（Bioinformatics Solutions Inc.， Waterloo， Canada） 分析。PEAKS DB 對煙草基因組數(shù)據(jù)來源的烤煙數(shù)據(jù)庫搜庫。設置非酶切，搜庫參數(shù)碎片離子質量容許誤差為0.02 Da，母離子質量容許誤差為7×10-6 Da，可變修飾： Oxidation （M）15.99，Acetylation （Protein N-term）42.01。肽段經(jīng)過1% FDR 質控過濾。

通過1% FDR 質控過濾的肽段的非標計定量通過 PEAKS Studio version X+完成。首先，軟件分別識別各樣本中肽段母離子的峰面積即肽段的相對豐度，然后采用高性能的保留時間對齊算法對來源于不同樣本的相同肽段進行對齊。采用樣本的總離子流（TIC）進一步對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，樣本中各肽段的豐度由原始豐度除以歸一化系數(shù)獲得。

1.2.5 多肽數(shù)據(jù)初步分析獲得的多肽原始數(shù)據(jù)使用 PEAKS 鑒定，鑒定的最小肽段長度為7，在譜圖水平接近1% FDR 時曲線平滑上升，且鑒定的肽譜匹配數(shù)值合理，表明該次鑒定結果可信且數(shù)量理想。

使用 PEAKS 提取肽段峰強度、峰面積、液相色譜保留時間等信息用以計算多肽定量值，定量使用 PEAKS 默認參數(shù)。接著使用總和歸一化方法對不同重復間蛋白的定量值進行歸一化處理。

1.2.6 GO 和 KEGG 富集分析 GO 富集分析以及 KEGG 注釋使用以下 R 包：clusterProfiler[14]（用于富集分析）、topGO（用于繪制 GO 富集圖片）、

AnnotationHub[15]（用于下載數(shù)據(jù)庫）、BioFileCache（依賴包）、dbplyr（依賴包）、pathview（用于分析 KEGG pathway）。采用的煙草數(shù)據(jù)庫為烤煙 v1.0 Edwards 2017 BLAST （ https：//solgenomics.net/ organism/Nicotiana_tabacum/genome），分析過程所使用的數(shù)據(jù)庫編號為 AH93857。信號肽預測分析采用 signal IP4.1（ https：//services.healthtech.dtu.dk/ service.php？SignalP-4.1）。

2 結果

2.1 低溫脅迫后的 CAT 活性

按照生長狀態(tài)一致的標準進行取樣，對不同樣品的抗氧化酶活性進行分析[17]。從圖1可知，由于低溫脅迫時間較長，對種子萌發(fā)速度影響較大，處理 LT1與對照 GS2相比（GS2 vs LT1），經(jīng)過低溫8℃處理后，LT1的過氧化氫酶活性顯著高于 GS2，處理 LT1過氧化氫酶活性為21295.62 U/g，GS2處理為10733.12 U/g；同樣，處理 LT2、LT3的過氧化氫酶活性也顯著高于對照 GS3、GS4。說明處理和對照樣品存在表型差異，可用于后續(xù)分析。

2.2 低溫脅迫后的差異多肽分析

為了分析種子萌發(fā)過程低溫脅迫處理后的差異多肽，采用10 kDa超濾管除去高分子蛋白，并將低分子蛋白進行質譜鑒定。鑒定的差異多肽數(shù)量如圖2A 所示，GS2 vs. LT1鑒定到243個上調表達，529個下調表達； GS3 vs. LT2鑒定到685個上調表達，221個下調表達； GS4 vs. LT3鑒定到183個上調表達，320個下調表達。3個組合差異多肽集合的交集共計20個，其中 GS2 vs. LT1與 GS3 vs. LT2組差異多肽共計189個，GS2 vs. LT1與 GS4 vs. LT3組差異多肽共計91個， GS3 vs. LT2與 GS4 vs. LT3組差異多肽共計85個（圖2B）；各組差異多肽火山圖和聚類分析圖見圖3。

2.3 差異多肽所屬蛋白的 GO 和 KEGG 富集分析

GS2 vs. LT1差異多肽所屬蛋白GO 富集分析表明：在細胞組分方面主要富集在核、蛋白核酸復合物和核小體等（圖4A）；在分子功能方面主要富集在順式還原酮加雙氧酶、氧化還原酶活性、加雙氧酶活性和過氧化物酶活性、抗氧化劑活性等（圖4B）；在生物過程方面主要富集在單細胞到多細胞生物過程、多細胞生物發(fā)育及多細胞生物過程、系統(tǒng)發(fā)育、生殖發(fā)育、種子發(fā)育和對刺激的響應等（圖4C）。 KEGG 主要富集到次生代謝物生物合成、代謝途徑、碳代謝、氨基酸生物合成等過程（圖4D）。

GS3 vs. LT2差異多肽所屬蛋白的GO 富集分析表明，在細胞組分方面主要富集在高爾基體、內(nèi)膜系統(tǒng)、胞外區(qū)等（圖5A）；在分子功能方面主要富集在異構酶活性、抗氧化劑活性、翻譯延伸因子活性、順反異構酶活性等（圖5B）；在生物過程方面主要富集在生殖結構和系統(tǒng)發(fā)育、參與生殖的發(fā)育過程、己糖代謝過程、胚發(fā)育等（圖5C）； KEGG 主要富集到次生代謝物生物合成、核糖體、碳代謝、光合生物中的碳固定、氨基酸生物合成過程（圖5D）。

GS4 vs. LT3差異多肽所屬蛋白的GO 富集分析表明：在細胞組分方面主要富集在線粒體內(nèi)膜、細胞器內(nèi)膜、細胞器被膜、線粒體被膜、線粒體膜、線粒體等（圖6A）；在分子功能方面主要富集在小分子結合、氧化還原酶活性、輔酶Ⅰ活性等（圖6B）；在生物過程方面主要富集在 ATP 代謝過程、核苷三磷酸代謝過程、嘌呤核苷三磷酸代謝過程等（圖6C）。 KEGG 主要富集到代謝途徑、碳代謝、氨基酸生物合成等過程（圖6D）。

綜合 GS2 vs. LT1、GS3 vs. LT2和 GS4 vs. LT3的 GO 和 KEGG 富集結果，發(fā)現(xiàn)3個組合的差異多肽所屬蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成等，同樣也發(fā)現(xiàn)不同萌發(fā)時間所富集的蛋白參與的信號途徑具有一定的差異性。

2.4 低溫脅迫后的目標多肽鑒定

為挖掘煙草種子萌發(fā)過程中對低溫應答起關鍵功能的多肽分子，對所匹配的蛋白進行篩選，選擇的蛋白條件為：前體蛋白大小不超過250個氨基酸，具有 N 端信號肽。篩選結果顯示，GS2 vs. LT1中聯(lián)合鑒定到4 個多肽分子： Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0000477g0210、 Nitab4.5_0011894g0010和 Nitab4.5_0002172g0040； GS3 vs. LT2 中聯(lián)合鑒定到4 個多肽分子Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0003998g0060、 Nitab4.5_0000077g0160和 Nitab4.5_0003931g0030； GS4 vs. LT3種子中聯(lián)合鑒定到3個多肽分子 Nitab4.5_0002257g0090、Nitab4.5_0011894g0010和 Nitab4.5_0002046g0190（表1）。其中有1個多肽分子 Nitab4.5_0002257g0090在3個組合中同時被鑒定到，有1個多肽分子 Nitab4.5_0011894g0010在 GS2 vs. LT1和 GS4 vs. LT3都被鑒定到。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長的基礎。種子萌發(fā)時蛋白質的變化反映了植物基因組第一次被激活基因的表達情況[18]。蛋白質差異表達是復雜的生命活動中生物體繁復的基因表達模式及多變的環(huán)境條件的綜合體現(xiàn)，因此，從蛋白質入手有助于更全面地了解低溫脅迫的傷害機制和植物的適應機理。本研究對受到低溫脅迫的 K326煙草種子萌發(fā)期間的蛋白和多肽的變化進行了系統(tǒng)的分析。在 GO 和 KEGG 分析中發(fā)現(xiàn)3個組合的差異蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成。

本研究使用10 kDa超濾管去除較大的蛋白質，并進一步通過信號肽和序列長度篩選多肽分子，總共鑒定到8個多肽分子，其中多肽 Nitab4.5_ 0000477g0210（KTI5）參與防御反應[19]，Nitab4.5_ 0011894g0010（AGP30）參與根系發(fā)育調控、種子休眠過程的調控[20]，Nitab4.5_0000077g0160（RNS2）參與 rRNA 分解代謝、RNA 分解代謝過程和自噬的負調節(jié)[21-22]，Nitab4.5_0003931g0030（ CYP20-1）參與根發(fā)育[23]，Nitab4.5_0002046g0190（ACP1）參與蛋白質去磷酸化，這些過程均與植物對低溫逆境響應有關；類似驅動蛋白（KP1）、電壓依賴陰離子通道蛋白3（VDAC3）、冷休克蛋白（CSP1和 CSP2）也參與植物對低溫逆境響應[24-25]。多肽 Nitab4.5_0002257g0090在3個組合中同時被鑒定到，暗示該多肽可能在 K326種子對低溫脅迫的響應過程中扮演重要角色。本研究鑒定到的3個多肽分子尚未被研究報道，為后續(xù)研究相關多肽在煙草種子對低溫應答中的功能提供了基礎。

本研究僅從蛋白和多肽層面分析了一個品種的煙草種子萌發(fā)期間受到低溫脅迫后的蛋白質的變化，有待對多個品種的種子從轉錄組、蛋白組、代謝組多個層面系統(tǒng)分析其萌發(fā)期間受到低溫脅迫后的變化，系統(tǒng)解析煙草種子萌發(fā)期間受到低溫脅迫后應答機制。同時，煙草幼苗受到低溫脅迫后，幼苗葉形、抗氧化酶活性及相關基因表達亦將發(fā)生變化[26-29]，有待從多個層面系統(tǒng)開展種子到幼苗對低溫響應研究，不斷完善低溫脅迫后應答機制，為后續(xù)開發(fā)提升種子和幼苗活力的增效劑提供科學依據(jù)。

4 結論

本研究篩選到煙草種子萌發(fā)過程響應低溫脅迫相關蛋白與多肽。從分子功能層面，GO 富集發(fā)現(xiàn)3個組合的差異蛋白均參與碳代謝、氨基酸生物合成； KEGG 富集發(fā)現(xiàn)3個組合的差異蛋白與碳代謝、氨基酸生物合成相關。鑒定到8個參與低溫響應的多肽，其中多肽 Nitab4.5_0002257g0090在3個組合中同時被鑒定到，暗示其可能在低溫響應過程中存在重要功能。

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