王永達(dá)　宋時洋　蔣彩虹　潘旭浩　耿銳梅　任民　劉旦　蒲文宣　劉萬峰　王東　毛輝　余祥文　昝艷君　程立銳　楊愛國

摘要：為構(gòu)建煙草全基因組模塊庫，開展煙草分子模塊育種，以 K326為輪回親本，烤煙 OX2028和香料煙 Samsun 為供體親本，經(jīng)過雜交、連續(xù)多代回交、自交，最終獲得兩套以 K326為背景，覆蓋供體親本整個基因組的分子模塊庫。分子模塊的基因組大部分回復(fù)到了輪回親本 K326，其田間農(nóng)藝及抗病性等重要性狀偏向親本 K326，不同材料間存在較廣泛的遺傳變異；群體的基本農(nóng)藝性狀呈現(xiàn)連續(xù)的正態(tài)或近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的表型分布特性；鑒定了7個重要性狀顯著改變的分子模塊，其中較 K326中上部葉片開片明顯改善的材料32份，葉數(shù)明顯提高的材料25份， TMV 、CMV 、PVY 病毒病抗性明顯提高的材料分別為111、25和5份，黑脛病、青枯病抗性顯著提高的材料44和52份。構(gòu)建的煙草分子模塊庫可用于后續(xù)開展煙草重要性狀的 QTL 定位和基因功能研究。

關(guān)鍵詞：煙草；分子模塊；設(shè)計育種；數(shù)量性狀

中圖分類號： S572.03???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0001-09

Construction of the K326 Whole Genome Molecular Module Library and Evaluation of Its Agronomic and Disease Resistance Traits

WANG Yongda1， SONG Shiyang1， JIANG Caihong1， PAN Xuhao1， GENG Ruimei1， REN Min1， LIU Dan1， PUWenxuan2， LIU Wanfeng2， WANG Dong2， MAO Hui3， YU Xiangwen4， ZANYanjun1， CHENG Lirui1*， YANGAiguo1*

（1. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences; Qingdao 266101， China;2. China Tobacco HunanIndustry Company， Changsha 410014， China;3. Xiangxi Autonimous Prefecture Tobacco Company of Hunan Province， LongshanCounty Autonimous Prefecture， Longshan， Hunan 416800， China;4. Sichuan Branch of China National Tobacco Corporation，Chengdu 610000， China）

Abstract： To construct a tobacco whole-genome module library and carry out tobacco molecular module breeding， in this study we used K326 as the recurrent parent and flue-cured tobacco OX2028 and aromatic tobacco Samsun as donor parents. After hybridization， continuous multi-generation backcrossing， and selfing， two sets of molecular module libraries covering the entire genome of the donor parents were obtained with K326 as the background. The genome of the molecular module mostly returned to the recurrent parent K326， and field agronomic and disease resistance traits were biased towards the parent K326. However， there was still a wide range of genetic variation. Among them， the coefficient of variation for waist leaf length was the smallest for two consecutive years， and the coefficient of variation for internode length was the largest for two consecutive years. The basic agronomic traits of the population showed a continuous normal or near-normal distribution， which is consistent with the phenotypic distribution characteristics of quantitative traits. Seven molecular modules with significant changes in important traits were identified. Compared to K326， 32 materials with significantly improved upper leaf opening， 25 materials with significantly increased leaf number， 111， 25， and 5 materials with significantly increased resistance to TMV， CMV， and PVY virus diseases， and 44 and 52 materials with significantly increased resistance to black shank and bacterial wilt diseases were identified. The tobacco molecular module library constructed in this study can be used for subsequent QTL mapping and gene function research on important tobacco traits.

Keywords： tobacco; molecular module; design breeding; quantitative traits

煙草是一種重要經(jīng)濟(jì)作物，培育優(yōu)質(zhì)、多抗、低害、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種一直是煙草育種的目標(biāo)。由于煙草農(nóng)藝性狀和病害抗性等重要性狀大多屬于由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，易受環(huán)境、遺傳背景等因素的影響，利用常規(guī)育種策略改良這些復(fù)雜性狀的效率很低[1]，無法解決復(fù)雜農(nóng)藝性狀的遺傳改良問題[2]。

染色體片段導(dǎo)入系由于遺傳背景一致，能夠在多個環(huán)境下對性狀進(jìn)行評價以獲取更全面和準(zhǔn)確的性狀表現(xiàn)信息，已在多種作物的遺傳研究和品種培育中得到廣泛應(yīng)用。通過將供體親本的染色體片段導(dǎo)入到輪回親本中，形成具有單個或多個染色體替代片段的染色體片段導(dǎo)入系材料[3]，其遺傳背景清楚，可有效檢測微效基因及隱蔽基因，打破優(yōu)良基因與不良基因的連鎖，準(zhǔn)確評價供體染色體片段的遺傳效應(yīng)，將復(fù)雜性狀分解為單個孟德爾因子，進(jìn)行精細(xì)定位和克隆[4]。基于導(dǎo)入系的優(yōu)點(diǎn)，分子模塊設(shè)計育種的理念首先在水稻中產(chǎn)生，被用于解析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)和培育新品種[5-7]。目前，利用分子模塊設(shè)計技術(shù)對水稻[8-9]、玉米[2]等進(jìn)行農(nóng)藝性狀遺傳基礎(chǔ)解析和育種已經(jīng)取得初步成效，高產(chǎn)[10]、抗病[11]、氮高效[12]等復(fù)雜性狀的分子模塊解析，證明了該育種方法的可行性[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于煙草導(dǎo)入系群體的研究還比較缺乏，只有一個以烤煙種質(zhì) Y3為輪回親本，雪茄煙種質(zhì)Beinhart 1000-1及烤煙品種 K326為供體親本的群體被創(chuàng)建[14]。

因此，本研究以優(yōu)質(zhì)主栽烤煙品種 K326為輪回親本，以優(yōu)質(zhì)多抗烤煙品種 OX2028和香料煙品種 Samsun 為供體親本，利用兩種不同類型煙草基因資源，將控制復(fù)雜性狀的多基因系統(tǒng)創(chuàng)制為可操控的染色體片段導(dǎo)入系遺傳材料，構(gòu)建以 K326為輪回親本的煙草全基因組分子模塊庫。通過多年多點(diǎn)表型鑒定，初步篩選出了多個目標(biāo)性狀顯著改變的分子模塊材料，以期為重要性狀的遺傳機(jī)制解析、基因挖掘和聚合育種提供材料基礎(chǔ)，并為推動煙草育種從傳統(tǒng)育種向分子設(shè)計育種轉(zhuǎn)變做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以 K326為輪回親本，以 OX2028和 Samsun 為供體親本，構(gòu)建以 K326為輪回親本的兩個煙草分子模塊庫。其中 K326為美國引進(jìn)烤煙品種，是目前我國主栽品種，OX2028為美國引進(jìn)烤煙品種，免疫普通花葉病毒，綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良；Samsun 為日本香料煙品種，在農(nóng)藝性狀、品質(zhì)等重要性狀與烤煙品種存在顯著差異。3個親本的基本農(nóng)藝性狀如表1所示，親本材料均由國家煙草種質(zhì)資源中期庫（青島）提供。

1.2 群體構(gòu)建

2014年5—9月，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地利用 K326與 Samsun 和 OX2028分別雜交獲得了 F1代種子；2015年5—9月，利用 K326為輪回親本，與 F1材料進(jìn)行了回交，獲得了兩個組合的 BC1F1代種子；2016年5—9月，種植兩個組合的 BC1F1材料，隨機(jī)選擇兩個組合的100個 BC1F1單株，分別與輪回親本 K326雜交，收獲 BC2F1代種子。

2017年5月，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地種植輪回親本 K326及其兩個組合的 BC2F1材料，利用飛行質(zhì)譜對不同組合的 BC2F1材料進(jìn)行遺傳背景選擇和導(dǎo)入片段的前景選擇[15]，獲得遺傳背景盡可能回復(fù)到輪回親本 K326且導(dǎo)入片段覆蓋整個輪回親本基因組的后代；7月份，入選的 BC2F1單株繼續(xù)與輪回親本 K326回交，獲得 BC3F1代種子。

2017年11月，在云南西雙版納加代種植輪回親本 K326及兩個組合的 BC3F1代材料，利用分子標(biāo)記重復(fù)開展前景和背景選擇，選擇背景回復(fù)率高、導(dǎo)入片段長度短，并覆蓋煙草供體親本整個基因組的后代材料，確定為BC3F1單株群體；2018年1月，入選的單株繼續(xù)與輪回親本 K326雜交，收獲 BC4F1代種子。

2018年5月，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地種植 BC4F1材料，利用分子標(biāo)記繼續(xù)對群體材料進(jìn)行前景和背景選擇，選擇背景回復(fù)率高、導(dǎo)入片段長度短，并覆蓋輪回親本 K326整個基因組的分子模塊材料，自交收獲 BC4F2代種子。

2018年10月，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所西南試驗(yàn)基地溫室條件下種植 BC4F2代，繼續(xù)進(jìn)行分子標(biāo)記前景選擇和背景選擇，篩選獲得目標(biāo)區(qū)段純合的個體，最終構(gòu)建以K326為輪回親本，OX2028和 Samsun 兩個不同類型煙草品種為供體親本的煙草全基因組分子模塊庫，其中 K326×OX2028組合的分子模塊群體包括2565份材料，K326×Samsun 組合的分子模塊群體包括1195份材料，構(gòu)建過程見圖1。

1.3 表型數(shù)據(jù)調(diào)查

2019年5月至9月將3760份 BC4F2世代分子模塊材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地、西昌試驗(yàn)基地和湖南湘西；調(diào)查兩個群體3760份模塊材料田間農(nóng)藝性狀，并根據(jù)分子標(biāo)記優(yōu)化模塊材料的片段導(dǎo)入情況，在青島選擇片段覆蓋整個煙草基因組且純合的785份材料并留種；2020年5月至9月將785份 BC4F3世代分子模塊材料分別種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所西昌試驗(yàn)基地和湖南湘西。田間試驗(yàn)每個株系種植30株，株距50 cm，行距120 cm，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行栽培管理。每個株系隨機(jī)調(diào)查5個單株，取平均值。其中 K326×OX028組合記為 OX2028模塊群體，K326×Samsun 組合記為 Samsun 模塊群體。

大田農(nóng)藝性狀表型調(diào)查：2019、2020年農(nóng)藝性狀測定按照 YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》要求進(jìn)行，在煙株打頂前調(diào)查各株系的株高、莖圍、最大葉片長、最大葉片寬、葉片數(shù)、節(jié)距共計6個主要農(nóng)藝性狀。

溫室苗期病害抗性調(diào)查：于2020年對 BC4F3世代材料在溫室分別進(jìn)行 TMV 、CMV 、PVY、黑脛病、青枯病人工接種鑒定，統(tǒng)計每個株系的病情指數(shù)。病害調(diào)查及病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)參照 GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》要求進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用 Excel 2019軟件，對農(nóng)藝性狀和病害抗性數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。利用 SPSS 軟件對兩年山東、湖南和四川3個環(huán)境下農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 OX2028和 Samsun 群體農(nóng)藝性狀的變異特點(diǎn)表2表明，2019年在青島、湘西和西昌3地，兩個模塊群體的6個基本農(nóng)藝性狀存在一定程度的分離。其中湘西 OX2028模塊群體的腰葉長性狀變異最小，變異系數(shù)為6.16%，其親本表型分別為79.40、77.40 cm ，后代中 OX2028模塊群體均值為67.46 cm ，變異幅度為51.00～83.00 cm。青島Samsun 模塊群體的節(jié)距性狀變異系數(shù)最大，變異系數(shù)為28.51%，親本表型為5.90、7.79 cm ，后代 Samsun 模塊群體節(jié)距均值為5.49 cm ，變異幅度為2.00～9.00 cm。

表3表明，2020年在湘西、西昌兩地，兩個模塊群體的6個基本農(nóng)藝性狀也存在一定程度的分離。其中湘西 OX2028模塊群體的腰葉長性狀變異系數(shù)最小為4.24%，親本表型為79.40、77.40 cm ，后代中 OX2028模塊群體均值為81.54 cm，變異幅度為72.00～90.00 cm。西昌 OX2028模塊群體的節(jié)距性狀變異系數(shù)最大為14.48%，親本表型分別為5.90、6.80 cm ，后代 OX2028模塊群體均值為4.04 cm ，變異幅度為2.64～5.43 cm。

2.2 模塊群體中各農(nóng)藝性狀的表型分布特點(diǎn)

基于2019—2020年三點(diǎn)的兩個群體中各農(nóng)藝性狀的測量值，由圖2-3可知，模塊群體的基本農(nóng)藝性狀呈現(xiàn)連續(xù)的正態(tài)或近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的表型分布特性。2020年 BC4F3群體的表型分布方差較2019年 BC4F2群體的變小，表明隨著親本的雜合度降低，模塊材料基因型越來越純合。

2.3 2020年 BC4F3群體病害抗性表現(xiàn)

如表4所示，在 OX2028模塊群體中，材料對 CMV、黑脛病的抗病性介于兩個親本 K326和 OX2028之間，平均病情指數(shù)分別為75.81、44.22，其中對 CMV 的抗性更趨向于 K326；對 TMV 和 PVY 的抗病性低于兩個親本，平均病情指數(shù)為37.79和78.13；對青枯病的抗病性高于兩個親本，平均病情指數(shù)為54.51。

Samsun 模塊群體對 CMV、TMV、黑脛病和青枯病的平均病情指數(shù)均介于兩個親本 K326和 Samsun 之間，分別為74.19、37.50、55.67、55.83，對 CMV 、TMV 和黑脛病的抗病性均趨向于親本 K326，對青枯病的抗病性趨向于親本 Samsun，對 PVY 的抗病性低于兩個親本，平均病情指數(shù)為80.93。綜上，模塊群體雖然遺傳背景已經(jīng)基本回復(fù)到輪回親本 K326，但是不同模塊材料在抗病性狀上仍然存在著廣泛的遺傳變異，有待深入挖掘相關(guān)抗病基因。

2.4 重要性狀模塊篩選

根據(jù)2019—2020年兩年兩點(diǎn)模塊群體在田間的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)以及苗期病害鑒定結(jié)果，初步篩選出了多個目標(biāo)性狀突出的模塊材料，包括較親本 K326葉數(shù)提高的葉數(shù)模塊；較親本 K326葉寬增加的葉寬模塊；較親本 K326抗病性提高的 TMV 抗性模塊、CMV 抗性模塊、PVY 抗性模塊、黑脛病抗性模塊、青枯病抗性模塊。重要性狀模塊材料表現(xiàn)如圖4a～i 所示。

葉數(shù)模塊：根據(jù)兩個群體的田間表現(xiàn)，篩選得到25份在兩個環(huán)境下表型一致、有效葉片數(shù)增加的材料，其中15份來自 OX2028模塊群體，10份來自 Samsun 模塊群體。與 K326相比，葉數(shù)顯著增加，湘西葉數(shù)模塊提高了2.88（圖4-a），西昌葉數(shù)模塊提高了5.16（圖4-b）。

葉寬模塊：葉寬性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大，常規(guī)育種過程中很難獲得開片好、環(huán)境間表型穩(wěn)定的遺傳材料。根據(jù)兩地兩個群體的田間表現(xiàn)，篩選到了在湘西和西昌兩個環(huán)境點(diǎn)表型一致、葉片寬度顯著增加的32份材料，其中16份來自 OX2028模塊群體，16份來自 Samsun 模塊群體。與 K326相比，葉寬模塊葉片寬度顯著增加，湘西模塊平均增加5.9 cm（圖4-c），西昌模塊平均增加8.8 cm （圖4-d）。

TMV 抗性模塊：通過抗性鑒定共篩選到抗 TMV 材料111份。如圖4-e 所示， TMV 抗性模塊平均病情指數(shù)為10.08，與 K326（病情指數(shù)為30.68）相比，病情指數(shù)降低，對 TMV 抗性顯著提高。通過N基因標(biāo)記對來自于OX2028模塊的材料進(jìn)行篩選，鑒定到17份材料攜帶N 基因，其中9份對 TMV 免疫，病情指數(shù)為0。

CMV 抗性模塊：篩選得到抗 CMV 抗性材料25份。其中有3份來自 OX2028模塊群體模塊的材料對 CMV 免疫，并且2份同時對 CMV 和 TMV 免疫。如圖4-f 所示，CMV 模塊平均病情指數(shù)為6.81，與 K326（76.37）相比，病情指數(shù)降低，對 CMV 抗性顯著提高。

PVY 抗性模塊：篩選得到抗 PVY 抗性模塊材料5份，均來自 OX2028模塊群體，其中1份為高抗。如圖4-g 所示， PVY 模塊材料平均病情指數(shù)為29.99，與親本 K326（68.00）相比，病情指數(shù)降低，對 PVY 的抗性顯著提高。

黑脛病抗性模塊：經(jīng)篩選得到抗黑脛病模塊材料44份，其中36份來自 OX2028模塊群體，18份來自 Samsun 模塊群體。如圖4-h 所示，黑脛病模塊平均病情指數(shù)為10.81，與親本 K326（29.78）相比，平均病情指數(shù)降低，黑脛病抗性顯著提高。

青枯病抗性模塊：共篩選出抗青枯病模塊材料52份，其中46份來自 OX2028模塊群體，6份來自 Samsun 模塊群體。如圖4-i 所示，青枯病模塊平均病情指數(shù)為25.11，與親本 K326（68.32）相比，平均病情指數(shù)降低，青枯病抗性顯著提高。

3 討論

傳統(tǒng)育種方法由于材料遺傳背景的不確定性和遺傳效應(yīng)難以控制，需要進(jìn)行多代的選擇和迭代，從而導(dǎo)致育種周期長，進(jìn)展緩慢。而且在傳統(tǒng)育種方法中，鑒定和克隆目標(biāo)基因是一項(xiàng)困難而耗時的工作。相比之下，染色體片段導(dǎo)入系能夠穩(wěn)定地得到遺傳背景單一且包含目標(biāo)基因或基因組區(qū)域的材料，便于對目標(biāo)基因進(jìn)行功能研究和表達(dá)調(diào)控。通過向目標(biāo)育種材料中導(dǎo)入具有抗性、適應(yīng)性或其他有益性狀的染色體片段，可以豐富品種的遺傳多樣性，更好地改良品種的性狀。

國內(nèi)外煙草染色體片段導(dǎo)入系的研究起步較晚，報道較少，僅有童治軍等[14]以烤煙 Y3為輪回親本，雪茄煙Beinhart 1000-1及烤煙 K326為供體親本構(gòu)建的染色體片段導(dǎo)入系，該群體僅包含256個不同導(dǎo)入系株系。由于煙草基因組較大，較小的群體難以覆蓋整個基因組，且導(dǎo)入片段較大的株系同樣會產(chǎn)生基因間的互作干擾。本研究以優(yōu)質(zhì)主栽烤煙品種 K326為輪回親本，以優(yōu)質(zhì)烤煙 OX2028和香料煙Samsun 為供體親本，經(jīng)過一系列的雜交、回交和自交，成功建立了以 K326為輪回親本的兩套煙草全基因組分子模塊庫。與親本相比，兩個模塊群體后代產(chǎn)生了廣泛的表型變異，篩選了3760 份材料進(jìn)行鑒定，基本保證了基因組覆蓋的完整性。通過對導(dǎo)入片段進(jìn)行分析，可以為復(fù)雜性狀 QTL 定位、創(chuàng)建近等基因系、新品種選育提供材料。

鑒定目標(biāo)性狀突出的模塊材料是解析農(nóng)藝、抗病相關(guān)性狀，探索聚合育種的基礎(chǔ)。根據(jù)分子模塊的表型數(shù)據(jù)，本研究篩選到提高產(chǎn)量的葉寬、葉數(shù)模塊，提高抗病性的病毒病、黑脛病、青枯病抗性模塊。煙草葉寬是影響產(chǎn)質(zhì)量的重要農(nóng)藝性狀，葉寬增加帶來的葉面積增加，不僅可以增加烤后煙葉的工業(yè)可用性，也能增加經(jīng)濟(jì)效益。有研究表明采取適當(dāng)措施，提高煙葉上、中部葉片的寬長比，可以改善煙葉質(zhì)量[16]。以往的遺傳研究主要采用單雙親群體，開發(fā)簡單，只有兩個基因組的重組會導(dǎo)致用于 QTL 定位的等位基因多樣性不足[17]。本研究采用兩個相關(guān)的雙親群體設(shè)計，將不同煙草類型（特別是香料煙 Samsun 和優(yōu)質(zhì)烤煙 OX2028）的片段引入相同的遺傳背景 K326，提供了更豐富的等位基因多樣性，為研究不同等位基因?qū)煵萑~寬的影響提供了材料基礎(chǔ)。為了在主栽品種 K326中導(dǎo)入病毒病抗性基因，本研究選擇了性狀優(yōu)良且免疫普通花葉病毒病的 OX2028[18]，在來自 OX2028的 TMV 抗性模塊中，篩選到了7份免疫 TMV 的模塊材料，對另外兩種病毒病也表現(xiàn)為抗病，同時在其他性狀上與輪回親本 K326表現(xiàn)一致，達(dá)到預(yù)設(shè)目標(biāo)。

K326和 OX2028都屬于烤煙品種[19]，遺傳距離較近，因此以 OX2028為供體的模塊群體的農(nóng)藝性狀變異不大，同時由于 OX2028抗病性更加優(yōu)良，群體的病毒病平均抗性較 K326有明顯提高。而 Samsun 為香料煙品種，與 K326相比，農(nóng)藝性狀差異較大，因此供體片段來自 Samsun 的群體變異程度高于 OX2028模塊群體。

4 結(jié)論

本研究利用雜交、回交、自交和分子標(biāo)記輔助選擇手段構(gòu)建了兩套以主栽烤煙品種 K326為輪回親本，以烤煙 OX2028和香料煙 Samsun 為供體親本的分子模塊庫；通過田間栽培和溫室試驗(yàn)，對模塊群體6種農(nóng)藝性狀和5種抗病性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計分析，篩選了一批目標(biāo)性狀模塊材料，獲得攜帶不同導(dǎo)入片段的目標(biāo)模塊。本研究為煙草育種創(chuàng)制了重要的遺傳材料，可用于進(jìn)一步分析復(fù)雜性狀的 QTL，挖掘煙草的遺傳基因。

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