辛?xí)詶?溫欣宇 降佳君 王玲 楊國斌 楊福孫

摘 要：為了篩選出控制檳榔花香的關(guān)鍵代謝物，提升檳榔花香，吸引更多授粉者，從而提高檳榔產(chǎn)量。本研究采用頂空固相微萃取氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)合分析技術(shù)對(duì)不同時(shí)期檳榔花進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)。結(jié)果共檢測(cè)到236 種代謝物。利用VIP 值和差異倍數(shù)相結(jié)合的方法共篩選出75 種差異代謝物，主要包括萜類、酮類、醇類等。其中檳榔雌花的揮發(fā)性化合物從雌花未開期到初開期發(fā)生大量積累，在盛開期又發(fā)生輕微下降，所以雌花初開期可能是檳榔雌花花香形成的關(guān)鍵時(shí)期。檳榔雄花的揮發(fā)性化合物在雄花初開期到盛開期發(fā)生了大量積累，所以雄花盛開期可能是檳榔雄花花香形成的關(guān)鍵時(shí)期。之后對(duì)差異代謝物使用KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，篩選與植物花香有關(guān)且富集顯著的代謝通路。結(jié)果表明：檳榔雌花中富集顯著且與花香合成有關(guān)的代謝途徑為脂肪酸生物合成，在該通路上富集的物質(zhì)為癸酸。癸酸是一種脂肪酸類物質(zhì)，其多用于植物生理和信號(hào)傳遞等功能，檳榔雌花未開期到初開期癸酸含量上調(diào)，花香釋放量也發(fā)生相應(yīng)的提升，這可能是由于檳榔在雌花初開期開始授粉，需要傳遞更多的化學(xué)信號(hào)，從而吸引授粉者。所以癸酸可能是檳榔雌花為了授粉而釋放的一種化學(xué)信號(hào)。檳榔雄花中富集顯著且與花香合成有關(guān)的代謝途徑分別為雙萜類生物合成和脂肪酸降解，棕櫚醛和（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘分別富集在這2 條代謝途徑上。（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘為萜類物質(zhì)，中文名為貝殼杉烯是雙萜類物質(zhì)，它的對(duì)映體ent-貝殼杉烯在貝殼杉烯合酶的作用下由反式-牻牛兒基牻牛兒焦磷酸開環(huán)而合成，是赤霉素的前體。雄花初開期到盛開期該物質(zhì)含量發(fā)生下調(diào)，可能是由于雄花盛開期時(shí)所需赤霉素含量降低。棕櫚醛為醛類物質(zhì)，是脂肪酸生物降解釋放出的代謝物，檳榔雄花初開期到盛開期花香釋放量升高，同時(shí)棕櫚醛的含量也發(fā)生上調(diào)，二者之間呈正相關(guān)關(guān)系。因此，以上3 種代謝物可能是影響檳榔花香的關(guān)鍵代謝物。

關(guān)鍵詞：代謝途徑；代謝組學(xué)；檳榔花；差異代謝物

中圖分類號(hào)：S792.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

檳榔（Areca catechu L.）屬棕櫚科檳榔屬常綠喬木，是海南農(nóng)戶的主要收入來源[1]。檳榔屬被子植物，其傳粉方式分為自花傳粉和異花傳粉2 種類型。異花傳粉主要分為風(fēng)媒花與蟲媒花，以風(fēng)作為授粉媒介稱為風(fēng)媒花，風(fēng)媒花顏色通常較為暗淡，氣味不明顯，同時(shí)不能產(chǎn)生花蜜，花粉粒較為干燥不具有黏著性，而且質(zhì)量小容易被風(fēng)傳送。蟲媒花指以昆蟲為授粉媒介。蟲媒花多具美麗花瓣、蜜腺和特征香味，花粉具有黏著性容易附著在昆蟲身體上的特點(diǎn)。檳榔雌雄花雖然同株同序，但雌雄花不同期開放，為異花授粉植物。由于檳榔授粉率較低，導(dǎo)致其產(chǎn)量低下。檳榔雌花顏色鮮艷、體型較大并有花香，雄花花粉質(zhì)輕，易被風(fēng)吹送，同時(shí)有大量香味溢出，前人認(rèn)為檳榔為風(fēng)媒花，但從表型分析發(fā)現(xiàn)檳榔花具有蟲媒花特性，尤其檳榔雌雄花均有香味，且能產(chǎn)蜜。而花香作為一種化學(xué)信號(hào)有助于授粉者辨別植物的種類和位置[2]，具有吸引授粉者的功能。

但由于檳榔花香味不足，吸引授粉者較少從而導(dǎo)致產(chǎn)量較低。

代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，可將樣品信息進(jìn)行有效整合，具有所需時(shí)間短、精度高和涵蓋面廣的特點(diǎn)，能夠更加準(zhǔn)確、全面地檢測(cè)樣品中的小分子代謝物[3-5]。其中，非靶向代謝組學(xué)有助于更加全面地反映代謝物的變化，同時(shí)對(duì)于新的代謝通路的挖掘也有利[6]。固相微萃?。╯olidp phasemieroextraetion， SPME）技術(shù)是一種近年來新興的處理技術(shù)，該技術(shù)對(duì)于食品香氣分析意義重大[7-9]。

目前對(duì)檳榔花的研究主要集中在其藥用成分和特殊功效方面[10-13]?，F(xiàn)有研究只對(duì)檳榔雄花與花梗的香氣成分進(jìn)行了初步分析，并未明確控制檳榔雌雄花花香的關(guān)鍵代謝物及其各時(shí)期的花香釋放規(guī)律[14]。

在植物中與花香有關(guān)的通路主要分為三大類，分別為萜烯類化合物的生物合成、苯丙烷/苯環(huán)類化合物的生物合成和脂肪酸衍生物的生物合成。因此本研究將采用頂空固相微萃取氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)，對(duì)不同時(shí)期的檳榔花進(jìn)行代謝組學(xué)分析，明確檳榔花各時(shí)期的花香釋放規(guī)律，同時(shí)篩選出與花香合成有關(guān)的通路，從而確定控制檳榔花花香的關(guān)鍵代謝物，為提升檳榔花香提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 檳榔花于2021 年4 月20 日至7 月20 日取于海南省瓊中縣檳榔園，經(jīng)鑒定為海南本地品種。供試材料為雌花未開期（F1）、初開期（F2）、盛開期（F3），雄花初開期（M1）和盛開期（M2）共5 個(gè)時(shí)期的檳榔花（圖1），每個(gè)時(shí)期3 次重復(fù)。采集的樣品送至邁維（武漢）生物科技有限公司進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 本研究采用的儀器主要為安捷倫（Agilent）8890-5977B 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、安捷倫（Agilent）DB-5MS 型色譜柱、安捷倫（Agilent）120 μm DVB 萃取頭，均由安捷倫公司生產(chǎn)。

1.2 方法

本研究主要參考CHEN 等[15]和戴宇樵等[16]的實(shí)驗(yàn)方法，將所取樣品使用液氮進(jìn)行研磨，加入NaCl 溶液，使用全自動(dòng)頂空固相微萃取對(duì)樣本進(jìn)行萃取，以供GC-MS 分析。

色譜條件：DB-5MS 毛細(xì)管柱，恒流流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，電子能量為70 eV，掃描范圍為50～500 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析得到的原始數(shù)據(jù)先進(jìn)行峰提取，獲取特征峰的峰面積和保留時(shí)間等信息，然后采用邁維云平臺(tái)和公共數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定。

根據(jù)差異系數(shù)（variable importance inproject， VIP≥1，P<0.05）[17]和最大差異倍數(shù)值對(duì)檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行篩選，同時(shí)對(duì)差異代謝物進(jìn)行途徑分析[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔花中的揮發(fā)性有機(jī)化合物分析

通過HS-SPMEGC/MS 方法，在不同時(shí)期的檳榔雌花、雄花中共鑒定出236 種揮發(fā)性有機(jī)化合物，包括酯類、萜類、酸類等物質(zhì)（圖2）。其中酯類的種類最豐富（約25%），其次為雜環(huán)化合物（約15%）和萜類（約15%）。在植物中雜環(huán)化合物一般對(duì)植物香味影響較小，但酯類物質(zhì)與萜類物質(zhì)的香氣閾值較低對(duì)植物花香貢獻(xiàn)很大，所以本研究認(rèn)為這些揮發(fā)性有機(jī)化合物在促進(jìn)檳榔花香氣中起著非常重要的作用。

2.2 不同時(shí)期檳榔花的代謝判別分析

2.2.1 主成分分析 對(duì)所得數(shù)據(jù)使用主成分分析，PCA 得分如圖3 所示。主成分1 的貢獻(xiàn)率為45.47%，主成分2 的貢獻(xiàn)率為12.97%。X 軸方向模型的累積解釋率R2X=0.751，因此該P(yáng)CA 模型擬合性較好。雄花M1 與M2 和雌花F1、F2、F3 基本分離，雖然M1 與雌花樣本相距較近，可能是相同品種，代謝物種類相近導(dǎo)致的，但基本得到了有效區(qū)分，說明組間存在差異。

2.2.2 正交偏最小二乘判別分析 OPLS-DA 可以將與分類無關(guān)的影響信息過濾掉，有助于對(duì)組間差異進(jìn)行更加精確的區(qū)分。采用OPLS-DA 對(duì)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)檳榔雌花與雄花樣品分布在置信區(qū)間的左側(cè)和右側(cè)，二者被明顯區(qū)別，說明其存在顯著差異，因此對(duì)檳榔雌雄花進(jìn)行分類研究（圖4）。模型累計(jì)預(yù)測(cè)率Q2＝0.758，R2X=0.631，R2Y=0.992 說明該評(píng)估模型可靠有效（圖5）。

2.3 檳榔雌花不同時(shí)期差異代謝物篩選

通過VIP≥1，P<0.05 對(duì)不同時(shí)期的檳榔雌花進(jìn)行差異代謝物篩選，其中F1 VS F2 共篩選出17種差異代謝物，17 種差異代謝物全部發(fā)生上調(diào)，其中酯類物質(zhì)4 種、雜環(huán)類化合物4 種、醛類2種、酮類2 種、鹵代烴2 種、酸類1 種、醚類1種、萜類1 種。F2 VS F3 共篩選出6 種差異代謝物，6 種物質(zhì)全部發(fā)生下調(diào)，其中烴類5 種、酸類1 種。F1 VS F3 共篩選出8 種差異代謝物，其中2 種物質(zhì)發(fā)生下調(diào)，6 種物質(zhì)上調(diào)，其中酮類物質(zhì)2 種、酯類物質(zhì)2 種、雜環(huán)類化合物2 種、醛類1 種、酸類1 種。由此可見，在檳榔雌花發(fā)育過程中，揮發(fā)性有機(jī)化合物在F2 時(shí)期發(fā)生大量積累，在F3 時(shí)期又發(fā)生了一定程度的下降，但相對(duì)于F1 時(shí)期，F(xiàn)2 和F3 時(shí)期揮發(fā)性有機(jī)化合物都發(fā)生了大量的積累，這些結(jié)果表明揮發(fā)性有機(jī)物在檳榔雌花的初開期和盛開期發(fā)生了大量積累。

差異表達(dá)的代謝物可能是檳榔雌花發(fā)育過程中香氣形成的重要因素。

本課題組對(duì)這些差異代謝物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)（表1），相比與F1 時(shí)期，F(xiàn)2 時(shí)期的檳榔雌花中酯類物質(zhì)發(fā)生了大幅度的提升，在植物中酯類物質(zhì)主要通過脂肪酸氧化形成，使植物呈現(xiàn)花香味，這表明在F2時(shí)期檳榔雌花的香味也相應(yīng)的大幅度提升。除酯類物質(zhì)外，酸類物質(zhì)的提升將近7 倍，在植物中酸類物質(zhì)主要賦予植物酸味，在F2 時(shí)期差異表達(dá)的酸類物質(zhì)為癸酸，癸酸屬于脂肪酸物質(zhì)在植物中一般具有脂香和柑橘味，同時(shí)用于傳遞化學(xué)信號(hào)，在F2 時(shí)期檳榔雌花剛剛開放將要授粉，此時(shí)癸酸含量激增，所以癸酸可能是檳榔雌花開放的一種化學(xué)信號(hào)物質(zhì)。相比與F2 時(shí)期，F(xiàn)3時(shí)期揮發(fā)性化合物發(fā)生下降，但主要下降物質(zhì)為烴類物質(zhì)，在植物中烴類物質(zhì)一般對(duì)香味影響較低，所以F3時(shí)期檳榔雌花香味只發(fā)生了輕微下降，不做具體分析。綜上所述，F(xiàn)2 時(shí)期可能是檳榔雌花花香形成的關(guān)鍵時(shí)期。

2.4 檳榔雄花不同時(shí)期差異代謝物篩選

通過VIP≥1，P<0.05 對(duì)不同時(shí)期的檳榔雄花進(jìn)行差異代謝物篩選，其中M1 VS M2 共篩選出44 種差異顯著代謝物，其中萜類12 種、酯類10種、雜環(huán)化合物5 種、酮類物質(zhì)4 種、芳烴3 種、酸類物質(zhì)2 種、胺類物質(zhì)2 種、醇類物質(zhì)2 種、醛類2 種、酚類1 種、烴類物質(zhì)1 種，其中40 種上調(diào)物質(zhì)占91%，4 種下調(diào)物質(zhì)占9%。由此可見，在M2 時(shí)期揮發(fā)性有機(jī)化合物開始大量積累，差異表達(dá)的代謝物可能是檳榔雄花香氣形成的重要因素。

本課題組對(duì)雄花差異代謝物進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)（表2），相比于M1，M2 中萜類物質(zhì)、酯類物質(zhì)均發(fā)生了大幅度的提升，在植物中酯類物質(zhì)和萜類物質(zhì)其香氣閾值普遍較低，對(duì)植物花香影響較大，所以在M2 時(shí)期檳榔雄花的花香發(fā)生了大幅度的升高，綜上所述M2 時(shí)期可能是檳榔雄花花香形成的關(guān)鍵時(shí)期。

2.5 差異代謝物分類

為了對(duì)不同時(shí)期的檳榔雌雄花的差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步分析，本研究對(duì)富集在代謝通路上不同時(shí)期檳榔花的差異代謝物進(jìn)行熱圖分析（圖6，圖7），圖中行與代謝物質(zhì)相對(duì)應(yīng)，列與樣本相對(duì)應(yīng)，檳榔雌花9 個(gè)樣本，雄花6 個(gè)樣本。含量的高低使用不同顏色進(jìn)行表示，上調(diào)為紅色，下調(diào)為藍(lán)色，從藍(lán)色到紅色是由低到高的表達(dá)。由圖6 可知，檳榔雌花的聚類熱圖主要有3 種物質(zhì)，分別為癸酸、L-α-松油醇、水楊酸，F(xiàn)1 VS F2 這3種物質(zhì)均發(fā)生了上調(diào)，F(xiàn)2 VS F3 這3 種物質(zhì)均發(fā)生了下調(diào)。由圖7 可知，檳榔雄花的聚類熱圖主要有4 種物質(zhì)，分別為（4aR，6aS，9R，11aR， 11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘、L-α-松油醇、對(duì)二甲苯、棕櫚醛，在M1 VS M2中， （4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b- 三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘發(fā)生了下調(diào)，L-α-松油醇、對(duì)二甲苯、棕櫚醛3 種物質(zhì)發(fā)生了上調(diào)。

2.6 差異代謝物KEGG 富集分析

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)檳榔雌雄花差異代謝物所在通路進(jìn)行分析，雌花差異代謝物主要分布在6 條代謝通路中（圖8）。雄花差異代謝物主要分布在5 條代謝通路中（圖9）。

檳榔雌花中富集顯著的通路分別為代謝物通路、脂肪酸生物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3 條通路。其中與花香合成有關(guān)的通路為脂肪酸生物合成，在該通路上富集的物質(zhì)為癸酸，癸酸是一種脂肪酸類物質(zhì)，植物多使用脂肪酸來合成?；|(zhì)，用于生理、防御和信號(hào)傳遞等功能。在檳榔雌花未開期到初開期開始授粉，此時(shí)癸酸含量發(fā)生上調(diào)，花香釋放量也發(fā)生大幅度的提升。所以，癸酸可能是檳榔雌花釋放的一種化學(xué)信號(hào)，用來吸引授粉者提升授粉率。

檳榔雄花中富集顯著的通路分別為雙萜類生物合成和脂肪酸降解2 條通路。2 條通路都與花香合成有關(guān)。有2 種物質(zhì)分別被富集到這2 條通路中，分別為（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘和棕櫚醛。（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘中文名為貝殼杉烯是雙萜類物質(zhì)，是植物花香的一種重要組成物質(zhì)，它的對(duì)映體ent-貝殼杉烯在貝殼杉烯合酶的用作下由反式-牻牛兒基牻牛兒焦磷酸開環(huán)而合成，是赤霉素的前體。在雄花初開期到雄花盛開期該物質(zhì)發(fā)生下調(diào)，可能是檳榔雄花此時(shí)已經(jīng)過了脫落期，對(duì)赤霉素的需求發(fā)生了降低。棕櫚醛是醛類物質(zhì)有花和蠟的香氣，是脂肪酸生物降解釋出的代謝物，檳榔雄花初開期到盛開期花香釋放量升高，同時(shí)棕櫚醛的含量也發(fā)生上調(diào)，釋放出大量香味，以吸引授粉者采集花粉。

3 結(jié)論

檳榔是海南省一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究建立了基于非靶向代謝組學(xué)對(duì)不同時(shí)期檳榔花差異代謝物的分析方法。研究表明，檳榔雌花中共檢測(cè)出155 種芳香化合物，其中雌花初開期花香釋放量最高、盛開期次之、未開期最低，不同時(shí)期的檳榔雌花代謝物差異主要來源是脂類和酸類，其中癸酸可能是控制檳榔雌花花香的關(guān)鍵代謝物。檳榔雄花中共檢測(cè)出166 種芳香化合物，其中雄花盛開期的花香釋放量高于初開期，不同時(shí)期的檳榔雄花代謝物差異主要來源是萜類、酯類、醛類， 其中（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘和棕櫚醛可能是控制檳榔雄花花香的關(guān)鍵代謝物。本研究結(jié)果明確了控制檳榔雌雄花花香的關(guān)鍵代謝物和各時(shí)期的花香釋放規(guī)律，而這些關(guān)鍵代謝物的具體合成機(jī)制有待進(jìn)一步探索，從而為定向調(diào)控檳榔花香提高產(chǎn)量提供一定的理論參考價(jià)值。

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