井敏敏 李小針 李棟梁 戴小紅 顧帥磊 馬朝明 陳志輝 陳晶晶

摘 要：自交不親和性是高等植物通過抑制自花授粉來阻止近親繁殖的一種繁殖機制。在以茄科、薔薇科、車前草科為代表的配子體自交不親和機制中，花粉和雌蕊之間的自我/非自我識別由多態(tài)性S 位點決定，其中SLF（S-locus F-box）/SFB（S-haplotype-specific F-box）基因是配子體自交不親和花粉S 決定因子。本研究通過生物信息學(xué)方法從菠蘿基因組中篩選鑒定出21 個SLF/SFB 家族基因（AcSLF1～AcSLF21），各AcSLF 基因在N 端具有F-box 保守結(jié)構(gòu)域，其氨基酸長度、理論等電點、分子量存在較大差異，編碼氨基酸序列大小范圍為242～612 aa，分子量為27.778～69.070 kDa，其中18 個AcSLFs 蛋白偏堿性，總體蛋白穩(wěn)定性較差，預(yù)測18 個AcSLFs 蛋白亞細胞定位于細胞核中，蛋白二級結(jié)構(gòu)60%以上由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)其不均勻地分布在14 條染色體上，其中AcSLF21 未定位到具體染色體位置，并發(fā)現(xiàn)AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14 和AcSLF15 與菠蘿RNase T2 家族基因發(fā)生連鎖。從進化關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，菠蘿SLF/SFB 家族與薔薇科、車前科、茄科植物SLF/SFB 進化關(guān)系較遠。利用qRT-PCR對AcSLFs 基因在菠蘿雌蕊、雄蕊、葉片、果肉、莖和根的表達量進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcSLFs 基因在菠蘿不同組織中具有明顯的表達差異性，其中AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21 基因在菠蘿雄蕊中呈高表達量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表達量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表達量顯著高于其他組織，總體來說，大部分菠蘿AcSLFs 基因主要在菠蘿雄蕊或葉片中高表達。同時分析了雌蕊自花、異花授粉前后的表達變化，發(fā)現(xiàn)AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三個基因在授粉雌蕊中的表達量較未授粉顯著上調(diào)，尤其在授粉6 h 表達量急劇上調(diào)，隨著花粉管的伸長其表達量降低，但在授粉24 h 仍具有較高的表達量，推測這些基因可能在菠蘿自交不親和中起到重要作用。該研究為菠蘿SLF/SFB 家族基因的克隆提供參考，并為菠蘿自交不親和機制研究奠定良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菠蘿；SLF/SFB 基因家族；生物信息學(xué)；表達量分析

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A

植物自交不親和性（self-incompatibility， SI）是指綠色開花植物能產(chǎn)生正常的配子，但自花不能正常授粉或授粉后不能正常結(jié)籽的一種生殖隔離現(xiàn)象[1]。菠蘿屬于典型的自交不親和植物，除了部分野生種外，多數(shù)菠蘿品種自交不親和，無法產(chǎn)生種子，而菠蘿類群Ananas comosus var.Comosus（主要是栽培菠蘿）自交不親和表現(xiàn)尤為突出。目前普遍認為菠蘿屬于配子體自交不親和類型[2-3]，配子體自交不親和是植物界分布最廣泛的自交不親和調(diào)控機制，目前在薔薇科、玄參科、茄科、罌粟科等配子體自交不親和類型植物的研究中表明，花柱自交不親和的決定因子被確定為S-RNase 基因，花粉決定因子為編碼F-box蛋白的SLF（S-locus F-box）/SFB（S-haplotype-specificF-box）基因[4-5]。花柱分泌的S-RNase 可進入花粉管，通過自身的核糖核酸酶活性降解自花花核糖核酸酶活性降解自花花粉管中的rRNA，造成花粉管細胞骨架解體[6-7]，從而抑制花粉管生長，造成自交不親和，與S-RNase 互作的SLF/SFB 可通過形成SCF 復(fù)合體泛素化非自我S-RNase，泛素化的S-RNase 最終被26S 蛋白酶體降解[8]，從而消除了S-RNase 的細胞毒性作用，花粉管可在花柱中繼續(xù)生長。

迄今為止，已經(jīng)從茄科、薔薇科和玄參科等多種配子體型自交不親和植物中分離出近百個花柱關(guān)鍵基因S-RNase[9]，且其作用機制已研究較深入，但花粉關(guān)鍵控制基因研究稍滯后。LAI 等[10]通過對金魚草S 基因座進行長片段測序，首次發(fā)現(xiàn)了1 個與S2-RNase 緊密連鎖的編碼F-box 蛋白的基因AhSLF-S2，該基因在花粉中特異性表達。

薔薇科植物梅、扁桃中也鑒定出多個在花粉中特異性表達，同時具有較高序列多態(tài)性的編碼F-box蛋白的基因[11-12]。在金魚草及矮牽牛中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)證實了S 基因座中的F-box 基因決定了花粉自交不親和特異性反應(yīng)，并命名為S-locus F-box（SLF）[13]。在薔薇科植物中，花粉S 決定因子缺乏統(tǒng)一的命名，蘋果亞科花粉S 候選基因被命名為S-locus F-box Brothers（SFBB）[14]，李屬植物被命名為S-haplotype-specific F-box（SFB）[15]。

目前，關(guān)于菠蘿自交不親和的研究主要集中在組織細胞學(xué)和田間雜交試驗上，菠蘿自交不親和的主要控制基因尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)在菠蘿基因組中分離出21 個SLF/SFB家族成員，并對其理化特性、基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、保守結(jié)構(gòu)域以及系統(tǒng)進化關(guān)系進行詳細分析，并對各基因在菠蘿不同組織中的表達模式進行分析，同時對雌蕊授粉前后AcSLF 基因的表達變化進行分析，以期為菠蘿自交不親和機制等方面研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料金菠蘿（MD2）、巴厘菠蘿（ComteDe Paris）種植于廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所國家熱帶果樹種質(zhì)資源圃，2 種材料均為自交不親和材料，且巴厘菠蘿授粉金菠蘿為親和可育。

收集金菠蘿、巴厘菠蘿成熟花粉至離心管，用小毛刷蘸取花粉授于金菠蘿柱頭，分別于授粉2、6、24 h 后取花柱，立即液氮冷凍，同時采集金菠蘿葉片、雄蕊、未授粉雌蕊、果肉、莖、根組織樣品進行冷凍，于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 菠蘿SLF/SFB 基因全基因組鑒定及理化特性分析 菠蘿基因組數(shù)據(jù)從Pineapple GenomicsDatabase（http：//pineapple.zhangjisenlab.cn/pineapple/html/index.html）[16]下載。從NCBI 中下載已報道的SLF/SFB 序列，采用MEGA 5 軟件[17]進行ClustalW 核苷酸序列比對，然后利用HMMER 軟件的Hmmbuild 生成SLF/SFB 的HMM 種子文件，基于此種子文件，篩選菠蘿SLF/SFB 基因。

利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件進行理論等電點、蛋白分子量、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶系數(shù)、疏水指數(shù)等分析。利用Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測亞細胞定位。利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 菠蘿AcSLF 基因染色體定位 利用TBtools[18]軟件對菠蘿AcSLF 基因進行染色體定位作圖。

1.2.3 菠蘿AcSLF 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用MEGA5.0軟件構(gòu)建菠蘿AcSLF 系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹構(gòu)建方法為鄰接法（Neighbor-joining method），bootstrap 值設(shè)置為1000。

1.2.4 菠蘿AcSLF 基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析從菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫獲得21 個AcSLFs 的基因組和CDS 序列， 使用GSDS （ http：//gsds. cbi.pku.edu.cn/）[19]在線軟件繪制各基因的內(nèi)含子–外顯子結(jié)構(gòu)圖。蛋白結(jié)構(gòu)域采用SMART（http：//www.smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件進行分析，并由TBtools 軟件進行可視化作圖。

1.2.5 菠蘿AcSLF 基因表達分析 利用OMGARNA 提取試劑盒從菠蘿不同組織（葉片、雄蕊、雌蕊、果肉、莖、根以及授粉后雌蕊）中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。利用SYBRGreen qPCR Master Mix 在Quant StudioTM 6 FlexSystem 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)進行qRT-PCR 分析，內(nèi)參基因為PP2A[20]（引物序列信息見表1）。

使用2–ΔΔCT 方法[21]計算各基因的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿SLF/SFB 基因鑒定與理化特性分析

通過對菠蘿基因組檢索和鑒定，共獲得21 個SLF/SFB 基因， 按照其在染色體位置命名為AcSLF1～AcSLF21。對21 個菠蘿AcSLFs 進行理化特性分析，結(jié)果顯示，AcSLFs 在氨基酸長度、理論等電點、分子量有較大差異，AcSLFs 的氨基酸序列大小范圍為242～612 aa，分子量介于27.778～69.070 kDa 之間，預(yù)測的AcSLFs 的理論等電點（pI）為5.70～9.57，除AcSLF1、AcSLF5、AcSLF10、AcSLF15 外，其他蛋白偏堿性（pI>7）。總體AcSLFs 蛋白穩(wěn)定性較差，僅AcSLF19、AcSLF21較穩(wěn)定（表2）。

利用Cell-PLoc 2.0 軟件預(yù)測蛋白質(zhì)亞細胞定位，預(yù)計有18 種AcSLFs 蛋白只定位于細胞核，AcSLF4 定位在葉綠體，AcSLF7、AcSLF17 在細胞核與葉綠體中均有分布。通過分析AcSLFs 蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由α-螺旋（alpha helix）、延伸鏈（extended strand）、β-轉(zhuǎn)角（beta turn）和無規(guī)則卷曲（random coil）4 種構(gòu)型組成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲占60%以上，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占30%左右，無規(guī)則卷曲占比最大約50%（表3）。

2.2 菠蘿AcSLFs 基因染色體定位

為明確菠蘿AcSLFs 基因在染色體上的分布，利用菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫中的基因位置信息，使用Tbtools 軟件對基因在染色體上位置進行可視化（圖1）。結(jié)果顯示，AcSLF21 位于scaffold_1507，尚未定位到具體染色體位置，其余染色體不均勻地分布在14 條染色體上，其中AcSLF3、AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 位于LG02 號染色體，大部分基因位于染色體兩端。同時發(fā)現(xiàn)部分AcSLFs 基因與菠蘿RNase T2 家族基因發(fā)生連鎖，其中AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6 與Aco001100 緊密連鎖，AcSLF8與Aco004758 連鎖，AcSLF14、AcSLF15 與Aco00-4148 連鎖。

2.3 菠蘿AcSLFs 進化樹構(gòu)建

為了解菠蘿AcSLFs 蛋白之間進化關(guān)系，將21 個AcSLFs 蛋白序列與蘋果、梅、櫻桃等薔薇科植物、金魚草車前科植物、番茄、矮牽牛等茄科植物的SLF/SFB 蛋白序列進行多重序列比對，通過NJ 的方法使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2 所示（藍色表示茄科植物，紅色表示金魚草車前科植物，綠色表示薔薇科植物，黃色表示菠蘿）。通過進化樹分支聚類關(guān)系可以看出，番茄、多毛番茄和矮牽牛的SLF、SLFL 聚為一類，蘋果、梨、甜櫻桃的SLFL、FBX 和SFBB聚為一類，甜櫻桃、扁桃、梅的SFB 聚為一類，而菠蘿AcSLFs 與已報道的SLF/SFB 蛋白均未聚類到一起，說明菠蘿AcSLFs 與薔薇科、車前科、茄科植物SLF/SFB 進化關(guān)系較遠，在進化樹分支上聚類程度較低，這也說明了單子葉植物菠蘿與雙子葉植物親緣關(guān)系較遠。

2.4 菠蘿AcSLFs 基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

在21 個SLF/SFB 家族成員中，11 個AcSLFs基因均含有內(nèi)含子，其中AcSLF3 含有4 個內(nèi)含子，其他10 個基因只包含1～2 個內(nèi)含子（圖3A），不同的AcSLFs 基因含有內(nèi)含子數(shù)量不同，而內(nèi)含子與基因分類無顯著相關(guān)性。對21 個菠蘿AcSLFs基因進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明各AcSLFs基因在N 端具有F-box 保守結(jié)構(gòu)域， 其中AcSLF17、AcSLF19、AcSLF21、AcSLF3 只含有F-box 結(jié)構(gòu)域， 不含其他結(jié)構(gòu)域， AcSLF13、AcSLF16 在C 端具有F-box 關(guān)聯(lián)的FBA 結(jié)構(gòu)，另外AcSLF20、AcSLF4、AcSLF15、AcSLF5、AcSLF8基因含有Kelch 結(jié)構(gòu)域（圖3B）。

2.5 菠蘿AcSLFs 基因組織表達分析

為了研究菠蘿AcSLFs 基因組織表達模式，通過qRT-PCR 技術(shù)對21 個AcSLFs 基因在菠蘿雄蕊、雌蕊、葉片、果肉、莖和根不同組織的表達量進行分析。結(jié)果顯示（圖4），不同的AcSLFs基因在菠蘿不同組織中表現(xiàn)出明顯的表達差異，其中，AcSLF1、AcSLF4、AcSLF13、AcSLF14、AcSLF15、AcSLF16 和AcSLF17 在葉片中呈最高表達量，AcSLF3、AcSLF7 在果肉中表達量最高，AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18 在根中表達量高于其他組織，AcSLF6 在6 個組織部位表達量均較低，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21在雄蕊中呈高表達量?？傮w來說，大部分菠蘿AcSLFs 基因主要在菠蘿雄蕊或葉片中表達量高。

2.6 菠蘿AcSLFs 基因授粉前后的表達差異分析

通過對21 個AcSLFs 基因在未授粉金菠蘿雌蕊、自花授粉2、6、24 h 以及巴厘菠蘿授金菠蘿雌蕊2、6、24 h 的表達分析發(fā)現(xiàn)，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 三個基因在授粉后表達顯著上調(diào)，尤其是異花授粉后6 h，表達量顯著高于未授粉雌蕊，在授粉后24 h 同樣具有較高表達量，同時異花授粉表達量高于自花授粉（圖5）。AcSLF5 在自花授粉后表達上調(diào)，而異花授粉后幾乎無表達，AcSLF10、AcSLF11、AcSLF17、AcSLF19、AcSLF20和AcSLF21 在異花授粉6 h 稍上調(diào)表達。在配子體自交不親和植物中，親和與不親和花粉均可在柱頭上萌發(fā)生長，并伸入花柱，S-RNase 主要聚集在花柱上端， 當花粉管受到雌蕊分泌的S-RNase 脅迫時，會啟動相應(yīng)保護機制，花粉管編碼多個識別非自我S-RNase 的SLF 蛋白，SLF蛋白可識別并泛素化非自我S-RNase，使S-RNase喪失毒性，從而花粉管可繼續(xù)生長，而“自身”花粉管在S-RNase 的毒性下喪失活性停止生長[22-23]。

在菠蘿授粉后，AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 基因異花授粉顯著高于自花授粉，這說明“非自我”花粉SLF 基因的高表達，有助于其更好地發(fā)揮解毒作用，暗示這3 個基因在菠蘿自交不親和中發(fā)揮重要作用。

3 討論

本研究通過全基因組檢索鑒定了21 個菠蘿AcSLFs，與矮牽牛16～20 個SLF 基因數(shù)目相當[24]，與柑橘中報道113 個SLF/SLFL 基因相差較多[25]。

AcSLFs 在氨基酸長度、理論等電點、分子量有較大差異，且絕大多數(shù)AcSLFs 蛋白為堿性蛋白，總體AcSLFs 蛋白穩(wěn)定性較差，僅AcSLF19、AcSLF21 較穩(wěn)定?；赟-RNase 介導(dǎo)的自交不親和反應(yīng)，雌蕊S 基因S-RNase 周圍存在多個SLF/SFB 共同行使花粉S 基因功能，通過形成SCF復(fù)合體泛素化非自我S-RNase，從而S-RNase 被26S 蛋白酶體降解，而SLF/SFB 無法識別降解自我S-RNase，導(dǎo)致自交不親和性[26-27]。通過染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)20 個AcSLFs 基因定位在14 條染色體上，AcSLF21 未定位到具體染色體位置，同時發(fā)現(xiàn)AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14、AcSLF15 與菠蘿RNase T2 家族基因連鎖，ZHAO 等[28]在菠蘿LG15 染色體上發(fā)現(xiàn)存在RNase T2 家族基因與F-box 基因緊密連鎖。

WILLIAMS 等發(fā)現(xiàn)矮牽牛SLF 基因均位于S-RNase 基因序列的下游，且與S-RNase 具有相反的轉(zhuǎn)錄方向[29-31]，目前尚不清楚是否所有配子體自交不親和植物的S 基因均具有此特性，在菠蘿中與S-RNase 連鎖的SLF 基因AcSLF6 、AcSLF15 位于S-RNase 基因下游，其余幾個基因位于上游，且在菠蘿中發(fā)現(xiàn)與S-RNase 連鎖的F-Box基因較少，遠遠少于矮牽牛、柑橘等其他配子體自交不親和物種。

菠蘿AcSLFs 基因組織表達分析發(fā)現(xiàn)AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF8、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21在雄蕊中具有較高表達量，其中AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 基因在授粉后的花柱中表達顯著上調(diào)，且異花授粉顯著高于自花授粉，尤其在異花授粉6 h 表達量急劇升高，這說明異花授粉誘導(dǎo)了其表達，隨著花粉管在雌蕊中的伸長其表達量降低，但在授粉24 h 后仍然具有較高的表達量。張偉等[32]研究發(fā)現(xiàn)神灣與親和性不同的父本進行授粉7 h后，親和性強的花粉管已伸長至花柱中部。本研究前期利用苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)親和花粉管在授粉24 h已達到花柱底端，異花授粉后AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 的表達趨勢與花粉管的生長相吻合，其表達模式表明AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15 可能是調(diào)控菠蘿自交不親和反應(yīng)的重要因子。本研究只分析了AcSLFs 在授粉后花柱包含花粉管一起的表達模式，還需進一步建立體外花粉管培養(yǎng)及誘導(dǎo)不親和反應(yīng)，分析其在花粉管中的表達模式及作用機制。本研究對菠蘿SLF/SFB 家族成員進行鑒定和表達分析，有助于進一步尋找菠蘿自交不親和花粉S 決定因子，為研究菠蘿自交不親和機制研究提供良好的理論基礎(chǔ)。

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