伍寶朵 高效梅 胡麗松 譚樂和 閆林 吳剛

摘 要：面包果被認(rèn)為是最有潛力解決熱帶饑荒的糧食作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國面包果資源引種于多個(gè)國家，來源較豐富，目前未對其進(jìn)行系統(tǒng)的分類和遺傳多樣性分析。為明確面包果資源間遺傳距離，揭示其親緣關(guān)系，本研究從75 對SSR 標(biāo)記中篩選出33 對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的標(biāo)記，用于面包果資源的遺傳多樣性分析。

對面包果資源進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用8%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，利用NTSYS 軟件進(jìn)行遺傳多樣性相關(guān)分析。結(jié)果表明：33 個(gè)SSR 標(biāo)記的擴(kuò)增條帶多態(tài)性比率為94.57%，共檢測出199 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每個(gè)標(biāo)記檢測出6.030 個(gè)；SSR 標(biāo)記的PIC 值在0.623～0.940 之間，平均為0.865；面包果資源間遺傳相似系數(shù)在0.517～0.951 之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.685，且硬面包果Ⅰ型ZZP 資源內(nèi)個(gè)體間差異最大，平均遺傳相似系數(shù)為0.626，無核型面包果XYS1-3 資源內(nèi)個(gè)體間差異最小，平均遺傳相似系數(shù)為0.723；遺傳相似系數(shù)為0.713 時(shí)，將30 份面包果資源聚成5 類，XBL（Artocarpus odoratissimus）和園林栽培硬面包果Ⅰ型種質(zhì)（ZZP、LX、STH、HJ5）聚為一類，無核型面包果（SLLK、XYS2、XYS3、XYS5、XYS6、YN）聚為一類，硬面包果Ⅱ型（SLM2、YDNXY1、G1、G2）聚為一類，硬面包果Ⅱ型（W1、W3、SMY、8-4、8-3、5-5、5-6）聚為一類；三維圖能較好地將XBL 和園林栽培硬面包果Ⅰ型與食用價(jià)值較大的無核型面包果和硬面包果Ⅱ型區(qū)分開。依據(jù)聚類分組情況，可推測XYS2、XYS3、XYS5 和XYS6 可能引種于越南，XYS1-3、YBG 和XYS1 可能引種于印度尼西亞，F(xiàn)J 可能是無核型面包果。該研究闡明了30 份面包果資源間的親緣關(guān)系，為面包果品種選育、鑒別提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：面包果；種質(zhì)資源；SSR 分子標(biāo)記；親緣關(guān)系；遺傳多樣性

中圖分類號：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

面包果屬于桑科（Moraceae ） 菠蘿蜜屬（Artocarpus），起源于南太平洋島國，被認(rèn)為是最有潛力解決熱帶地區(qū)饑荒的糧食作物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。我國海南、廣東、云南、廣西、福建等地均有零星種植。果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值豐富，富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，樹姿美，可作行道樹、庭院樹等[3-5]。JONES 等[6]通過形態(tài)鑒定將其分為A. camansi Blanco、A. altilis （Parkinson）Fosberg 和A. mariannensis Trécul，早期A. altilis×A.mariannensis 雜交種和馴化A. altilis×A. mariannensis雜交種。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所自20 世紀(jì)90 年代開始面包果試種和種質(zhì)資源保存相關(guān)研究，目前已收集保存面包果種質(zhì)資源50 余份，其中無核型面包果30 余份。根據(jù)有無種子將面包果分為無核型面包果和有核型面包果，有核型面包果通稱硬面包果，硬面包果包括硬面包果Ⅰ型和硬面包果Ⅱ型[7]。

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）具有共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好、種屬間有良好的通用性、技術(shù)難度低等特點(diǎn)。已廣泛應(yīng)用于基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建、指紋圖分析、品種鑒定和遺傳多樣性評價(jià)等[8-11]。國外學(xué)者有一些關(guān)于面包果分子標(biāo)記開發(fā)和遺傳多樣性相關(guān)研究報(bào)道。ZEREGA 等[12]利用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism， AFLP）對200 多個(gè)面包果品種之間的關(guān)系進(jìn)行研究，繪制了DNA 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)太平洋島嶼的面包果資源遺傳多樣性最豐富。WITHERUP 等[13]從面包果基因組文庫中分離出25 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并在A. altilis、A. camansi、A. mariannensis 和A. altilis×A. mariannensis 共354 份樣本中檢測出等位基因的平均數(shù)為2～9。ZEREGA 等[14]利用19 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對225 份面包果種質(zhì)資源進(jìn)行了評估，等位位點(diǎn)數(shù)為2～24 個(gè)，平均11.63 個(gè)。GARDNER 等[15]從面包果A. camansi 和A. altilis 的轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出15 個(gè)葉綠體SSR 標(biāo)記，在A. odoratissimus、A. altilis、A. camansi 和A. altilis×A. mariannensis中均能擴(kuò)增，所有標(biāo)記在A. camansi 中均具有多態(tài)性。BELLIS 等[16]從面包果基因組DNA 文庫中共獲得47 607 個(gè)簡單序列重復(fù)位點(diǎn)，并開發(fā)了50個(gè)SSR 標(biāo)記，所有的位點(diǎn)在A. altilis 均具有多態(tài)性，每個(gè)標(biāo)記的等位位點(diǎn)數(shù)為2～19。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史，對種質(zhì)資源的收集、保存、評價(jià)和利用具有十分重要的意義[17-19]。

目前，暫未見我國面包果資源遺傳多樣性的研究報(bào)道。本研究基于前人已開發(fā)的SSR 分子標(biāo)記對我國收集的不同生態(tài)區(qū)域面包果種質(zhì)資源開展系統(tǒng)的遺傳多樣性分析，明確資源間遺傳相似系數(shù)，揭示其親緣關(guān)系，為品種選育和利用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為保存于木本糧食種質(zhì)資源分庫的30 份面包果資源，采集健康嫩葉，用密封袋密封，帶回實(shí)驗(yàn)室置于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 按照OMEGA DNA 試劑盒（HP Plant DNA Kit）說明書提取基因組DNA，并用微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000c）檢測其濃度。30 份面包果種質(zhì)資源信息見表1。

1.2.2 引物的合成與篩選 查閱面包果引物開發(fā)、遺傳多樣性研究相關(guān)英文文獻(xiàn)，參考BELLIS等[16]開發(fā)的50 對SSR 引物（mAaCIR ） 和WITHERUP 等[13]開發(fā)的25 對SSR 引物（MAA），共75 對。引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR 擴(kuò)增采用20 μL 體系：DNA 模板2 μL，10×Buffer2 μL，正反向引物各0.4 μL，dNTPs 0.4 μL，Taq酶0.3 μL，ddH2O 補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50～62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；12 ℃ 30 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測方法參照吳剛等[20]的方法，用8%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，在150 U、2500 mA、500 W條件下電泳40～60 min。電泳結(jié)束后立即進(jìn)行銀染顯影，將膠板放入硝酸銀染液（1 g 硝酸銀+2 mL甲醛+1 L ddH2O）中銀染25 min，膠板銀染后再放入氫氧化鈉顯影液（15 g 氫氧化鈉+5 mL 甲醛+1L ddH2O）中顯影至出現(xiàn)清晰條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴(kuò)增條帶的位置，有條帶的讀為“1”，無條帶的讀為“0”。構(gòu)建（0，1）矩陣表。采用NTSYSpc2.1 軟件對30 份面包果資源進(jìn)行聚類、主成分、遺傳相似系數(shù)分析，以非加權(quán)組平均法（unweightedpair-group method with arithmeticmeans， UPGMA）進(jìn)行聚類分析，繪制系統(tǒng)聚類圖，并繪制三維散點(diǎn)圖。同時(shí)計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphic informationcontent， PIC）值，PIC 值等于1 減去所有等位基因頻率的平方的總和，即

Pi為等位基因頻率，n 為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記篩選

選取5 份代表性面包果資源（XYS1、XYS6、KML、LX、STH）用于引物篩選（部分引物篩選見圖1）。從75 對引物中篩選出33 對（表2）擴(kuò)增條帶清晰、具有多態(tài)性的引物用于供試面包果資源群體擴(kuò)增。圖2 為選取的代表性SSR 引物MAA251 和mAaCIR141 的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 SSR 標(biāo)記多態(tài)性分析

篩選出的33 對SSR 引物在30 份面包果資源中共檢測出199 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均為6.030 個(gè)。

其中引物MAA140 和mAaCIR152 的多態(tài)性位點(diǎn)最多，為11 個(gè)；引物mAaCIR130 的多態(tài)性位點(diǎn)最少，為1 個(gè)。除MAA54b、MAA3、mAaCIR90、mAaCIR113、mAaCIR130 外，其他引物擴(kuò)增條帶的多態(tài)性比率均為100%。SSR 引物的PIC 值在0.623～0.940 之間，平均為0.865。PIC 值在0.9 及以上的引物有11 對，占比為33.33%（表3）。SSR標(biāo)記MAA54b、MAA178b、mAaCIR75、mAaCIR134、mAaCIR147、mAaCIR152、mAaCIR89 和mAaCIR90 在不同類型面包果資源中具有特異性擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增效果較好，具有較高的多態(tài)性。

2.3 遺傳相似系數(shù)分析

由表4 可知，30 份面包果資源的遺傳相似系數(shù)在0.517～0.951 之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.685。根據(jù)遺傳相似系數(shù)可以看出不同種質(zhì)資源之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本研究所有供試種質(zhì)資源之間均存在不同程度的遺傳差異。STH 與YN的遺傳相似系數(shù)最小（0.517），表明遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳差異最大；XYS3 與XYS2 的遺傳相似系數(shù)最大（0.951），表明遺傳距離最近，遺傳差異最小。同一種質(zhì)資源內(nèi)個(gè)體間也存在不同程度的遺傳差異，其中ZZP 個(gè)體間差異最大，個(gè)體間平均遺傳相似系數(shù)為0.626，最小遺傳相似系數(shù)為0.532， 最大遺傳相似系數(shù)為0.873； 而XYS1-3 個(gè)體間差異最小，平均遺傳相似系數(shù)為0.723，最小遺傳系數(shù)為0.585，最大遺傳相似系數(shù)為0.922。

2.4 聚類分析

基于33 對多態(tài)性標(biāo)記，用NTSYS 軟件對30份面包果資源進(jìn)行聚類，同時(shí)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA），繪制三維散點(diǎn)圖。遺傳相似系數(shù)聚類分析顯示（圖3），在遺傳相似系數(shù)為0.713 時(shí)，硬面包果Ⅰ型（ZZP、LX、STH、HJ5）和XBL 聚為一類；無核型面包果SLLK、XYS2、XYS3、XYS5、XYS6 和YN聚為一類；硬面包果Ⅱ型（SLM2、YDNXY1、G1、G2）聚為一類；來源于南太平洋島國的硬面包果Ⅱ型（W1、W3、SMY、8-4、8-3、5-5、5-6）聚為一類；無核型面包果（XYS1、XYS1-3、YBG、KML、SJBE、YDNXY2）和FJ 為1 個(gè)小組。面包果PCA 三維散點(diǎn)圖（圖4）將面包果資源分為5 個(gè)組，與聚類圖一致。三維圖能較好地將園林栽培硬面包果Ⅰ型（ZZP、LX、STH、HJ5）和XBL 與食用價(jià)值較大的無核型面包果和硬面包果Ⅱ型區(qū)分開。

3 討論

面包果起源于南太平洋島國，它的傳播歷程與南太平洋地區(qū)人類的遷徙歷史密切相關(guān)。種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是保護(hù)、研究和創(chuàng)新利用面包果的重要步驟。WITHERUP 等[13]利用從面包果基因組文庫中開發(fā)的25 對MAA 引物評估了354份樣本， 不同種中檢測到平均等位位點(diǎn)數(shù)為1.90～7.86，平均觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.15～0.55 和0.20～0.62。ZEREGA等[14]利用19 對MAA 引物評估225 份面包果種質(zhì)資源，平均等位位點(diǎn)數(shù)11.632 個(gè)，PIC 值為0.627，He 為0.441。GARDNER 等[15]從面包果葉綠體中開發(fā)出15 個(gè)SSR 標(biāo)記，不同種的平均等位位點(diǎn)數(shù)為2.200～2.533，無偏單倍體多樣性為0.147～0.602。BELLIS 等[16]從面包果基因組DNA 文庫中開發(fā)了50 個(gè)SSR 標(biāo)記，PIC 值為0.680。本研究采用33 對SSR 引物對30 份面包果資源進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測出205 個(gè)等位位點(diǎn)，平均為6.212 個(gè)，PIC 變化范圍為0.623～0.940，平均為0.680，說明選用的33 對引物可較好地鑒定面包果種質(zhì)資源的遺傳差異。遺傳多樣性可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史，是物種適應(yīng)新環(huán)境的基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平越高，物種對新環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[19， 21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜屬包含70 多個(gè)種，起源于南太平洋島國，香菠蘿（A. odoratisimus）與A. altilis，A. camansi 和A. mariannensis 屬于同一個(gè)亞屬，具有較近的親緣關(guān)系[22]，本研究中XBL 和硬面包果Ⅰ型（ZZP、LX、STH、HJ5）聚為一類，說明與硬面包果Ⅱ型和無核型面包相比，A. odoratissimus與硬面包Ⅰ型具有較近的親緣關(guān)系。ZEREGA等[12]利用AFLP 標(biāo)記繪制了256 份面包果資源的指紋圖譜，認(rèn)為面包果至少有2 個(gè)起源中心，大多數(shù)美拉尼面包果類型和原產(chǎn)地西亞和波利尼西亞面包果品種是由A. camansi 經(jīng)過多代無性繁殖和選育而來，而大多數(shù)密克羅尼西亞面包果品種由來源于A. camansi 的面包果和A. mariannensis雜交而來。面包果整個(gè)馴化過程中代表性的資源分別是：2 個(gè)野生祖先種A. camansi 和A. mariannensis，有核二倍體A. altilis，無核三倍體A.altilis，早期A. altilis×A. mariannensis 雜交種，高度馴化A. altilis×A. mariannensis 雜交種[23-25]。A.camansi、A. mariannensis、A. altilis（2n）和早期A.altilis×A.mariannensis 雜交種屬于有核型面包果，而A. altilis（3n）和馴化A.altilis×A. mariannensis雜交種（3n）是無核型面包果[6]，因此，面包果資源的聚類與地理分布和引種來源地有關(guān)。本研究中面包果樣本引種于多個(gè)國家，樣本來源較豐富，能代表我國面包果現(xiàn)有的種植情況和群體結(jié)構(gòu)，聚類結(jié)果可將大多數(shù)資源根據(jù)區(qū)分開。其中XYS1-3、YBG、XYS1、XYS2、XYS3、XYS5 和XYS6 等7 份無核型面包果是20 世紀(jì)50年代由越南、泰國、馬來西亞和印度尼西亞等東南亞歸國華僑攜帶引進(jìn)。聚類結(jié)果顯示XYS2、XYS3、XYS5 和XYS6 與SLLK 和YN 聚為一類，因此推測這4 份資源可能引種于越南；XYS1-3、YBG 和XYS1 與KML、SJBE 和YDNXY2 聚為一類，結(jié)合我國面包果引種歷史，推測XYS1-3、YBG 和XYS1 可能引種于印度尼西亞。FJ 與XYS1-3、YBG、XYS1、KML、SJBE 和YDNXY2等無核型面包果聚為一類，且與KML 的遺傳相似系數(shù)為0.932，結(jié)合本研究聚類結(jié)果與類型有關(guān)，因此，推測FJ 可能是無核型面包果。

JONES 等[6]使用57 個(gè)形態(tài)描述符描述了221份面包果資源，通過數(shù)量性狀描述可以將資源分為A. camansi、A. mariannensis、A. altilis（2n），A. altilis（3n），A. altilis×A. mariannensis（2n）和A. altilis×A. mariannensis（3n）6 類，也可以將資源分為來自美拉尼西亞、西波利尼西亞、東波利尼西亞和密克羅尼西亞4 個(gè)地方，置信水平均在0.95。ZEREGA 等[12]利用SSR 標(biāo)記也可將資源依據(jù)類型和區(qū)域分類。我國目前還沒有面包果資源形態(tài)性狀描述的系統(tǒng)研究，因此，為更系統(tǒng)全面地對我國面包果資源分類及親緣關(guān)系鑒定，后續(xù)需要多種表型性狀結(jié)合分子標(biāo)記進(jìn)一步探討。

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