鄭伊琦，張安強，張小軍，梅光明，何鵬飛,

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021；3.浙江工業(yè)大學食品科學與工程學院，浙江杭州 310014；4.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021）

豬苓（Polyporus umbellatus）為真菌界，擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌目（Polyporales），多孔菌科、多孔菌屬[1]，別名豕苓、豬茯苓等，在我國分布范圍較廣，主要產自河北、山西、陜西。豬苓菌核具有利水滲濕功效[2]，作為藥物使用在我國已有悠久歷史[2]。豬苓中含有包括甾體類及多糖類等化合物在內的多種營養(yǎng)成分，其多糖含量依產地不同而在4.12～31.18 mg/g 范圍內[3]。豬苓多糖與其許多生理功能具有緊密聯系，具有良好的免疫增強[4-5]、抗腫瘤[6]、肝臟保護[7]、抗輻射[8]等生理功能。Gao 等[9]還發(fā)現豬苓多糖-硒納米粒子具有抗增殖能力且低細胞毒性，可作為一種膳食補充劑運用于癌癥化學預防中。

由于真菌分布范圍極其廣泛，已被作為活性多糖的重要來源進行開發(fā)。真菌多糖的提取方法有很多，目前除了傳統(tǒng)的熱水浸提法外，還有酶法提取、超聲輔助熱水提取法、微波輔助熱水提取法等方法[10]。傳統(tǒng)提取法具有耗時長、得率低、能耗大等缺點，超聲輔助熱水提取法是利用高頻的超聲波產生高速、強烈的空化效應和擾動效應等特點，簡化提取過程，大幅縮短提取時間，提高提取效率，不對提取物、活性產生影響，且操作方法簡單成本較低，具有高重現性被廣泛應用于各類有效成分的提取[11]。提取溫度、提取時間、液料比和超聲功率是超聲輔助提取過程中的重要參數，也是多糖提取工藝優(yōu)化中極受關注的變量參數[12-13]。響應面法（response surface methodology，RSM）是一種可用于優(yōu)化工藝條件的有效方法，該方法可以確定工藝運行過程中不同影響因素及各因素之間的相互作用對響應值的影響。通過對數學方法和統(tǒng)計方法的結合，擬合得到一個完整的二次多項式模型，用以呈現更優(yōu)秀的實驗設計和結果表達[14]。對多糖進行提取時，除了提高產量外，還應考慮其生物活性。Anraku 等[15]研究發(fā)現，抗氧化劑可有效延緩脂質氧化、抑制癌細胞增殖以及自由基產生，抗氧化活性是生物活性的基礎。熱水浸提法仍是目前豬苓菌核多糖的主要提取方法，該方法具有耗時長、提取效率低等不足。將超聲輔助提取法應用于豬苓菌核多糖的提取，并應用響應面優(yōu)化法確定不同參數對多糖得率的影響作用，建立最優(yōu)提取工藝，提高豬苓菌核多糖得率及提取效率，對于豬苓菌核多糖開發(fā)利用具有極其重要的意義。

故本文采用單因素實驗結合響應面法探究了豬苓菌核多糖超聲輔助熱水提取過程中提取溫度、提取時間、液料比和超聲功率對多糖得率的影響作用并確定最優(yōu)提取工藝條件，同時通過DPPH 自由基清除試驗和總還原力試驗評估最優(yōu)工藝條件下獲得的豬苓菌核多糖的體外抗氧化活性，為豬苓菌核活性多糖的高效制備及進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥的豬苓菌核 產自陜西省佛坪縣；DPPH、抗壞血酸 美國Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型） 上海碧云天生物技術有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、3,5-二硝基水楊酸（DNS）、酒石酸鉀鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

DJ-04 中藥粉碎機、SHB-Ⅱ-A 循環(huán)水真空泵上海淀久儀器有限公司；RE2000 旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；V-1800PC 紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬苓菌核預處理 干燥豬苓菌核使用粉碎機粉碎后，加入8 倍質量的工業(yè)酒精浸泡過夜，重復3 次，以去除其中小分子糖、色素和脂溶性成分等物質[16]。酒精浸泡后的豬苓菌核粉末經過濾、干燥后，置于陰涼通風處備用。

1.2.2 豬苓菌核多糖的超聲輔助提取 準確稱取10 g經預處理后的豬苓菌核粉末，按照液料比20 mL/g加入蒸餾水，置于超聲功率300 W、提取溫度70 ℃的條件下超聲提取90 min。提取液經7000 r/min 離心10 min 和過濾后減壓濃縮，用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 單因素實驗 在改變其中一個影響因素而其余因素不變的情況下，分別考察提取溫度水平（50、60、70、80、90 和100 ℃）、超聲功率水平（120、180、240、300 和360 W）、液料比水平（10、15、20、25 和30 mL/g）和提取時間水平（25、40、55、70 和90 min）四個影響因素對豬苓菌核多糖得率的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，采用四因素三水平的Box-Behnken 試驗設計方案（BBD）對豬苓菌核多糖提取工藝參數進行響應面優(yōu)化分析，考察因素及水平設計見表1，試驗設計方案見表2。在響應面優(yōu)化設計試驗結果基礎上進行驗證實驗，比較預測多糖得率與實際多糖得率。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Independent variables and their levels for the response surface design

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and result Box-Behnken

1.2.5 豬苓菌核粗多糖分離工藝 按照最優(yōu)工藝提取豬苓菌核多糖，提取液采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮10 倍后，加入工業(yè)酒精使酒精濃度依次達到30%vol、60%vol、80%vol，靜置過夜后離心（7000 r/min，10 min），沉淀分別命名為粗多糖PUPF-30、PUPF60、PUPF80。

1.2.6 總糖含量測定 使用苯酚-硫酸法測定總糖含量[17]，具體步驟為取1.00 mL 多糖溶液于試管中，補加水至2.00 mL，加入5 mL 6%苯酚溶液，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫后，測定490 nm 處吸光度值?？偺呛恳詿o水葡萄糖計，濃度范圍20～120 μg/mL的回歸方程為y=0.0068x-0.0025，決定系數R2=0.998。

1.2.7 還原糖含量測定 還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[17]，簡要步驟如下：取1.00 mL多糖溶液于試管中，加入3.00 mL 水楊酸試劑，置于沸水浴中反應5 min 后，冷卻至室溫并用水定容至25.0 mL，測定520 nm 處吸光值。還原糖含量以無水葡萄糖計，濃度范圍0.2～1.0 mg/mL 的回歸方程為y=1.002x-0.0355，決定系數R2=0.999。

1.2.8 豬苓多糖得率測定 豬苓菌核多糖提取液經適當稀釋后，分別測定總糖和還原糖含量，得率按下式計算：

式中：Ct表示稀釋液中總糖濃度，mg/mL；Nt表示總糖測定稀釋倍數；Cr表示稀釋液中還原糖濃度，mg/mL；Nr表示還原糖測定稀釋倍數；V 表示提取液體積，mL；M 表示原料質量，g。

1.2.9 蛋白質含量測定 按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明，取25 μL 樣品溶液與200 μL BCA 工作液混勻，37 ℃反應30 min，測定562 nm 處吸光值。以牛血清白蛋白為標準品繪制曲線，回歸方程y=0.00128x+0.04034，決定系數R2=0.999。

1.2.10 紫外全波長掃描 豬苓菌核粗多糖組分用蒸餾水配制成2 mg/mL 溶液，置于石英比色皿中，采用紫外分光光譜儀在200～400 nm 波長范圍內掃描。

1.2.11 抗氧化活性測定

1.2.11.1 DPPH 自由基清除活性 粗多糖組分用蒸餾水稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL 的溶液，移取2.00 mL 溶液與等體積的0.2 mmol/L 新鮮配制的DPPH 甲醇溶液混勻，避光孵育30 min后，在517 nm 處測量吸光度值。實驗以抗壞血酸為陽性對照[18]。清除活性計算公式如下：

式中：Ai表示樣品吸光度值；Aj表示樣品本底吸光度值；A0表示空白對照吸光度值。

1.2.11.2 總還原力測定 向各試管中加入不同濃度的樣品溶液，加入等體積0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和1%（w/v）鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴20 min后加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后離心取2.5 mL 上清液加入等體積蒸餾水和0.5 mL 氯化鐵溶液，在波長700 nm 處測量吸光度值[19]。

1.3 數據處理

所有實驗均平行3 次，結果以平均值±標準偏差（n=3）表示。采用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，顯著水平P＜0.05。試驗中圖形的繪制使用OriginPro 2015，使用Design-Expert 軟件進行響應面法優(yōu)化分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

在保證其余因素不變的情況下，提取溫度、超聲功率、液料比和提取時間對豬苓菌核多糖得率的影響如圖1 所示。在液料比20 mL/g、超聲功率300 W、提取時間90 min 條件下，隨著提取溫度從50 ℃升到100 ℃，豬苓菌核多糖得率先顯著升高（P＜0.05），70 ℃后則無明顯變化（圖1a）。地木耳多糖超聲輔助提取中也有相似的得率隨溫度變化趨勢[20]，其原因可能是溫度升高有助于提高多糖的溶解度及傳質效率，但高溫下蒸氣壓升高而形成的氣穴緩沖作用減弱了超聲空化作用[21-22]。因此，選擇提取溫度為60、70、80 ℃進行后續(xù)響應面試驗。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single-factor experiments

超聲功率與空化氣泡數量、崩塌能量及空化過程經濟型等密切相關，是聲空化作用中的重要參數[23]。圖1b 顯示了液料比20 mL/g、提取溫度70 ℃、提取時間90 min 條件下，豬苓菌核多糖得率在120～300 W范圍內與超聲功率顯著正相關（P＜0.05），但在300～360 W 范圍內則為負相關，這可能是由于超聲功率超過了空化作用的臨界功率值，空化氣泡不能充分崩塌而導致的[24]。此外，超聲功率過大而使多糖出現部分降解，也是造成多糖得率下降的另一可能原因[25]。因此，選擇超聲功率為240、300 和360 W 三個水平進行后續(xù)響應面試驗。

在提取溫度70 ℃、超聲功率300 W、提取時間90 min 條件下，液料比在10～30 mL/g 范圍內對豬苓菌核多糖得率的影響如圖1c 所示，隨著液料比的增大，多糖得率先顯著升高（P＜0.05）而后緩慢降低（P＞0.05），液料比為20 mL/g 時的多糖得率最大。液料比增大，固相和液相間多糖的質量濃度差增加，從而使傳質動力增加，多糖得率增大；但溶劑增多也造成了單位體積內的超聲能量降低，而使得多糖得率降低[26]。選擇液料比為15、20 和25 mL/g 進行后續(xù)響應面試驗。

在液料比20 mL/g、提取溫度70 ℃、超聲功率300 W 條件下，提取時間在25～90 min 范圍內對豬苓菌核多糖得率的影響如圖1d 所示。25～55 min 內多糖得率隨提取時間延長顯著升高（P＜0.05），55～90 min 內多糖得率則先緩慢升高后緩慢下降。延長提取時間有助于多糖在溶劑中的溶出和擴散，但時間過長則可能使多糖發(fā)生降解而影響多糖得率[13]。綜上，選擇提取時間為40、55 和70 min 進行響應面試驗。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面回歸模型及統(tǒng)計分析 對提取溫度（X1）、超聲功率（X2）、液料比（X3）及提取時間（X4）進行BBD 試驗設計，實驗結果見表2。隨著因子水平的組合變化，多糖得率在2.05%～2.44%范圍內波動。采用Design Expert 軟件對實驗結果進行擬合分析，得到完全二次多項式回歸模型如下：

回歸模型進一步應用方差分析及顯著性檢驗進行評估，結果見表3。F值和P值用于顯著性評估，F值越高，P值越低，顯著性則越高[27]。從表3 可知，模型F值為144.18，P＜0.0001，表明回歸模型極其顯著，模型很好地解釋了多糖得率中的變異；失擬項F=0.8500，P＞0.05，說明了模型失擬和純誤差造成的得率變異之間差異不顯著，模型預測值和實驗值吻合良好[28]。決定系數R2=0.9931，校正決定系數=0.9862，預測決定系數=0.9696，說明該回歸模型選擇合適，具有良好的擬合優(yōu)度和預測能力。較小的變異系數CV（0.6535%）說明結果準確性和可靠性較高。Adeq Precision 指示了模型信噪比，其值大于4 則表明模型抗干擾能力良好[29]。該模型Adeq Precision=35.7917，說明其在自變量范圍內是準確可靠的。

表3 二次模型的方差分析表Table 3 ANOVA table for quadratic model

2.2.2 響應面模型充分性診斷 模型充分性診斷可判斷近似模型是否會產生不良或誤導性的結果[30]。預測值與實際值關系可用于評估模型適用性，數據點分布近似直線則表明模型預測得率和實際得率之間高度一致。標準化殘差的正態(tài)概率分布近似為一條直線，證明了模型標準化殘差符合正態(tài)分布。殘差與實驗運行順序二者關系可用于驗證殘差的序列相關性，殘差圍繞中心線隨機分布，表明彼此相近的殘差之間無相關性。綜上，本文所采用的響應面模型對豬苓菌核多糖得率的描述是充分的。

2.2.3 響應面因素分析 由方差分析表（表3）中各項回歸系數的F值和P值可知，所有線性系數和二次項系數均極為顯著，交互項中X1X2、X1X3、X2X3、X3X4的系數也是顯著的，說明提取溫度和提取時間之間以及超聲功率和提取時間之間無顯著交互作用，而其余因素間的交互作用對多糖得率有顯著影響。由X1X2的系數及F值可知，交互項中提取溫度和超聲功率的交互作用對多糖得率影響最大。根據回歸方程中各項系數符號可知，多糖得率與線性項正相關，而與交互項及二次項均為負相關，因此可推斷出豬苓菌核多糖得率可能存在最大值。

響應曲面圖和等高線圖可直觀生動地顯示不同因素對因變量的影響作用，等高線接近橢圓則說明兩因素的交互作用顯著；響應曲面圖中曲線越陡則該因素影響越大[31]。圖2a～圖2f 顯示了隨著提取溫度、超聲功率、液料比和提取時間的增大，豬苓菌核多糖得率均先上升后下降的變化趨勢，響應曲面中曲線變化趨勢表明不同因素對多糖得率的影響作用由大到小分別為：提取時間、液料比、提取溫度、超聲功率。橢圓形等高線圖（圖2a、圖2b、圖2d、圖2f）說明了提取溫度和超聲功率、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、液料比和提取時間之間交互作用顯著；近似圓形的等高線圖（圖2c、圖2e）則表明提取溫度和提取時間、超聲功率和提取時間之間的交互作用對多糖得率無顯著影響。

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots of the effects of interactions among factors on polysaccharide yield

由圖2a～圖2f 可直觀地看到在響應面優(yōu)化的參數范圍內，豬苓菌核多糖得率可取得最大值。利用回歸預測模型計算可知豬苓菌核多糖超聲輔助提取最佳工藝條件為提取溫度72.3 ℃、超聲功率304.2 W、提取時間為63.6 min、液料比為21.7 mL/g，最大得率為2.48%。

2.2.4 響應面優(yōu)化試驗結果驗證 參照響應面最佳提取工藝，并根據實際情況調整工藝條件為提取溫度72.0 ℃、提取功率300 W、提取時間65 min 和液料比22 mL/g，在此條件下進行3 次平行實驗得到豬苓菌核多糖得率為2.47%±0.03%，與回歸模型預測的多糖得率最大值相比無顯著差異，說明應用響應面模型優(yōu)化多糖超聲輔助提取工藝條件的結果可靠。

2.3 豬苓粗多糖理化特性分析

按照最優(yōu)工藝條件提取后，通過酒精沉淀分級得到3 個豬苓菌核粗多糖組分PUPF30、PUPF60、PUPF80，它們的紫外全波長掃描結果如圖3 所示。3 個組分的最大紫外吸收均在200～210 nm，表明了多糖為它們的主要成分；同時260～280 nm 范圍內的少量吸收則說明了它們也含有少量蛋白和核酸。對3 個粗多糖組分的總糖、還原糖和蛋白含量進一步進行測定，結果如表4 所示。多糖含量由高到低為PUPF60、PUPF80、PUPF30，對應含量分別為58.60%、50.35%、39.99%；蛋白含量由低到高為PUPF60、PUPF80、PUPF30，對應含量分別為14.42%、25.54%、25.80%。PUPF60 在三個組分中是多糖含量最高且蛋白含量最低的組分。

圖3 豬苓菌核粗多糖紫外全波長掃描圖Fig.3 UV scanning spectra of crude polysaccharide fractions form crude polysaccharide from Polyporus umbellatus sclerotium

表4 豬苓菌核粗多糖組分糖含量和蛋白含量Table 4 Glucose content and protein content of crude polysaccharide components in sclerotium of Polyporus umbellatus

2.4 豬苓菌核多糖體外抗氧化活性

2.4.1 豬苓菌核多糖的DPPH 自由基清除活性DPPH 作為一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其在517 nm處的最大吸收隨著自由基清除劑的加入而下降，被廣泛用于自由基消除能力的體外評估[32-33]。豬苓菌核粗多糖組分的DPPH 自由基清除活性如圖4 所示。在實驗濃度范圍內，三個粗多糖組分均呈現出一定的DPPH 自由基清除活性，自由基清除能力隨多糖濃度增高而增高。PUPF60 和PUPF80 的自由基清除活性明顯優(yōu)于PUPF30，濃度4 mg/mL 時，PUPF30的清除率為50.63%，而PUPF60 和PUPF80 的清除率分別為83.95%和87.48%，接近同等濃度下VC的清除率。

圖4 豬苓菌核粗多糖組分對DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effects of crude polysaccharide components from Polyporus umbellatus sclerotium on DPPH radical clearance rate

2.4.2 豬苓菌核粗多糖組分的總還原能力測試結果多糖的總還原力與抗氧化活性呈正相關，多糖作為一種電子供體能與自由基反應生成穩(wěn)定產物，阻止過氧化物生成[34]。豬苓菌核多糖能使鐵氰化物復合物中Fe3+轉變成相應的Fe2+，還原力越強，對應的吸光度值越高[35]。如圖5，在0.1～4.0 mg/mL 的實驗濃度范圍內，隨著豬苓菌核多糖濃度增大，吸光度值也隨之增大。三個粗多糖組分的總還原力大小比較結果為PUPF80＞PUPF60＞PUPF30。

圖5 豬苓菌核粗多糖組分對體系總還原力的影響Fig.5 Effect of crude polysaccharide components from Polyporus umbellatus sclerotium on total reducing power of the system

活性氧（ROS），包括過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基等，是引起食品、藥品氧化劣變以及多項機體失調的重要影響因素，而抗氧化劑是有效降低這些活性氧造成的不利效應的重要物質。合成抗氧化劑潛在的毒副效應近年來日益受到關注，因此天然抗氧化劑的開發(fā)研究正逐漸加速。多糖是天然抗氧化劑的重要來源，如鐵皮石斛多糖[36]和祁白芷多糖[37]的抗氧化活性均已報道。天然活性多糖可能的抗氧化機制是通過從穩(wěn)定的化合物中轉移氫原子或單電子來終止鏈式反應，同時多糖的抗氧化與其化學組成、分子量、構象等結構特性密切相關[38-39]?？寡趸Y果顯示豬苓菌核經超聲輔助提取后，制備得到的三個組分均具有一定的抗氧化活性，同時PUPF60 和PUPF80 在DPPH 自由基清除能力及總還原能力測試中的抗氧化性能優(yōu)于PUPF30，有作為候選天然抗氧化劑而進一步研究利用的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結論

在單因素實驗的基礎上，豬苓菌核多糖超聲輔助提取的響應面回歸模型顯著，失擬項不顯著，對多糖得率的描述充分，適于多糖得率的優(yōu)化預測分析。根據實際情況調整響應面優(yōu)化最佳提取工藝條件為提取溫度72.0 ℃、提取功率300 W、提取時間65 min和液料比22 mL/g，在此條件下進行3 次平行實驗得到豬苓菌核多糖得率為2.47%±0.03%，與回歸模型預測的豬苓菌核多糖最大得率結果無顯著差異?；貧w模型顯著性分析表明豬苓菌核多糖得率不僅與四個提取參數顯著相關，也與提取溫度和超聲功率、提取溫度和液料比、超聲功率和液料比、液料比和提取時間之間的交互作用顯著相關。超聲輔助提取的豬苓菌核多糖經分級醇沉制備得到PUPF30、PUPF60、PUPF80，多糖含量分別為39.99%、58.60%、50.35%，蛋白含量分別為25.80%、14.42%、25.54%。抗氧化測試結果表明豬苓菌核多糖組分在DPPH 自由基清除能力和還原力均呈一定的劑量依賴性，但PUPF80和PUPF60 的抗氧化能力明顯優(yōu)于PUPF30。綜上，響應面應用于豬苓菌核多糖超聲輔助提取工藝優(yōu)化是合適的，且優(yōu)化后的提取工藝可用于豬苓菌核活性多糖的有效提取制備，為豬苓菌核多糖的進一步開發(fā)利用奠定了基礎。