張瑞家，吳培文，熊佳欣，朱本忠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京海淀 100083）

我國(guó)是世界最大的葡萄生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，2020 年產(chǎn)量達(dá)到1431 萬(wàn)噸[1]，其中鮮食葡萄占我國(guó)葡萄總產(chǎn)量的80%左右[2]。但是，由于鮮食葡萄含水量高、易染真菌[3]，在貯藏過(guò)程中容易發(fā)生腐爛、干梗和褐變等問(wèn)題[4]。SO2處理是一種典型的葡萄化學(xué)保鮮方式，在葡萄貯藏過(guò)程中對(duì)致病真菌的生長(zhǎng)繁殖具有強(qiáng)烈的抑制作用，能夠減少葡萄采后灰霉菌、交鏈孢霉菌和鐮刀菌等引起的腐爛和軟化[5]，并且可以降低葡萄自身呼吸強(qiáng)度來(lái)減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗[6]。但SO2在使用過(guò)程中的釋放速度和釋放量不易控制[7]，并且不同品種葡萄對(duì)SO2耐受程度有非常大差異，使得SO2在采后貯藏使用中容易發(fā)生過(guò)量問(wèn)題而導(dǎo)致果粒脫落[8]，從而影響到鮮食葡萄的商品銷售，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。本文綜述了SO2對(duì)葡萄氣孔開度、離區(qū)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁降解酶活性、激素含量和活性氧水平等方面的影響，總結(jié)了目前關(guān)于過(guò)量SO2影響葡萄果實(shí)脫落的潛在機(jī)制，為精準(zhǔn)使用和改進(jìn)SO2保鮮方式提供理論支撐。

1 SO2 保鮮方式的應(yīng)用和局限

目前在物理方法、化學(xué)方法、生物方法以及多法聯(lián)用等方面都出現(xiàn)了一些新型葡萄貯藏保鮮方法[9]，但是SO2處理仍然是最經(jīng)濟(jì)、高效的保鮮方式[10]。SO2保鮮方式一般分為熏蒸法和緩釋法。熏蒸法主要是在密閉空間內(nèi)直接燃燒硫磺產(chǎn)生SO2氣體，對(duì)罩上塑料薄膜成垛的葡萄熏蒸20～30 min，隨后進(jìn)行通風(fēng)排出SO2氣體，在之后貯藏過(guò)程中每間隔7～10 d 再熏蒸30 min[11]；緩釋法主要使用亞硫酸鹽結(jié)合粘結(jié)劑、助流劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑和功能助劑[7]，采用不同包裝工藝制成片劑、粉劑和釋放紙[12]。緩釋法中SO2釋放分為兩個(gè)階段：第一階段在葡萄包裝1～2 d 內(nèi)釋放較高濃度SO2進(jìn)行表面殺菌；第二個(gè)階段為緩慢釋放，能在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中抑制致病菌生長(zhǎng)繁殖[13]。熏蒸法和緩釋法都存在釋放不穩(wěn)定的情況，容易造成短時(shí)或局部SO2過(guò)量，引起葡萄落粒[7]。針對(duì)適量SO2能夠維持良好的果實(shí)品質(zhì)和過(guò)量SO2會(huì)造成嚴(yán)重生理傷害的問(wèn)題，確保貯藏過(guò)程中保持合適的SO2濃度一直是研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)階段SO2保鮮方式的研究主要集中在調(diào)整不同的保鮮劑量、改善復(fù)合膜材料以及結(jié)合其他保鮮方式，去實(shí)現(xiàn)SO2長(zhǎng)效、穩(wěn)定、適量的釋放，最終達(dá)到減少葡萄落粒。

目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定鮮水果中SO2殘留量不大于10 mg/kg，我國(guó)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定鮮水果SO2殘留量標(biāo)準(zhǔn)是不大于50 mg/kg[14]。許多研究表明，不同品種、不同成熟度的葡萄對(duì)SO2敏感度不同[15-17]，容易產(chǎn)生不同程度的過(guò)量問(wèn)題。葡萄中過(guò)量的SO2殘留不僅會(huì)導(dǎo)致落粒、漂白[18]等品質(zhì)問(wèn)題，還會(huì)對(duì)人體健康造成危害。SO2保鮮劑產(chǎn)品對(duì)不同品種葡萄的適用性可能會(huì)產(chǎn)生差異，針對(duì)不同品種、產(chǎn)地的葡萄通常需要調(diào)整SO2保鮮劑的釋放效果來(lái)滿足實(shí)際生產(chǎn)中的貯藏保鮮需求，例如在0 ℃下‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄使用SO2緩釋劑（CT 系列）的落粒率始終低于對(duì)照組[19]，而在25 ℃和RH 60%下使用CT 化學(xué)保鮮劑處理‘巨峰’葡萄模擬短途運(yùn)輸和短期貯藏，從第3 d 開始SO2組落粒率卻顯著高于對(duì)照組[15]。另外，處于過(guò)量SO2氣體貯藏環(huán)境中的‘巨峰’葡萄出現(xiàn)落粒率增加的情況，而1.5%殼聚糖涂膜處理能抑制SO2引起的葡萄采后落粒[8]。因此，不同條件下SO2保鮮中存在的落粒問(wèn)題成為葡萄保鮮研究中關(guān)注的重點(diǎn)。

2 SO2 引起葡萄落粒的機(jī)制

落粒是指葡萄果粒與果穗分離而產(chǎn)生的一種脫落現(xiàn)象[20]，是一個(gè)發(fā)生在果梗離區(qū)（Abscissionzone，AZ）且高度調(diào)控的生理過(guò)程，與組織代謝失調(diào)[21]和細(xì)胞衰老[22]的進(jìn)程密切相關(guān)，受到環(huán)境和自身內(nèi)部因素的影響[23]。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中由于SO2釋放量和釋放速度不易控制，容易發(fā)生SO2過(guò)量問(wèn)題導(dǎo)致出現(xiàn)落粒。下面將從圖1 五個(gè)方面闡述過(guò)量SO2引起葡萄落粒產(chǎn)生的機(jī)制。

圖1 過(guò)量SO2 影響葡萄落粒的機(jī)制Fig.1 Mechanism of excessive sulfur dioxide affecting berry abscission

2.1 影響氣孔開度

SO2是通過(guò)氣孔進(jìn)入葡萄離區(qū)從而產(chǎn)生落粒等傷害見圖2。葡萄漿果表面含有少量的氣孔，并且具有一層蠟質(zhì)層，但果梗上存在大量的氣孔和皮孔，是葡萄與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道。對(duì)‘紅地球’、‘無(wú)核白’、‘木納格’和‘巨峰’四個(gè)葡萄品種的果梗結(jié)構(gòu)和SO2積累量的差異研究表明，果梗的含水量和氣孔面積與SO2積累量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，并且果梗和穗梗是SO2積累量最多的兩個(gè)部位[24]。Wu等[25]研究也發(fā)現(xiàn)SO2主要通過(guò)葡萄果梗和果蒂進(jìn)入葡萄離區(qū)，而葡萄離區(qū)的亞硫酸鹽殘留量與葡萄落粒率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

圖2 SO2 進(jìn)入葡萄的途徑Fig.2 Pathway of SO2 into grapes

氣孔是植物抗逆反應(yīng)的第一道防線，適當(dāng)逆境條件會(huì)造成氣孔關(guān)閉，但當(dāng)亞硫酸根離子積累到一定濃度便會(huì)影響氣孔的正常開啟和關(guān)閉[26]。用不同濃度（0～5 mmol/L）Na2SO3/NaHSO3溶液處理甘薯的表皮，可迅速提高內(nèi)源性H2S 和NO 的水平，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[27]。在蠶豆中低濃度（0.0001～0.1 μmol/L）亞硫酸通過(guò)降低內(nèi)源性脫落酸（Abscisic acid，ABA）的水平拮抗其作用，促進(jìn)氣孔開放；反之，高濃度（10 μmol/L）的亞硫酸通過(guò)增加內(nèi)源性ABA 的水平，抑制氣孔開放[28]。在黃花菜中不同濃度（0～5 mmol/L）Na2SO3/NaHSO3溶液以劑量依賴的方式降低保衛(wèi)細(xì)胞活力，誘導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞程序性死亡導(dǎo)致氣孔不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)閉[29]。Li 等[30]同樣發(fā)現(xiàn)SO2熏蒸處理導(dǎo)致擬南芥葉片產(chǎn)生過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2），使得葉片發(fā)生氣孔關(guān)閉和細(xì)胞凋亡。當(dāng)環(huán)境SO2濃度低時(shí)，與耐受有關(guān)的生化特征成為植物脅迫反應(yīng)的主體；當(dāng)SO2濃度較高時(shí)，避免SO2大量進(jìn)入植物組織占據(jù)主要地位。

2.2 破壞組織結(jié)構(gòu)

在鮮食葡萄中SO2處理產(chǎn)生的殘留主要在果梗和穗梗的離區(qū)細(xì)胞中[24]，并且一般以亞硫酸、亞硫酸氫根、亞硫酸離子形式存在。這些物質(zhì)具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，可以穿透細(xì)胞膜破壞蛋白質(zhì)和酶結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其變性或者酶活性改變[31-32]。通過(guò)對(duì)‘無(wú)核白’葡萄的組織解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，其SO2傷害主要始于細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞[33]。SO2處理使得葡萄內(nèi)部脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）活性升高、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及組織相對(duì)電導(dǎo)率增加，丙二醛和膜蛋白交聯(lián)聚合促使膜相結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)[34]。這些變化說(shuō)明SO2使葡萄細(xì)胞膜發(fā)生過(guò)氧化，細(xì)胞膜受到損傷進(jìn)而透性增加[26]。在SO2與殼聚糖復(fù)合處理進(jìn)行葡萄保鮮時(shí)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用SO2使得‘巨峰’葡萄離區(qū)結(jié)構(gòu)變化大于復(fù)合處理，當(dāng)貯藏4 d后其離區(qū)細(xì)胞已明顯呈絮狀化狀態(tài)存在[25]。另外，SO2溶于水造成的酸性環(huán)境也可能直接對(duì)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成破壞。SO2-乙醇-水（SEW）預(yù)處理竹渣中發(fā)現(xiàn)SO2生成的亞硫酸能夠通過(guò)磺化作用使半纖維素和木質(zhì)素的溶解性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到破壞[35]。因此，SO2造成葡萄離區(qū)組織結(jié)構(gòu)的破壞主要是由于形成了亞硫酸鹽，并且使離區(qū)細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生了變性，形成顆粒狀或絮狀物質(zhì)，最終發(fā)生質(zhì)壁分離導(dǎo)致離區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，葡萄果粒易發(fā)生脫落。

2.3 改變細(xì)胞壁降解酶活性

細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠構(gòu)成，并伴有結(jié)構(gòu)蛋白、酚類、脂肪酸及金屬離子的存在[36]。植物細(xì)胞壁分為胞間層、初生壁和次生壁三部分。葡萄脫落過(guò)程中主要涉及到離層細(xì)胞中膠層的水解和薄壁細(xì)胞纖維素壁分解[37]。例如，‘無(wú)核白’葡萄落粒增加的同時(shí)，其離區(qū)的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）和果膠酯酶（Pectinesterase，PE）活性逐漸增加，并且二者間呈顯著正相關(guān)[38]。同樣，SO2使‘巨峰’葡萄離區(qū)中的細(xì)胞壁降解酶——PG 和纖維素酶（Cellulase，Cx）活性明顯升高[25]。另外，對(duì)SO2處理后的‘克瑞森’葡萄進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）和膨脹素（Expansin，EXP）基因表達(dá)被強(qiáng)烈上調(diào)，其中XTH 能夠水解細(xì)胞壁中的半纖維素，EXP 能夠打破纖維素、半纖維素和果膠之間的非共價(jià)鍵以及誘導(dǎo)微纖維移位；同時(shí)，果膠甲酯酶（Pectin methylesterases，PME）、果膠乙酰酯酶（Pectin acetylesterases，PAE）、PG 和脫水應(yīng)答蛋白基因表達(dá)被上調(diào)，這些結(jié)果表明果膠作為中膠層的主要成分被降解[39]。在擬南芥的研究中也發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞壁降解酶受到SO2處理的影響，PME、PAE、XTH 和EXP 基因表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)[40]。因此，SO2能夠影響細(xì)胞壁修飾酶和水解酶基因的表達(dá)和酶活性的改變，從而參與到葡萄落粒過(guò)程中。

2.4 影響激素含量

葡萄受到發(fā)育和外界環(huán)境刺激產(chǎn)生的漿果脫落，通常都是由激素介導(dǎo)的[41]。果穗采收后斷絕了來(lái)自莖尖、葉片和根中促進(jìn)生長(zhǎng)的激素供給，同時(shí)葡萄果粒離區(qū)的分化受到乙烯和生長(zhǎng)素（auxin，IAA）的影響[42]。當(dāng)激素平衡狀態(tài)被打破，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脫落信號(hào)并傳遞給離區(qū)，細(xì)胞壁降解機(jī)制被激活，脫落開始進(jìn)行[43]。另外植物激素對(duì)于器官脫落的調(diào)節(jié)通常是協(xié)同發(fā)揮作用的[44]。已經(jīng)有研究表明高等植物通過(guò)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于SO2脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。Giraud等[39]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析揭示SO2引起葡萄內(nèi)參與生長(zhǎng)素、乙烯和茉莉酸信號(hào)的組分mRNA 被顯著上調(diào)。在SO2引起的‘巨峰’葡萄落粒中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)SO2誘導(dǎo)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖代謝、能量代謝和細(xì)胞壁代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)[45]。另外，Li 等[30]研究證明擬南芥對(duì)SO2脅迫響應(yīng)通過(guò)miRNAs 完成，這些miRNAs 基因的啟動(dòng)子序列中包含多種植物激素反應(yīng)元件，例如脫落酸響應(yīng)元件（ABREs）、赤霉素響應(yīng)元件（TATC-box，P-box 和GARE-motif）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif）[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)不同劑量SO2處理對(duì)葡萄的激素水平會(huì)產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)使用一張‘農(nóng)大牌’葡萄保鮮紙?zhí)幚? kg‘無(wú)核白’葡萄時(shí)，葡萄果梗、穗梗及果粒中IAA 和GA 均有明顯增加，ABA 略有降低，乙烯釋放量明顯較少；而當(dāng)保鮮紙?jiān)黾拥饺龔垥r(shí)，ABA 含量明顯增加，乙烯釋放呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，并且加速葡萄果粒的脫落[46]。葡萄體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)是由激素的平衡狀態(tài)被破壞所產(chǎn)生的，不同劑量的SO2能夠通過(guò)影響激素水平產(chǎn)生抑制脫落或促進(jìn)脫落的信號(hào)。另外，由于不同葡萄品種對(duì)SO2的耐受性有所不同，SO2劑量和葡萄品種這兩個(gè)因素可能都對(duì)內(nèi)部激素含量的變化情況產(chǎn)生復(fù)雜多樣的影響，這需要進(jìn)一步的深入探究。

2.5 影響活性氧水平

葡萄在過(guò)量SO2的逆境環(huán)境下還會(huì)導(dǎo)致過(guò)多的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累[47]，包括單線態(tài)氧（1O2）、超氧陰離子（O2-·）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等[48]。例如‘巨峰’葡萄和‘紅地球’葡萄受到SO2傷害時(shí)，其活性氧清除體系中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）兩種酶活性降低，同時(shí)活性氧水平、谷胱甘肽（GSH）含量升高[49]。在其它植物中也發(fā)現(xiàn)SO2影響活性氧清除體系組分的改變。例如擬南芥暴露于SO2環(huán)境中72 h，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、過(guò)氧化物酶（Peroxisome，POD）、SOD 活性上升；但當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到120 h時(shí)，SOD、GPX 活性下降，ROS、MDA 含量升高膜脂發(fā)生過(guò)氧化[50]。在過(guò)氧化物酶體中亞硫酸氧化酶（Sulfite oxidase，SO）也能夠通過(guò)降解亞硫酸鹽產(chǎn)生硫酸鹽和H2O2[15,51]。葡萄細(xì)胞內(nèi)的ROS 處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，細(xì)胞中的抗氧化酶系統(tǒng)在SO2脅迫響應(yīng)時(shí)對(duì)ROS 水平變化發(fā)揮著重要的作用[49]。適量濃度SO2刺激細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的ROS，而ROS作為信號(hào)分子能夠刺激抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力[52]；但在高濃度或長(zhǎng)時(shí)間的SO2環(huán)境下，細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)難以應(yīng)對(duì)，對(duì)ROS 清除能力有限，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，細(xì)胞物化結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而最終導(dǎo)致葡萄果實(shí)與果梗分離[53-54]。

3 展望

近年來(lái)，隨著消費(fèi)者對(duì)果蔬品質(zhì)的要求不斷提高，SO2處理作為葡萄主要保鮮方式，貯藏期間的落粒問(wèn)題成為葡萄貯藏保鮮的研究重點(diǎn)。本文綜合分析目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于過(guò)量SO2對(duì)葡萄落粒影響的研究，其機(jī)制主要表現(xiàn)在SO2可通過(guò)調(diào)節(jié)果梗上氣孔開度、破壞離區(qū)組織結(jié)構(gòu)、改變細(xì)胞壁降解酶活性、影響激素含量、影響活性氧水平等多種途徑，最終導(dǎo)致葡萄果實(shí)脫落的現(xiàn)象發(fā)生。未來(lái)對(duì)SO2引起葡萄果實(shí)脫落的研究應(yīng)從單一的關(guān)鍵酶、激素含量、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等水平的影響向代謝組學(xué)、信號(hào)通路等系統(tǒng)研究方向發(fā)展。另外，還應(yīng)著力于探究SO2劑量與落粒相關(guān)的細(xì)胞壁降解酶、激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、ROS 清除途徑的基因表達(dá)差異等方面，明確不同SO2劑量影響葡萄落粒相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)制；激素等外源處理方式能顯著影響細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)[55-56]，也為降低SO2引起葡萄果實(shí)脫落提供更多的方法選擇，相信不久的將來(lái)SO2在葡萄貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的弊端將會(huì)得到解決。