艾正文

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)研究院，上海 200436）

酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)，約占牛奶總蛋白質(zhì)的80%。其中，β-酪蛋白約占酪蛋白的30%左右[1]。根據(jù)研究顯示，由于受到自然界奶牛的雜交和基因突變等因素的影響，牛乳中β-酪蛋白有多達(dá)10 余種變異體，其中以A1 和A2 為比較常見的變異體[2-4]。有研究表明，A2β-酪蛋白（A2，βcasein-A2）在消化過程中不會像A1β-酪蛋白（A1，βcasein-A1）一樣產(chǎn)生β-酪啡肽-7（BCM-7）[5-6]，而BCM-7 可能與過敏、消化吸收障礙有關(guān)[7-8]。因此近幾年A2β-酪蛋白牛奶成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。通過分析表明，A1 和A2β-酪蛋白區(qū)別在于第67 位氨基酸的不同，這種分子結(jié)構(gòu)細(xì)微的差別，為后期分離和純化帶來了挑戰(zhàn)[9]，也是市面上還無商業(yè)化的A1 和A2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可供使用的重要原因。目前對A1 和A2 蛋白的定量主要通過購買的β-酪蛋白的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行折算定量，從而會對其定量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性帶來影響[10]。

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞工廠概念應(yīng)運(yùn)而生。以大腸桿菌、酵母為代表的微生物表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、易于擴(kuò)大培養(yǎng)等特點(diǎn)[11-13]，已作為最為常用的生物合成手段之一，廣泛應(yīng)用于目標(biāo)蛋白[14]、天然產(chǎn)物[15-16]、藥物[17]和食品[18]的合成中。牛乳中的酪蛋白作為牛乳蛋白質(zhì)的重要組成成分之一，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雖然陳愛亮等[19]通過篩選純合型A1 或A2 奶牛，并從其乳汁中通過反復(fù)離心、過濾以及沉淀等過程可以得到A1 或者A2 蛋白，但是傳統(tǒng)方式獲取牛奶中的特定β-酪蛋白具有生產(chǎn)效率低、蛋白純度低以及資源消耗大的特點(diǎn)。如何高效且低成本的獲得可替代蛋白成為在過去的一段時(shí)間內(nèi)各國研究的熱點(diǎn)，且并在此領(lǐng)域研究已經(jīng)取得了一系列突破[20-21]。雖然目前通過基因工程手段已在實(shí)驗(yàn)室階段實(shí)現(xiàn)了利用大腸桿菌、畢赤酵母菌等微生物作為底盤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)α-乳白蛋白、β-乳球蛋白以及乳鐵蛋白等乳成分蛋白的生物合成[22-25]。Keppler 等[23]以大腸桿菌為載體成功實(shí)現(xiàn)了β-乳球蛋白不同變異體的重組表達(dá)，所獲得的重組蛋白與原生β-乳球蛋白在理化特性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及翻譯后修飾都基本相似，然而目前針對β-酪蛋白變異體合成的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

本研究以大腸桿菌為工程載體，通過構(gòu)建特定β-酪蛋白變異體表達(dá)系統(tǒng)，探索A1 和A2β-酪蛋白生物合成的可能性，從而解決采用傳統(tǒng)分離純化手段制備結(jié)構(gòu)細(xì)微差異的變異體蛋白帶來的工藝難題，從而為后續(xù)乳蛋白定向合成以及相關(guān)乳制品的A1 和A2 蛋白定量檢測提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主Top10 上海生工；表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21（DE3） 卡梅德生物；蛋白Maker、aq DNA 聚合酶、NdeI、XhoI 限制性內(nèi)切酶 賽默飛世爾公司；Ni Sepharose FF GE；Tricine、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 大連寶生物工程公司；引物合成和測序 均由上海生工完成；卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）等其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)市售分析純。

AKTAprime plus 蛋白純化系統(tǒng) GE 公司；5418R高速冷凍離心機(jī) Eppendorf；5200 凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；BJ-2CD 超凈工作臺 上海博迅儀器有限公司；FreeZone 真空冷凍干燥機(jī) Labconco；Mini-PROTEAN Tetra 電泳儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；HPP110 恒溫恒濕培養(yǎng)箱德國美墨爾特公司；ZQLY-180ES 搖床 上海知楚儀器有限公司；ABI Veriti PCR 儀 賽默飛世爾公司；UV-1780 紫外分光光度計(jì) 島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究針對我院收治的82例患者的血管超聲檢查結(jié)果進(jìn)行對比分析后發(fā)現(xiàn)，＞60歲組在性別、吸煙史、高血壓、糖尿病、冠心病、下肢動(dòng)脈疾病的比例明顯高于≤60歲組，P＜0.05。這也進(jìn)一步表明頸動(dòng)脈狹窄與年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，年齡越大意味著頸動(dòng)脈病變發(fā)生率越高，進(jìn)而引發(fā)腦卒中的幾率就越高。分析其原因與老年人免疫功能下降、血壓升高、代謝紊亂等一系列不良因素相關(guān)。老年人下肢動(dòng)脈病變和冠心病的發(fā)生率較高，進(jìn)而頸動(dòng)脈病變的發(fā)生率隨之升高。

A1 蛋白氨基酸序列：

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVES LSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIH PFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVP PFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVE PFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQP LPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQR DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

1.2.3 表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化 取大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)一只100 μL，放置冰上化凍，超凈工作臺內(nèi)取1.5 mL無菌離心管，并均分50 μL 感受態(tài)細(xì)胞。在超凈工作臺中向感受態(tài)細(xì)胞中加入20 μL 制備的質(zhì)粒，輕輕混勻后，冰浴30 min。隨后，在42 ℃條件下熱擊90 s后立即冰浴5 min，取30 μL 涂布LB（含50 μg/mL卡那霉素）平板，37 ℃培養(yǎng)14 h（過夜培養(yǎng)）后挑取單克隆進(jìn)行活化培養(yǎng)。

2011年九十月份的一天，鄧強(qiáng)告訴林中偉，可以讓他來做安居華苑項(xiàng)目，但是需要城投公司下屬的肇慶市建筑工程有限公司（以下簡稱“市建公司”）去投標(biāo)，等市建公司中標(biāo)后再和林中偉合作。此前，鄧強(qiáng)已經(jīng)和市建公司分管經(jīng)營的副總經(jīng)理程某打好了招呼，說會有一個(gè)姓林的找他，準(zhǔn)備拿市建公司的資質(zhì)投標(biāo)肇慶城投準(zhǔn)備建的經(jīng)濟(jì)適用房項(xiàng)目，讓程總適當(dāng)照顧一下林總。

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVES LSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIH PFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVP PFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVE PFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQP LPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQR DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)其設(shè)計(jì)對應(yīng)的堿基序列和相應(yīng)的帶Nde I 和Xho I 酶切位點(diǎn)的引物（見表1）進(jìn)行目的片段的克隆。然后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a（+）分別用Nde I 和Xho Ⅰ雙酶切，用試劑盒回收后進(jìn)行連接得到pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a（+）-CSN2-A2。連接產(chǎn)物隨后分別轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果，將鑒定正確的質(zhì)粒做進(jìn)一步測序[27]。

表1 設(shè)計(jì)引物序列Table 1 Design primer sequence

A2 蛋白氨基酸序列：

1.2.4 表達(dá)鑒定 方法參考文獻(xiàn)[28-29]略作修改，具體如下，從1.2.3 的LB 平板中挑取單克隆，加入2 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）活化至菌體OD600為0.6～0.8 后，轉(zhuǎn)接到5 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8 后加入不同濃度的IPTG（0.2 mmol/L 和1 mmol/L）在37 ℃和15 ℃分別誘導(dǎo)表達(dá)4 h 和30 h，收集菌體。

取誘導(dǎo)表達(dá)前與誘導(dǎo)后各條件的菌體進(jìn)行超聲破碎后，取上清和沉淀制樣SDS-PAGE 分析，SDSPAGE 分離膠的配制和實(shí)驗(yàn)方法見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]。

1.2.5 放大表達(dá)與親和純化

A1 和A2 蛋白目標(biāo)基因片段長度為684 bp，并分別與表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）構(gòu)建得到pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a（+）-CSN2-A2（產(chǎn)物長度：684+5.3k bp）重組表達(dá)質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，用Nde I 和Xho I 雙酶切鑒定。通過SDS-PAGE 電泳發(fā)現(xiàn)有符合大小的目的條帶出現(xiàn)（圖2），鑒定結(jié)果表明提取的質(zhì)粒為重組表達(dá)，且測序結(jié)果與理論一致。

1.2.1 目的表達(dá)蛋白氨基酸序列 通過在Uniprot數(shù)據(jù)庫（www.uniprot.org）中查找β-酪蛋白有224 氨基酸序列（P02666），其中在N 端包含15 個(gè)氨基酸組成的信號肽序列[26]。根據(jù)A1 和A2 蛋白在氨基酸組成上的差異分別得到對應(yīng)的氨基酸序列后委托卡梅德生物設(shè)計(jì)相應(yīng)的堿基序列。同時(shí)通過Prot Param 軟件分別對A1 和A2 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.5.1 放大表達(dá) 從1.2.3 表達(dá)鑒定中選取能夠表達(dá)目的蛋白的BL21 菌株，接種到1L LB 培養(yǎng)基（含50 μg /mL 卡那霉素）中，220 r/min，37 ℃搖床擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值至0.6～0.8，再加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h 后，4000 r/min 離心收集菌體待用[30]。

1.2.5.2 親和純化 重組蛋白的親和純化方法主要參考文獻(xiàn)[31-32]，并稍作修改。即將收集獲得的菌泥用40 mL 含20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl 的緩沖液（pH=7.2）進(jìn)行重懸。然后在參考冰浴條件下超聲破碎，功率為420 W，超聲3 s，間隔5 s，持續(xù)15 min。最后4 ℃，12000 r/min 條件下離心20 min，收集上清和沉淀，待用。

總而言之，在新的社會形勢下，博物館承擔(dān)的非物質(zhì)文化保護(hù)責(zé)任愈來愈重，這就決定著我們地方政府要加大對博物館模式的支持力度。此外，博物館模式運(yùn)營時(shí)間較短，仍存在一些不足之處，如何加強(qiáng)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的傳承和發(fā)揚(yáng)有待于進(jìn)一步探索。

1.2.5.3 上清純化 1.2.5.2 中上清經(jīng)過0.22 μm 過濾后進(jìn)行Ni 柱親和層析純化。正式純化前先用不少于5 倍柱體積的雙蒸水沖洗Ni 柱，然后柱子用平衡緩沖液平衡100 mL。平衡后用上清分批緩慢注入Ni 柱中，隨后用不同梯度的咪唑緩沖液依次洗脫柱子，并分別取樣。實(shí)驗(yàn)過程中可以利用Bradford 檢測洗脫情況，當(dāng)洗脫液在Bradford 液中未變藍(lán)，則沖洗干凈。平衡緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0。清洗緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，咪唑濃度分別為5、20、50、和80 mmol/L，pH=8.0。最后用pH=8.0，20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+300 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫。

1.2.5.4 包涵體純化 1.2.5.2 中沉淀加入適量20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0 緩沖液分散后在4℃，12000 r/min 條件下離心10 min。隨后沉淀用含0.3%曲拉通的緩沖液（20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0）和20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+2mol/L 尿素， pH=8.0 再按照相同步驟清洗兩次。然后在沉淀中加入15 mL 的20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素，pH=8.0，在4 ℃條件下緩慢攪拌，溶解沉淀。最后4 ℃，12000 r/min 離心10 min 獲得沉淀復(fù)溶上清并經(jīng)過0.22 μm 過濾后進(jìn)行Ni 柱親和富集純化。后續(xù)純化步驟同“上清純化”，平衡緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素，pH=8.0，清洗緩沖液為20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L尿素（pH=8.0），咪唑濃度分別為5、20、50 和80 mmol/L 清洗。最后用20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+8 mol/L 尿素+300 mmol/L 咪唑，pH=8.0 緩沖液洗脫。流穿純化樣品取50 μL 加入loading buffer 后100 ℃煮樣后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.5.5 包涵體復(fù)性 上述純化樣品先用20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl，pH=8.0，以2 mL/min 流速滴加稀釋至尿素終濃度為4 mol/L，4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌48 h 后，將樣品裝入7 kDa孔徑透析袋中進(jìn)行復(fù)性，方法參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道并略作調(diào)整[15,33]，詳細(xì)步驟如下：用1 L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+2 mol/L 尿素，pH=8.0 緩沖液，4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌24 h，按順序更換1L 20 mmol/L PB+150 mmmol/L NaCl+1 mol/L 尿素（pH=8.0）、1 L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+0.5 mol/L 尿素（ pH=8.0） 、 1L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl+0.5 mol/L 尿素（pH=8.0）和1L 20 mmol/L PB+150 mmol/L NaCl（pH=8.0）透析緩沖液，分別在4 ℃冰箱中以350 r/min 攪拌速度攪拌24 h。從透析袋中移出經(jīng)透析的蛋白質(zhì)溶液，然后12000 r/min，4 ℃離心10min 取上清50 μL，加入10 μL loading buffer 100 ℃煮樣，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。同時(shí)用BCA 蛋白檢測試劑盒對復(fù)性后的蛋白濃度進(jìn)行測定。

一是有利于開拓教學(xué)新陣地。院校各系部、各教研室可以結(jié)合自身特點(diǎn)開設(shè)專欄，及時(shí)發(fā)布并更新政府部門制定的一系列會計(jì)、稅收、工商等財(cái)經(jīng)法規(guī)，引入在線精品課程、在線題庫、在線交流、掌上高校等教學(xué)資源，作為會計(jì)教學(xué)的出發(fā)點(diǎn)和落腳點(diǎn)。同時(shí)，積極回應(yīng)學(xué)生、企事業(yè)單位、學(xué)生家長和社會關(guān)注的問題，利用微博、微信及時(shí)處理學(xué)生反應(yīng)的問題，解疑釋惑。

2．AP患者性別比：1991-1995年、1996-2000年、2001-2005年、2006-2010年AP患者的男女性別比分別為1.507(101/67)、2.449(196/78)、2.619(241/92)、2.862(269/94)，1996-2010年的3個(gè)時(shí)間段男女性別比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但3個(gè)時(shí)間段所有AP患者的性別比為2.655(701/264)，較1991-1995年間顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2 =12.193，P=0.0005)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，蛋白質(zhì)理化特性分析采用在線Prot Param 軟件，引物設(shè)計(jì)采用Primer 5，序列分析采用軟件DNASTAR。

2 結(jié)果與分析

2.1 A1 和A2 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

通過Prot Param 軟件對A1 和A2 蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析得到對應(yīng)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果見表2。A1 和A2 蛋白分子量在25 kDa 左右，理論等電點(diǎn)在5.2～5.4 之間，為酸性蛋白質(zhì)，其中帶負(fù)電殘基明顯多于帶正電殘基。此外A1 和A2 蛋白經(jīng)過預(yù)測，不穩(wěn)定系數(shù)均超過40，因此均屬于不穩(wěn)定蛋白[26]。同時(shí)，根據(jù)所有氨基酸親水值的總和與氨基酸總數(shù)量的比值（親水系數(shù)）來看這兩種蛋白均偏親水性，其負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)[35]。從圖1 可以看到A1 和A2 蛋白親疏水性基本相同，最強(qiáng)疏水性氨基酸殘基均位于氨基酸序列的第7 位（Ala，Score:3.378），而最強(qiáng)親水性氨基酸殘基同樣位于氨基酸序列的第55 位（Gln，Score:-3.189）。

圖1 A1 和A2 蛋白親疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.1 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction results of A1/A2 proteins

表2 A1/A2 蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of A1/A2 proteins

2.2 A1 和A2 蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建

7月27日下午到前半夜,受強(qiáng)雷雨云團(tuán)影響,桐廬、建德、淳安等地發(fā)生短時(shí)暴雨、雷雨大風(fēng)等強(qiáng)對流天氣。根據(jù)雷達(dá)回波顯示,事件發(fā)生時(shí)桐廬縣合村鄉(xiāng)有雷暴云團(tuán)覆蓋。27日19:35前后起,合村鄉(xiāng)出現(xiàn)局地強(qiáng)對流天氣,距廊橋所在位置約900 m的合村自動(dòng)氣象觀測站(以下簡稱合村氣象站)于19:34測得的極大風(fēng)速為24.1 m/s(圖1),風(fēng)向109°(東南偏東風(fēng));19—20時(shí)雨量8.4 mm。根據(jù)現(xiàn)場踏勘,該站探測環(huán)境符合氣象觀測規(guī)范要求,氣象探測設(shè)施維護(hù)到位,設(shè)備工作狀態(tài)正常,觀測資料具備可用性。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.2 Results of recombinant plasmid for doubleenzyme digestion

2.3 單克隆菌株的篩選

分別將提取的質(zhì)粒加入到感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，然后在含有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)。隨后挑選單菌落加入到含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中活化、傳代培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。因此取誘導(dǎo)表達(dá)前與誘導(dǎo)后各條件的菌體進(jìn)行超聲破碎后，取沉淀制樣SDS-PAGE 分析，驗(yàn)證結(jié)果見圖3。兩種重組表達(dá)菌株分別與各自未加IPTG 的重組表達(dá)菌株做對比。由于在重組蛋白C 端分別帶有6×His 標(biāo)簽，因此A1 和A2 重組蛋白的理論相對分子量分別為25.98 和25.94 kDa。

1.2.6 質(zhì)譜鑒定 通過SDS-PAGE 分離得到的目的蛋白，利用干凈的刀片收集目的蛋白膠條經(jīng)酶解后在卡梅德生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜覆蓋度檢測。同時(shí)目的蛋白經(jīng)過胰蛋白酶酶解后采用LC-MS/MS，分別以IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLT QTPVVVPPFLQPEVMGVSK（A1）和IHPFAQTQS LVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEV MGVSK（A2）為特征性肽段進(jìn)行定性分析，具體方法可參考文獻(xiàn)[34]報(bào)道。

圖3 不同A1 重組菌體誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.3 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for different A1 recombinant stains of induced expression

結(jié)果表明，A1 和A2 不同單克隆菌株均在25 kDa條帶附近具有比較明顯的目的蛋白條帶。從表1 可知，A1/A2 蛋白中帶負(fù)電的氨基酸殘基較多，分子間和分子內(nèi)的靜電斥力較大，因此電泳圖中顯示的實(shí)際蛋白分子量略微偏大[26]。此外，從圖3 和圖4 中均可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)誘導(dǎo)的A1 和A2 重組表達(dá)載體在分子量25 kDa 處也有不同程度的目的條帶出現(xiàn)，因此顯示A1 和A2 單克隆菌株未經(jīng)誘導(dǎo)即可能發(fā)生了輕微泄露表達(dá)，但是經(jīng)過誘導(dǎo)單克隆菌株表達(dá)相對更加明顯。隨后挑選表達(dá)明顯單克隆菌株用于后續(xù)表達(dá)放大。

圖4 不同A2 重組菌體誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.4 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for different A2 recombinant stains of induced expression

2.4 不同溫度以及不同IPTG 濃度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

為了研究陽性克隆菌株在不同誘導(dǎo)劑濃度和溫度條件下重組表達(dá)載體目的蛋白表達(dá)情況，分別將A1 和A2 重組表達(dá)載體在37 ℃和16 ℃條件下添加不同濃度的IPTG（0.2 和1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5 和圖6。結(jié)果表明，A1 和A2蛋白均以包涵體的形式表達(dá)，存在于細(xì)胞破碎后的沉淀中，而上清液中基本不含目的表達(dá)蛋白。這與相關(guān)研究結(jié)果類似[24]，原因可能與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)有關(guān)。當(dāng)重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)時(shí)，可能受到環(huán)境脅迫以及缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子等因素，從而造成不溶性蛋白的產(chǎn)生[36]。目前有研究報(bào)道通過低溫培養(yǎng)能夠提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)可溶性[37]，但是通過對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，A1 和A2 重組蛋白在15 ℃條件下僅少量表達(dá)，同時(shí)鑒于IPTG 具有一定的毒性[30]，因此選擇37 ℃，0.2 mmol/L IPTG 為后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)條件。

周家糧鋪院是村中一位周姓財(cái)主建造的自家宅院，兼做住宅和糧食鋪，由于此處高差變化大，建造時(shí)工匠根據(jù)“前店后廠”的傳統(tǒng)建筑布局思路[13]，建成了“下店上廠”的特色店鋪院落格局，下院主做糧食鋪，上院東廂房做糧倉，其余窯洞做居住或其他功能使用，測繪時(shí)的手繪鳥瞰圖如圖所示（圖5）。院落西面保留有村中唯一的一座石磨，上院的院中及下院東側(cè)散落有石碾及石砘，更體現(xiàn)了此處的糧鋪建筑屬性。下院五孔窯洞，東側(cè)兩孔為糧食鋪，因下院商業(yè)建筑的功能需求，使得與驛道相連的走道具有了重要的交通作用，不僅要滿足院落主人的使用，還要滿足來往買糧人的交通要求。

圖5 A1 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.5 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A1 recombinant stains of induced expression

圖6 A2 重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.6 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A2 recombinant stains of induced expression

2.5 包涵體蛋白純化和復(fù)性

由于A1 和A2 蛋白均以包涵體的形式表達(dá)，因此將1.2.5.2 獲得的沉淀進(jìn)行梯度洗脫后用8 mol/L尿素溶解，沉淀復(fù)溶上清過膜后用Ni 柱進(jìn)行親和富集純化，分別收集上樣流出液、清洗樣和洗脫樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。圖7 和圖8 分別為A1 和A2 重組表達(dá)菌株誘導(dǎo)后得到的沉淀樣、復(fù)溶以及純化后樣品SDS-PAGE 電泳圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A1 和A2包涵體蛋白經(jīng)過清洗、復(fù)溶和純化后在25 kDa 附近出現(xiàn)目的蛋白條帶以外基本無其他雜蛋白，因此達(dá)到了預(yù)期純化目標(biāo)。

圖7 A1 重組蛋白包涵體純化SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.7 Purification results of SDS-PAGE by commassie blue staining for inclusion bodies of A1 recombinant protein

圖8 A2 重組蛋白包涵體純化SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.8 Purification results of SDS-PAGE by commassie blue staining for inclusion bodies of A2 recombinant protein

包涵體通過純化后利用透析袋進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性后的重組的A1 和A2 蛋白樣品。SDS-PAGE檢測后呈單一條帶（圖9），且純度超過90%。經(jīng)BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定，A1 和A2 重組蛋白濃度分別為1.5 和2.0 mg/mL。

城鄉(xiāng)規(guī)劃編制的一項(xiàng)重要內(nèi)容是城市用地豎向規(guī)劃，它是指在某規(guī)劃地段，對原地形地貌進(jìn)行改造開發(fā)而開展的一系列規(guī)劃設(shè)計(jì)工作，包括平衡土石方、高程控制和確定坡度等內(nèi)容，前提是必須綜合滿足城市景觀、道路交通、建筑布置、地面排水等方面的要求。規(guī)劃者可以從城市豎向設(shè)計(jì)的實(shí)際需要出發(fā)搭建一個(gè)三維地理仿真環(huán)境，通過對測繪地理等多源數(shù)據(jù)的集成和融合，來研究場地設(shè)計(jì)、用地因子評價(jià)、綜合管網(wǎng)以及路網(wǎng)優(yōu)化等內(nèi)容，同時(shí)參考其他幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，比如協(xié)同設(shè)計(jì)框架、參數(shù)化驅(qū)動(dòng)的三維建模、漸進(jìn)式規(guī)劃設(shè)計(jì)等，來完成基于三維地理空間環(huán)境下的城市用地豎向規(guī)劃方案(如圖2所示)。

圖9 A1 和A2 重組蛋白復(fù)性SDS-PAGE 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.9 Results of SDS-PAGE by commassie blue staining for A2 recombinant protein after renaturation

2.6 質(zhì)譜鑒定

將重組表達(dá)得到的目的蛋白條帶切膠后用胰蛋白酶酶解后，離心和過濾后用于質(zhì)譜檢測。以A1和A2 蛋白理論序列為模板，利用質(zhì)譜檢測得到的多肽片段與理論氨基酸序列進(jìn)行比較，圖10 分別為A1 和A2 重組表達(dá)蛋白質(zhì)譜檢測中匹配到的短肽，多肽覆蓋率分別為54%和45%。同時(shí)利用LC-MS/MS 對合成的重組A1 和A2 蛋白進(jìn)行定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在重組表達(dá)的A1 和A2 蛋白中分別未檢出A2 和A1 蛋白特征肽段，且A1 和A2 蛋白占β-酪蛋白百分比均為100%。因此可以基本確定重組蛋白表達(dá)滿足要求。

圖10 質(zhì)譜檢測得到的A1 和A2 重組蛋白的短肽Fig.10 Short peptides of A1 and A2 recombinant proteins by MS detection（Bold means matched

3 結(jié)論

A1 和A2 蛋白作為β-酪蛋白兩種常見的變異體類型，由于兩者在分子結(jié)構(gòu)上的細(xì)微差異使其在用常規(guī)方法制備和純化上存在困難。通過Prot Param分析表明A1/A2 蛋白屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，本研究利用分子生物學(xué)方法分別構(gòu)建了pET28a（+）-CSN2-A1 和pET28a （+）-CSN2-A2 兩個(gè)原核表達(dá)載體，并將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在37 ℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)4 h 可以實(shí)現(xiàn)β-酪蛋白變異體蛋白的過表達(dá)，最終獲得的A1 和A2 重組蛋白含量分別為1.5 和2.0 mg/mL。這為人工合成特定變異體的β-酪蛋白提供了新的借鑒。然而由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組A1 和A2 蛋白均以包涵體形式表達(dá)，需要進(jìn)行復(fù)性等操作后才能進(jìn)一步應(yīng)用。如何進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)重組蛋白可溶性表達(dá)是后續(xù)需要進(jìn)一步的研究方向。