馬 科，程源航

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450008）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學(xué)名4,5-二羰基-1-吡咯-2,3-f-喹啉-2,7,9-三羧酸，可以參與氧化還原反應(yīng)，還可參與脫氫、氧化、脫羧等。PQQ 可作為多種酶的輔因子，是繼核黃素和煙酰胺之后第三類輔酶[1-2]。其廣泛存在于自然界多種生命體，包括細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物等[3-6]。PQQ 對(duì)人體也具有多種生理功能，包括神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、抑制氧化應(yīng)激等[7-10]。2022 年被衛(wèi)生健康委食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)評(píng)估司認(rèn)定為“三新食品”，在醫(yī)藥、食品、健康等領(lǐng)域具有巨大開(kāi)發(fā)潛力[11]。

目前從發(fā)酵液中分離純化PQQ 的方法有陰離子交換樹(shù)脂法、高效液相色譜法、絡(luò)合萃取法、超分子溶劑萃取法等[12-16]。但以上方法均不適用于工廠大規(guī)模生產(chǎn)，故為了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)PQQ，必須解決分離純化技術(shù)難題。

固相萃取技術(shù)在醫(yī)藥、化工、生物等多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，是目前天然產(chǎn)物分離純化的熱門(mén)技術(shù)[17-19]。而磁性固相萃取是基于固相萃取技術(shù)，使用磁性或可磁化材料為吸附劑的新型萃取技術(shù)[20-21]。磁性吸附劑不直接填充吸附柱，而是添加到溶液或懸浮液中，吸附分離目標(biāo)物。然后，使用外部磁場(chǎng)將磁吸附劑從溶液中分離出來(lái)。再使用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵撃繕?biāo)物，并使用外部磁場(chǎng)將洗脫后的吸附劑從洗脫液中分離，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的分離[22]。

目前，磁性納米材料用于PQQ 的固相萃取主要存在吸附性能差的問(wèn)題。本文為突破PQQ 分離純化難題，促進(jìn)PQQ 新食品資源開(kāi)發(fā)，擬通過(guò)研究不同表面改性的磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附性能的影響，探索吸附性能與磁性納米材料表面吸附位點(diǎn)不同官能團(tuán)與PQQ 的分子相互作用力之間的內(nèi)在規(guī)律，以期為解決PQQ 固相萃取磁性納米材料吸附性能差的問(wèn)題提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、葡萄糖、酵母粉、硫酸銨磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；三氟乙酸、四氧化三鐵納米顆粒

分析級(jí)，百靈威科技有限公司；PQQ 標(biāo)準(zhǔn)品 色譜級(jí)，百靈威科技有限公司。

DF-101S 水浴鍋 鞏義于華儀器公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器公司；超聲恒溫水浴SCQ-HD300A 上海聲彥超聲波儀器有限公司；磁力攪拌器 力辰科技有限公司；安捷倫1260 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磁性納米材料的制備 為了開(kāi)發(fā)高效吸附PQQ 的磁性納米材料，本文根據(jù)材料表面吸附位點(diǎn)活性基團(tuán)與目標(biāo)物PQQ 分子間作用力大小不同，設(shè)計(jì)了以下三種表面改性方法，以期探索吸附性能與磁性納米材料表面吸附位點(diǎn)不同官能團(tuán)對(duì)PQQ 的分子相互作用力之間的關(guān)系。

1.2.1.1 材料1 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報(bào)道，但稍作修改[23]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過(guò)超聲，均勻分散到150 mL 無(wú)水乙醇中，加入1 mL超純水，劇烈攪拌，加入300 μL 的四甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應(yīng)6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.1.2 材料2 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報(bào)道，但稍作修改[24]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過(guò)超聲，均勻分散到150 mL 無(wú)水乙醇中，加入1 mL 超純水，劇烈攪拌，加入500 μL 的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應(yīng)6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.1.3 材料3 合成方法 合成方法參考現(xiàn)有報(bào)道，但稍作修改[25]。將1.5 g 磁性四氧化三鐵納米顆粒通過(guò)超聲，均勻分散到150 mL 無(wú)水乙醇中，加入1 mL 的超純水，劇烈攪拌，加入2 mL 的十六烷基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反應(yīng)6 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。取上述材料1 g 通過(guò)超聲分散到20 mL 的10%十六烷基三甲基溴化銨溶液中，劇烈攪拌，30 ℃下，反應(yīng)2 h。用磁鐵獲得修飾后的四氧化三鐵納米顆粒。干燥，密封保存。

1.2.2 磁性納米材料對(duì)PQQ 的萃取性能研究 三種磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附性能的對(duì)比：參考現(xiàn)有報(bào)道，但是具體條件有所改變[26]。本實(shí)驗(yàn)所需的PQQ 濃度為10～1200 mg·L-1，吸附實(shí)驗(yàn)均在pH6.5，磁性納米材料添加量為10 g·L-1，混合時(shí)保證吸附劑均勻分散于溶液中，30 ℃下以轉(zhuǎn)速200 r/min 震蕩15 min，吸附完成后用磁鐵將吸附劑與溶液分離，通過(guò)HPLC 測(cè)定剩余溶液中PQQ 的含量。

吸附量（Q，mg·g-1）通過(guò)以下公式（1）計(jì)算。

式中：C0（mg·L-1）和Ce（mg·L-1）分別是溶液中PQQ 的初始濃度和吸附后剩余濃度；V（mL）是PQQ 溶液的體積；m（mg）是磁性納米材料的質(zhì)量。

1.2.3 吸附動(dòng)力學(xué)研究

1.2.3.1 吸附動(dòng)力曲線 利用上述磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附量的方法，在條件不變的情況下，在0、4、6、10、15、20、30、40、50、60 min 時(shí)間點(diǎn)各取三個(gè)樣，測(cè)定吸附量和吸附率，并繪制吸附動(dòng)力曲線。

1.2.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)模型的測(cè)定 通過(guò)選用文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)模型，包括準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（公式（2）），準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（公式（3）），和粒子內(nèi)擴(kuò)散模型（公式（4））研究PQQ 的吸附機(jī)理[27]。

式中：t（min）是吸附時(shí)間；qe和qt（mg·g-1）分別是平衡時(shí)間和時(shí)間t 時(shí)的吸附量；k1（min-1）和k2（g·mg-1·min-1）分別是偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)、偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附速率常數(shù)；kd（g·mg-1·min-0.5）是內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)；C（mg·g-1）表示邊界層厚度。

1.2.3.3 吸附等溫線研究 吸附等溫線研究：通過(guò)Langmuir（公式（5）），F(xiàn)reundich（公式（6））和Tempkin（公式（7））分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[28]。

式中：ce是平衡時(shí)的吸附濃度（mg·L-1）；qe是平衡時(shí)的吸附容量（mg·g-1）；qmax是最大吸附容量（mg·g-1）；KL和KF是Langmuir 和Freundlich 模型的吸附速率常數(shù)；KT和f（L·mg-1）是Tempkin 常數(shù)和Tempkin 結(jié)合常數(shù)，分別反應(yīng)吸附熱和最大結(jié)合能。

1.2.4 解吸附研究 利用上述磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在條件不變的情況下，用以NaOH 溶液、甲酸、乙酸、氨水等為解吸劑進(jìn)行解吸研究，在5、60、120 min 時(shí)間點(diǎn)各取三個(gè)樣，測(cè)定解吸量和解析率。

利用磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在條件不變的情況下，選擇上述步驟中解吸附最優(yōu)的為解吸附劑進(jìn)行解吸研究，在5、30、60、120、180 min 時(shí)間點(diǎn)各取三個(gè)樣，測(cè)定解吸量和解析率。

1.2.5 HPLC 法檢測(cè)PQQ 檢測(cè)方法參考現(xiàn)有報(bào)道采用HPLC 法，但是具體條件有所改變[29]。對(duì)PQQ 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，顯示其在249 和330 nm 處有兩個(gè)吸收峰，但在249 nm 處有最大吸收。以甲醇（A）-水（B）、千分之一三氟乙酸為流動(dòng)相，利用反向C18色譜柱，測(cè)試吸收峰面積。按照所述色譜條件測(cè)定，峰面積（Y）與PQQ 濃度（X）的回歸方程為Y=4629.59X-242.06，線性范圍為0.5～5 μg/μL，決定系數(shù)R2為0.99936，PQQ 濃度與峰面積線性關(guān)系良好，以下關(guān)于PQQ 濃度檢測(cè)均使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次試驗(yàn)中PQQ 含量檢測(cè)數(shù)據(jù)均重復(fù)6 次，結(jié)果表示均以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式呈現(xiàn)。采用Minitab 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用Origin 2021進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附性能比較

為了選擇對(duì)PQQ 吸附能力最強(qiáng)的改性磁性納米材料，研究了三種表明改性磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附能力。結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)過(guò)四甲基硅烷表面修飾的材料1 對(duì)PQQ 吸附量最小，氨基硅烷化表面修飾的材料2 次之，而離子對(duì)硅烷化表明修飾的材料3 吸附作用最強(qiáng)，可達(dá)140.32 mg·g-1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇烷基化磁性納米材料作為吸附材料?，F(xiàn)有研究表明，不同改性試劑改性后，材料表面活性吸附基團(tuán)不同，活性基團(tuán)對(duì)目標(biāo)物的作用力越強(qiáng)，改性材料對(duì)目標(biāo)物的吸附能力越強(qiáng)[30]。材料1 表面活性基團(tuán)為甲氧基，其與PQQ 芳環(huán)氫之間的分子間相互作用力僅有較弱的范德華力，材料2 表面活性基團(tuán)3-氨基丙基與PQQ 羧基之間有以甲氧基為供電子體的氫鍵作用力，以及活性基團(tuán)甲氧基與PQQ 芳環(huán)氫之間的范德華力，材料3 表面活性基團(tuán)為十六烷基、甲氧基、銨根離子，其與PQQ 分子間相互作用力有比較強(qiáng)的銨根離子與PQQ 羧基形成的離子鍵作用力，以及甲氧基為供電子體的氫鍵作用力和范德華力[31-32]。因此，可能由于材料3 表面吸附位點(diǎn)對(duì)PQQ 分子間相互作用力最強(qiáng)，材料2 次之，材料1 最弱，從而導(dǎo)致材料3 吸附量最大，材料1 吸附量最小。表面改性磁性納米材料對(duì)PQQ 吸附能力與表面活性基團(tuán)對(duì)吸附目標(biāo)物的分子間相互作用力可能呈正相關(guān)。

圖1 不同表面改性磁性納米材料對(duì)PQQ 吸附的影響Fig.1 Effects of different magnetic nanomaterials on PQQ adsorption

2.2 材料3 對(duì)PQQ 吸附動(dòng)力學(xué)研究

通過(guò)研究三種改性的磁性納米材料對(duì)PQQ 吸附量，發(fā)現(xiàn)離子對(duì)烷基化表面修飾的材料3 吸附能力最大，因此進(jìn)一步對(duì)其吸附PQQ 的吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

2.2.1 吸附動(dòng)力曲線 對(duì)不同吸附時(shí)間材料3 對(duì)PQQ 的吸附量進(jìn)行了檢測(cè)，并繪制吸附動(dòng)力曲線。結(jié)果如圖2 所示，從該吸附動(dòng)力學(xué)曲線可以發(fā)現(xiàn)，PQQ 在20 min 前吸附速率非?？?，這是由于初始PQQ 濃度較高和磁性納米材料表面空白吸附位點(diǎn)較多，隨著表面吸附位點(diǎn)的減少，20～35 min 吸附速率減慢，直至50～60 min 達(dá)到平衡狀態(tài)。PQQ 平衡時(shí)的最大吸附量為160.81 mg·g-1。因此后續(xù)選擇吸附時(shí)間為50 min。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)材料3 吸附PQQ 的影響Fig.2 Effect of adsorption time on PQQ adsorption by material-3

2.2.2 吸附動(dòng)力學(xué)模型 圖3 顯示了三種動(dòng)力學(xué)模型模擬的結(jié)果，表1 顯示了三種動(dòng)力學(xué)模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的決定系數(shù)在0.9976～0.9982 范圍內(nèi)，擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為0.9803～0.9927，同時(shí)，擬一級(jí)模型計(jì)算的qe與實(shí)驗(yàn)吸附容量大致相符。這表明與擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型相比，擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型比較適合用于模擬該磁性納米材料PQQ 吸附。圖3C 顯示三種濃度下的雙線性，表明該納米材料對(duì)PQQ 的吸附不止一個(gè)吸附過(guò)程，第一個(gè)吸附過(guò)程發(fā)生在0～30 min，屬于快速吸附過(guò)程，納米材料表面的吸附位點(diǎn)對(duì)PQQ 進(jìn)行吸附，因?yàn)槌跏紩r(shí)表面活性位點(diǎn)較多，吸附速率快，隨著吸附位點(diǎn)的減少吸附進(jìn)入第二個(gè)階段，PQQ 分子在納米材料內(nèi)部進(jìn)行擴(kuò)散，圖中三條曲線都沒(méi)有經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，表明粒子的內(nèi)擴(kuò)散不是唯一速率確定方式。

表1 吸附動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)參數(shù)Table 1 Various parameters of adsorption kinetics

圖3 磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附動(dòng)力學(xué)模型Fig.3 Adsorption kinetic model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.2.3 吸附等溫線 采用三種模型對(duì)磁性納米材料吸附PQQ 過(guò)程中等溫曲線進(jìn)行描述，得到如圖4 所示數(shù)據(jù)，表2 為三種模型的參數(shù)總結(jié)。Lgangmuir 模型的R2=0.9989 遠(yuǎn)高于另外兩種的擬合程度，因此磁性納米材料對(duì)PQQ 的吸附更適合于Lgangmuir模型，表明PQQ 在磁性納米材上的吸附適用于單層吸附，在吸附劑表面的吸附結(jié)合位點(diǎn)是均一的。

表2 吸附等溫各項(xiàng)參數(shù)Table 2 Parameters of adsorption isotherm

圖4 磁性納米材料對(duì)PQQ 的等溫線模型Fig.4 Isotherm model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.3 解吸附研究

解吸附是將目標(biāo)物從萃取材料上解吸釋放的過(guò)程，是固相萃取的重要環(huán)節(jié)，解吸附率是考察萃取過(guò)程的重要指標(biāo)。本文為了開(kāi)發(fā)對(duì)PQQ 具有高效分離純化性能的磁性納米材料，除了吸附能力外，還考察了磁性納米材料的解吸附性能。

2.3.1 解吸附溶劑 解吸附溶劑通過(guò)與吸附材料表面活性基團(tuán)相互作用，從吸附材料替換目標(biāo)物而使其解吸附。解吸附劑的性能主要通過(guò)解吸附率評(píng)價(jià)。研究結(jié)果如圖5A 所示，氫氧化鈉作為解吸附溶劑，解吸附率可達(dá)85.03%，效果最好，氨水次之，甲醇和乙酸基本沒(méi)有解吸附作用。其原因推測(cè)為解吸附機(jī)制為離子交換解吸附，氫氧根離子交換PQQ 陰離子，而使其從材料表面解吸附出來(lái)。氨水堿性弱，無(wú)法完全交換。因此，隨著氫氧化鈉濃度的增加，離子交換越完全，解吸附效果持續(xù)升高，用質(zhì)量濃度0.05%的氫氧化鈉為解吸附溶劑，解吸附率可達(dá)85.13%，解吸附率與0.08%的氫氧化鈉作為解吸附劑相比差異不明顯。以上結(jié)果說(shuō)明，使用濃度0.05%氫氧化鈉作為解吸附劑效果最好。

圖5 不同溶劑對(duì)磁性納米材料解吸附的影響Fig.5 Effect of different solvents on desorption of magnetic nanomaterials

2.3.2 解吸附劑體積 為了考察解吸附劑體積對(duì)解吸附率的影響，研究了不同氫氧化鈉溶液體積（圖6）。隨著氫氧化鈉體積的增加，解吸附率逐漸增加，后趨于穩(wěn)定。當(dāng)氫氧化鈉體積為8 mL 時(shí)，解吸附率最大為90.5%。氫氧化鈉體積為4 mL 時(shí)，解析率已達(dá)到87%，故選擇4 mL 為最適解吸附劑體積。

圖6 氫氧化鈉體積對(duì)解吸附的影響Fig.6 Effect of sodium hydroxide volume on desorption

2.3.3 解吸附時(shí)間 對(duì)不同時(shí)間PQQ 的解吸附（圖7）研究結(jié)果表明，在0.1～1 h 期間，隨著時(shí)間的增加，解吸附速率最快，此時(shí)結(jié)合到磁性納米材料表面的PQQ 較多，容易解吸附，3 h 時(shí)解吸附率最大為87.0%，后隨著時(shí)間的增加，解吸附增加較為緩慢，因?yàn)榇蠖鄶?shù)PQQ 已經(jīng)被洗脫，考慮到盡可能取最適解吸附率，因此選擇3 h 為最適解吸附時(shí)間。

圖7 解吸附時(shí)間對(duì)納米材料解吸附的影響Fig.7 Effect of desorption time on desorption of nanomaterials

2.4 萃取材料的吸附重復(fù)性研究

萃取材料的重復(fù)使用性，是考察萃取材料實(shí)際應(yīng)用的重要性能。本文對(duì)該材料的重復(fù)使用性進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖8 所示，材料循環(huán)使用5 次，吸附量由初次使用時(shí)的160.81 mg·g-1（見(jiàn)2.2.1）下降到145.96 mg·g-1，僅僅下降9.23%，表明該材料具有較好的重復(fù)使用性。

圖8 萃取材料的吸附重復(fù)性研究Fig.8 Adsorption repeatability of extraction materials

3 結(jié)論

本文制備了3 種表面改性磁性納米材料，并研究了這3 種材料對(duì)吡咯喹啉醌的萃取吸附性能，發(fā)現(xiàn)材料3 表面活性基團(tuán)銨根離子與PQQ 羧基形成的離子鍵作用力，以及甲氧基為供電子體的氫鍵作用力和范德華力，對(duì)PQQ 的分子相互作用力最強(qiáng)，吸附量最大。其最適解吸附劑為0.05%氫氧化鈉，解吸附3 h，最大解析率達(dá)87.00%。材料用于吸附、解吸附的重復(fù)使用性較好，連續(xù)使用5 次以上吸附量?jī)H下降9.23%?？傊疚奶剿髁吮砻娓男詫?duì)磁性納米材料PQQ 吸附性能的影響規(guī)律，為PQQ 固相萃取材料開(kāi)發(fā)具有一定的理論指導(dǎo)意義。但是，本文吸附與解吸附是在PQQ 純品溶液中進(jìn)行，為了驗(yàn)證該材料能否大規(guī)模用于PQQ 的分離純化工藝，下一步需要研究利用該材料從發(fā)酵液中萃取分離PQQ 的性能，以期開(kāi)發(fā)高效分離純化PQQ 的磁性固相萃取技術(shù)。