肖 凱，鄧永平,2, ，劉宇馳，劉曉蘭,2，王 燕,2，趙 雨,2

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

阿魏酰低聚糖（Feruloylated oligosaccharides，F(xiàn)Os）由阿魏酸的羧基與低聚糖的羥基通過酯鍵連接構(gòu)成，經(jīng)腸道消化后可釋放阿魏酸和低聚糖，具有較游離阿魏酸更強的抗氧化、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種生理活性[1-4]。2010 年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可將麥麩中提取的FOs 添加到食品中（GRAS NOTICE 000343）。

我國玉米產(chǎn)量位居世界第二，2022 年達(dá)到2.77億噸，其中約25%用于深加工生產(chǎn)玉米淀粉、乙醇等。玉米麩皮是玉米濕法加工生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物，資源豐富[5]。玉米麩皮含粗蛋白約10%、淀粉10%～20%、粗脂肪約6%、纖維10%～20%、半纖維素30%～40%，含阿魏酸約3%[6-7]。目前主要直接作為飼料原料使用，也有少量報道利用玉米麩皮的可發(fā)酵性研制發(fā)酵飼料，但是仍存在附加值較低的問題[8]。研究表明，玉米麩皮中含13%～18%的阿拉伯木聚糖以及3%左右的阿魏酸[9-10]，經(jīng)過水熱預(yù)處理與酶水解結(jié)合法、離子液體預(yù)處理與酶水解結(jié)合法、微生物發(fā)酵法均可水解其糖苷鍵提取FOs[11-15]。與其他方法相比，采用安全微生物發(fā)酵玉米麩皮生產(chǎn)FOs，不僅產(chǎn)物安全性高、成本較低，還能提高膳食纖維等其他功效成分的含量。焦昆鵬等利用平菇發(fā)酵玉米麩皮生產(chǎn)FOs，培養(yǎng)8 d 后發(fā)酵液中FOs 含量為12.515 μmol/L[15]。但是目前以玉米麩皮為原料發(fā)酵生產(chǎn)FOs 的研究較少，亟需開拓發(fā)酵新工藝，以提高FOs 產(chǎn)量，縮短發(fā)酵時間，提高玉米麩皮附加值。

好食脈孢霉（Neurospora sitophila）是“一般認(rèn)為安全”（Generally recognized as safe，GRAS）真菌，該菌在農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物（如麩皮、豆渣等）中生長速度快、代謝旺盛，代謝產(chǎn)物含纖維素酶、木聚糖酶等多種水解酶，對植物纖維類底物具有較強降解能力，同時其氣生菌絲體和孢子中富含類胡蘿卜素[16-18]。前期研究發(fā)現(xiàn)分離自北方發(fā)酵豆制品中的好食脈孢霉菌株在玉米麩皮培養(yǎng)基中生長周期短，F(xiàn)Os 含量相對較高，具有較大開發(fā)價值，本文采用單因素和響應(yīng)面法對其固體發(fā)酵玉米麩皮產(chǎn)FOs 的條件進行了優(yōu)化，以期為提高玉米麩皮生物利用率和附加值提供基礎(chǔ)，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)FOs 提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

好食脈孢霉（Neurospora sitophila） 分離自我國北方發(fā)酵豆制品，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC No.1836；所用試劑均為國產(chǎn)分析純 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

ZHJ-C2109C 型超凈工作臺 上海智城分析儀器有限公司；SPX-150BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；冷凍離心機（CF15RX） 日立（中國）有限公司；分光光度計（TU-1901） 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)：將4 ℃保存的好食脈孢霉菌株轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基中，在28～30 ℃培養(yǎng)72～120 h，PDA 培養(yǎng)基的配制方法見參考文獻(xiàn)[19]。

孢子懸液制備方法：取4 ℃斜面保存的好食脈孢霉菌株，注入無菌水，用接種環(huán)輕刮使孢子散落后回到入裝有玻璃珠和無菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩10 min，使孢子分散，用普通光學(xué)顯微鏡計數(shù)。

固體發(fā)酵：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，加水量15 mL，在121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種好食脈孢霉孢子懸液，接種量為1×106個孢子/瓶，在28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。

1.2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件 氮源種類對FOs 含量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，分別添加玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉和硫酸銨作為氮源，對照組以等量玉米麩皮代替氮源，培養(yǎng)基加水量為15 mL，接種量為1×106個孢子/瓶，在28 ℃條件下培養(yǎng)72 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

氮源添加量對FOs 產(chǎn)量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中豆粕濃度分別為玉米麩皮質(zhì)量的1%、2%、3%、4%、6%、8%和10%（w/w），加水量為15 mL，接種量為1×106個孢子/瓶，28 ℃培養(yǎng)72 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

接種量對FOs 產(chǎn)量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量分別1×104、1×105、1×106、1×107個孢子/瓶，在28 ℃培養(yǎng)72 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

發(fā)酵溫度對FOs 產(chǎn)量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，分別在25、28、31、34 ℃培養(yǎng)72 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

發(fā)酵時間對FOs 產(chǎn)量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕，加水量為15 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，在28 ℃分別培養(yǎng)48、72、96、120、144 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

加水量對FOs 產(chǎn)量的影響：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麩皮、玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕，加水量分別為5、10、15、20、25 mL，接種量為1×105個孢子/瓶，在28 ℃培養(yǎng)72 h 后測定FOs 產(chǎn)量。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert version 13 軟件設(shè)計4 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以FOs 產(chǎn)量為響應(yīng)值進行試驗，試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.3 玉米麩皮FOs 提取和含量測定 發(fā)酵結(jié)束后，取固體發(fā)酵樣品置于烘箱中于45 ℃烘干48 h，將烘干樣品進行粉碎，取干燥發(fā)酵產(chǎn)物以料水比為1:100（g/mL）混合，在水浴鍋中80 ℃浸提30 min，冷卻離心（5000 r/min，10 min），取上清備用。采用雙波長法測定上清液中FOs 濃度[20]，計算方法如下：

式中：A345表示波長345 nm 處的OD 值；A375表示波長375 nm 處的OD 值；b 表示比色皿的厚度，1 cm；C1表示阿魏酸的濃度，mol/L；C2表示阿魏酸低聚糖的濃度，mol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft excel 2016 和SPSS 26.0 進行單因素ANOVA 檢驗，采用多項式對比、方差齊性檢驗和Duncan 氏法進行多重比較。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。利用Design-Expert version 13 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 氮源種類對FOs 產(chǎn)量的影響 玉米麩皮含豐富的碳源，為滿足好食脈孢霉生長代謝產(chǎn)FOs，需要適量補充氮源。以未添加氮源為對照，分別研究添加豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉、硫酸銨對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同氮源對FOs 含量的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on FOs content

如圖1 所示，以豆粕為氮源時發(fā)酵產(chǎn)物中FOs產(chǎn)量顯著高于其他氮源和對照（P＜0.05），以玉米胚芽粕和玉米蛋白粉為氮源時FOs 產(chǎn)量較低，以硫酸銨為氮源時FOs 產(chǎn)量最低。玉米蛋白粉含粗蛋白約60%，顯著高于豆粕（約40%），但是主要由醇溶蛋白和谷蛋白構(gòu)成，水溶性較差，另外，氨基酸組成不平衡，賴氨酸不足[21]，使好食脈孢霉生長代謝不旺盛，導(dǎo)致FOs 產(chǎn)量相對較低，這與植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素、魚醬發(fā)酵受賴氨酸影響相似[22-23]；硫酸銨雖是速效氮源，能為菌株生長提供氮素，但是相比對照組（玉米麩皮等量代替硫酸銨）和其他氮源來說，其營養(yǎng)成分較單一，使菌株生長狀態(tài)不佳，F(xiàn)Os 產(chǎn)量也最低，這與好食脈孢霉發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素的研究結(jié)果相似[24]。綜上，確定發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為豆粕。

2.1.2 豆粕添加量對FOs 產(chǎn)量的影響 豆粕添加量對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響見圖2。

圖2 不同豆粕添加量對FOs 含量的影響Fig.2 Effect of different soybean meal content in medium on FOs content

如圖2 所示，隨著豆粕添加量的提高FOs 產(chǎn)量呈先增加后減小的趨勢。微生物的生長代謝需要適宜的營養(yǎng)物質(zhì)比例，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度較低，導(dǎo)致菌體生長速度緩慢；氮源濃度過高，培養(yǎng)環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)比例失衡，會導(dǎo)致菌體代謝不平衡，生長緩慢[25]。當(dāng)培養(yǎng)基中豆粕添加量為玉米麩皮質(zhì)量的2%（w/w）時，發(fā)酵產(chǎn)物種FOs 含量顯著高于其他豆粕濃度（P＜0.05）。所以，確定培養(yǎng)基中豆粕濃度為玉米麩皮質(zhì)量的2%（w/w）。

2.1.3 發(fā)酵條件對FOs 產(chǎn)量的影響

2.1.3.1 接種量對FOs 產(chǎn)量的影響 接種量是影響發(fā)酵的主要因素，接種量不足會使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度緩慢，生產(chǎn)周期延長，接種量過大則會使底物快速消耗，培養(yǎng)環(huán)境改變，從而影響菌株生長代謝[26]。接種量對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響見圖3。

圖3 不同接種量對FOs 含量的影響Fig.3 Effects of different inoculation sizes on FOs content

如圖3 所示，接種量1×104個孢子/瓶時，F(xiàn)Os 生成量低；接種量較高時，菌體濃度高，營養(yǎng)物質(zhì)消耗速率快，代謝產(chǎn)物的積累使環(huán)境條件發(fā)生改變，影響菌體的生長代謝，導(dǎo)致FOs 的產(chǎn)量低。當(dāng)接種量為1×105個孢子/瓶時，玉米麩皮FOs 產(chǎn)量顯著高于其他接種量（P＜0.05）。因此，確定接種量為1×105個孢子/瓶。

2.1.3.2 發(fā)酵溫度對FOs 產(chǎn)量的影響 發(fā)酵溫度對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響如圖4 所示，隨著玉米麩皮發(fā)酵溫度的提高，玉米麩皮FOs 產(chǎn)量的趨勢是先上升后下降?？赡苁怯捎跍囟容^低時，菌種生命速度緩慢，而當(dāng)溫度超過菌株最適生長溫度時，菌株的生長繁殖受抑制，進而影響到FOs 的產(chǎn)量。當(dāng)溫度為28 ℃時，玉米麩皮FOs 產(chǎn)量有最大值，顯著高于其他溫度（P＜0.05）。所以，確定發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對FOs 含量的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on FOs content

2.1.3.3 發(fā)酵時間對FOs 產(chǎn)量的影響 發(fā)酵時間對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響如圖5 所示，隨著時間的延長玉米麩皮FOs 產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，培養(yǎng)初期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物代謝旺盛，F(xiàn)Os 產(chǎn)量顯著上升；當(dāng)發(fā)酵3 d 時，玉米麩皮FOs產(chǎn)量（1.42 μmol/g）有最大值，顯著高于其他發(fā)酵時間（P＜0.05）；發(fā)酵3 d 后，隨著培養(yǎng)時間的延長，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝物的積累，培養(yǎng)環(huán)境可能不適宜菌體的生長代謝，釋放的FOs 被進一步降解。因此，確定培養(yǎng)時間為3 d。與平菇液體發(fā)酵玉米麩皮產(chǎn)FOs（發(fā)酵8 d，F(xiàn)Os 產(chǎn)量為12.515 μmol/L）[15]和出芽短梗霉發(fā)酵小麥麩皮產(chǎn)FOs（發(fā)酵84 h，F(xiàn)Os 產(chǎn)量為1.123 μmol/L）[27]相比，好食脈孢霉固體發(fā)酵產(chǎn)FOs 的發(fā)酵時間較短。

圖5 不同發(fā)酵時間對玉米麩皮FOs 含量的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on FOs content

2.1.3.4 加水量對FOs 產(chǎn)量的影響 加水量對好食脈孢霉發(fā)酵產(chǎn)FOs 的影響如圖6 所示，在實驗范圍內(nèi)隨培養(yǎng)基加水量的增加FOs 的產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基加水量為15 mL 時FOs 產(chǎn)量最高（P＜0.05）。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量會對培養(yǎng)基的孔隙率產(chǎn)生影響，進而影響培養(yǎng)基的溶氧量、散熱性、粘稠度以及培養(yǎng)基與氧氣的接觸面積，從而對菌體生長產(chǎn)生影響[28-29]。本研究中較高的加水量使培養(yǎng)基變得粘稠，氧氣與菌體接觸面積下降，影響了菌體代謝。因此，確定培養(yǎng)基加水量為15 mL。

圖6 不同加水量對FOs 含量的影響Fig.6 Effects of different water additions on FOs content

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

利用單因素實驗獲得的培養(yǎng)條件最優(yōu)結(jié)果作為設(shè)計各因素水平區(qū)間的依據(jù)，以FOs 的產(chǎn)量為響應(yīng)值，對顯著影響好食脈孢霉固體發(fā)酵制備FOs 的培養(yǎng)條件，包括加水量（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）進行了優(yōu)化，實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and result of response surface experiment

利用Design Expert 13 軟件對表2 中的結(jié)果進行回歸擬合，得到FOs 含量（Y）對A（加水量）、B（接種量）、C（發(fā)酵溫度）、D（發(fā)酵時間）的多項回歸方程：

由表3 可知，回歸方程模型P＜0.0001，表明模型具有極顯著性；回歸方程失擬項P＞0.05，不顯著，表明回歸模型是可靠的；擬合度R2=0.9322，說明擬合值與實際值顯著相關(guān)，模型精確度滿足要求；校正系數(shù)R2adj=0.8644，說明該模型能解釋86.44%響應(yīng)值的變化。由方差分析得到4 個因素對玉米麩皮FOs 產(chǎn)量的影響為：接種量（B）＞發(fā)酵時間（D）＞加水量（A）＞發(fā)酵溫度（C）。一次項B 和二次項A2、B2、C2、D2對FOs 含量影響極顯著（P＜0.01），一次項D對FOs 含量影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of response sueface quadratic model

根據(jù)加水量、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間四個因素交互作用與響應(yīng)值的關(guān)系得出三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖7。

圖7 兩因素交互作用對FOs 含量影響Fig.7 Effect of the interaction between two factors on the water content of FOs content

響應(yīng)面曲面坡度越陡峭，等高線圖越偏橢圓形，因素之間的交互作用則越顯著，反之則表示兩因素間的交互作用不顯著。由圖7 可知，圖7（e）的曲面坡度陡峭程度高于其它各組，等高線也相對密集，表明接種量（B）和發(fā)酵時間（D）的交互作用對FOs 產(chǎn)量的影響高于其它組合對Fos 的影響，與方差分析結(jié)果一致。

回歸方程求解后得知四個因素的最優(yōu)值分別為：加水量15.15 mL、接種量1.17×105個孢子/瓶、發(fā)酵溫度27.91 ℃、發(fā)酵時間75.09 h。結(jié)合實際，將上述優(yōu)化后發(fā)酵條件調(diào)整為：加水量15.2 mL、接種量1.17×105個孢子/瓶、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間75 h。用優(yōu)化后的條件制備FOs，進行9 組平行試驗，產(chǎn)量為（1.52±0.02）μmol/g，與模型預(yù)測的理論值（1.56 μmol/g）接近，表明該模型可以較好地指導(dǎo)好食脈孢霉固體發(fā)酵玉米麩皮生產(chǎn)FOs。

響應(yīng)面法是優(yōu)化發(fā)酵工藝的有效方法之一，卜雯麗等通過響應(yīng)面法優(yōu)化了出芽短梗霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟制備阿魏酰低聚糖的工藝，優(yōu)化后阿魏酰低聚糖含量提高至37.67 μmol/L[30]；陳秋燕等利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母混合發(fā)酵麥麩產(chǎn)阿魏酰低聚糖的工藝，優(yōu)化后其產(chǎn)量（1273.18 nmol/g）較優(yōu)化前提高了94%[31]。在本研究中采用響應(yīng)面法優(yōu)化阿魏酰低聚糖生產(chǎn)工藝是可行的，阿魏酰低聚糖產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了60.83%。

3 結(jié)論

本文對GRAS 菌株好食脈孢霉固體發(fā)酵玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基由玉米麩皮5 g 以及玉米麩皮質(zhì)量2%（w/w）的豆粕組成，加水量為15.2 mL，接種量為1.17×105個/瓶，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為75 h。在優(yōu)化后的條件下FOs 產(chǎn)量為（1.52±0.02） μmol/g，較優(yōu)化前產(chǎn)量（0.94±0.03）μmol/g 提高60.83%。本文采用的固體發(fā)酵方法是對農(nóng)產(chǎn)品的工業(yè)加工副產(chǎn)物資源化、高值化利用的有效途徑，采用該方法生產(chǎn)FOs 對于提升玉米麩皮附加值、延長玉米產(chǎn)業(yè)鏈、增加玉米加工企業(yè)經(jīng)濟效益具有較大的意義，同時為FOs 的發(fā)酵生產(chǎn)提供新方法。后續(xù)需要針對玉米麩皮生產(chǎn)的FOs 的表征及在食品或飼料領(lǐng)域的進一步應(yīng)用開展研究。