梁美春 王萍 張小姣 何秋麗 呂黎 周宜慶 張海旺 茅國(guó)峰 王朵

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染最重要和最具挑戰(zhàn)性的病原體之一，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus au‐reus，MRSA）引起抗菌藥物耐藥性不斷增加而越來(lái)越受到人們的關(guān)注。因此快速準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果對(duì)臨床實(shí)現(xiàn)快、準(zhǔn)、狠的個(gè)性化抗感染精準(zhǔn)治療顯得尤為重要。目前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的體外藥敏試驗(yàn)多數(shù)采用Vitek2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析系統(tǒng)，其自帶的高級(jí)專家系統(tǒng)（advanced expert system，AES）可對(duì)細(xì)菌的藥敏結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)判斷，根據(jù)藥敏結(jié)果綜合分析篩選出MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)，并根據(jù)耐藥表型對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行修正。2016年，梅里埃公司聯(lián)合中國(guó)的行業(yè)專家共同定制出了更符合中國(guó)臨床需求的藥敏卡即中國(guó)定制藥敏卡，其中包括革蘭陽(yáng)性球菌AST-P639藥敏卡，該卡在原來(lái)卡片的基礎(chǔ)上刪除了四環(huán)素、呋喃妥因，增加了頭孢洛林、達(dá)托霉素、替考拉寧等，基本覆蓋了臨床常用的各類抗菌藥物，無(wú)需手工補(bǔ)貼藥敏紙片。為評(píng)估AST-P639中國(guó)定制藥敏卡（以下稱中國(guó)定制卡）對(duì)金黃色葡萄球菌體外藥敏、MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)、AES修正能力的準(zhǔn)確性和可靠性，本研究以美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法、D試驗(yàn)及PCR測(cè)mecA、mecC基因?yàn)閰⒖挤椒?，?duì)中國(guó)定制卡的可靠性進(jìn)行評(píng)估，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2020年5月至2021年9月紹興市人民醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)金黃色葡萄球菌100株，其中痰液35株，膿液15株，手術(shù)切緣14株，分泌物14株，血液6株，滲出液11株，其余5株。

1.2 方法標(biāo)本采集和培養(yǎng)參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版進(jìn)行，血瓊脂平板購(gòu)于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3 儀器與試劑采用梅里埃Vitek MS質(zhì)譜鑒定儀及Vitek2 Compact型自動(dòng)微生物藥敏儀，配套中國(guó)定制卡，均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達(dá)托霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平同時(shí)采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏檢測(cè)，試劑購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司（批號(hào)：VE06160）。紅霉素紙片（規(guī)格：15 μg，批號(hào)：3380421）、克林霉素紙片（規(guī)格：2 μg，批號(hào)：3443630）購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；MH瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)塞默飛公司（型號(hào)：7300PLUS）；Taq酶和PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自杭州擎科生物工程有限公司；電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司（型號(hào)：EPS-300）；紫外成像系統(tǒng)為購(gòu)自法國(guó)Teleflex Incorporated公司（型號(hào)：TFX-20M）。

1.4 藥敏試驗(yàn)質(zhì)譜儀鑒定為金黃色葡萄球菌的菌株，采用PCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌特異性熱核酸酶基因nucA[1]確認(rèn)菌株為金黃色葡萄球菌。采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照CLSIM100 S31[2]判定結(jié)果；中國(guó)定制卡的操作按照廠家說(shuō)明書進(jìn)行，藥敏結(jié)果根據(jù)系統(tǒng)自帶專家系統(tǒng)自動(dòng)給出，質(zhì)控菌株采用ATCC29213。

1.5 MRSA表型測(cè)定及基因確證試驗(yàn)中國(guó)定制卡以頭孢西丁6.00 μg/mL篩選MRSA表型，并根據(jù)頭孢西丁表型結(jié)果對(duì)苯唑西林的藥敏結(jié)果進(jìn)行修正；采用常規(guī)PCR檢測(cè)mecA、mecC基因進(jìn)行確證。MRSA陽(yáng)性質(zhì)控菌株為ATCC43300，MRSA陰性質(zhì)控菌株為ATCC29213。

1.6 DNA的提取用無(wú)菌環(huán)挑取適量金黃色葡萄球菌單個(gè)菌落，于300 μL 0.9%氯化鈉注射液中研磨混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清液，收集菌體。嚴(yán)格按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,并對(duì)提取后的DNA使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度。

1.7 mecA、mecC基因PCR擴(kuò)增mecA、mecC基因的擴(kuò)增根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行，引物序列委托杭州擎科生物工程有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.8 紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)D試驗(yàn)參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版，紅霉素紙片、克林霉素紙片中心點(diǎn)相距為15～20 mm，在靠近紅霉素紙片一側(cè)克林霉素的抑菌環(huán)有截平現(xiàn)象，即D試驗(yàn)陽(yáng)性。中國(guó)定制卡采用微量肉湯稀釋法，以克林霉素0.5 μg/mL和紅霉素0.25 μg/mL來(lái)監(jiān)測(cè)紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥，如果2個(gè)孔都明顯渾濁或都不渾濁，則為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陰性，如果第1個(gè)孔不渾濁而第2個(gè)孔渾濁則為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性。AES根據(jù)紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)克林霉素藥敏結(jié)果進(jìn)行修正。

1.9 相關(guān)定義極大錯(cuò)誤（very major error，VME）：參考方法判讀為耐藥，待測(cè)方法為敏感；大錯(cuò)誤（major error，ME）：參考方法判讀為敏感，待測(cè)方法為耐藥；小錯(cuò)誤（minor error，MIE）：任何一方為中介，另一方為敏感或耐藥。分類一致性（categorical agreement，CA）：待測(cè)方法與參考方法判讀結(jié)果的一致性，如兩者均判讀為敏感、中介或耐藥[5]。

1.10 方法學(xué)比對(duì)當(dāng)待測(cè)方法與參考方法的比對(duì)結(jié)果同時(shí)完全滿足以下要求時(shí)，則為可接受：VME＜1.50%、ME＜3.00%、VME+ME＜5.00%、VME+ME+MIE均＜10.00%（即CA＞90.00%）[5]。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用WHONET 5.6軟件和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.90為一致性非常好，0.75＜Kappa值＜0.90為一致性較好，0.4＜Kappa值≤0.75為一致性中等，Kappa值≤0.4為一致性較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)定制卡體外藥敏結(jié)果可靠性分析與參考方法比較，中國(guó)定制卡對(duì)金黃色葡萄球菌體外藥敏CA為95.38%，VME、ME、MIE分別為0.31%、3.77%、0.54%，均在可接受范圍內(nèi)。其中萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達(dá)托霉素CA均為100.00%，紅霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平的CA分別為95.00%、94.00%、98.00%、97.00%。紅霉素的VME為1.00%，ME為2.00%，MIE為2.00%；左氧氟沙星、復(fù)方新諾明和利福平的ME均為2.00%，利福平出現(xiàn)了1.00%的MIE，而左氧氟沙星出現(xiàn)了4.00%的MIE范圍，但均在可接受范圍內(nèi)。見表1。

表1 中國(guó)定制卡與參考方法間的差異性分析

2.2 MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)結(jié)果可靠性分析將100株金黃色葡萄球菌進(jìn)行DNA提取，采用PCR方法檢測(cè)mecA、mecC基因，檢出mecA 71株，未檢出mecC菌株；采用中國(guó)定制卡篩選出69株MRSA菌株，CA為98.00%。中國(guó)定制卡69株MRSA菌株均檢出mecA基因，2株mecA基因在對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）中檢出。擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增金葡菌mecA基因凝膠電泳圖

中國(guó)定制卡檢出紅霉素耐藥、克林霉素敏感菌株30株，紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性28株，陽(yáng)性率為93.33%（28/30）；D試驗(yàn)檢出紅霉素耐藥、克林霉素敏感菌株27株，D試驗(yàn)陽(yáng)性27株，陽(yáng)性率為100.00%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)2種方法的CA為97.00%。

2.3 中國(guó)定制卡與參考方法的一致性檢驗(yàn)中國(guó)定制卡與參考方法一致性較好（Kappa=0.87，P＜0.01），其中萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑胺、達(dá)托霉素與參考方法完全一致（Kappa=1.00，P＜0.01），MRSA、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)的一致性非常好（Kappa=0.95、0.93，均P＜0.01），克林霉素的一致性較差（Kappa=0.36，P＜0.01），苯唑西林、紅霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、利福平的一致性均為中等。見表1。2.4 AES修正結(jié)果分析及AES修正能力評(píng)估中國(guó)定制卡檢出35株苯唑西林敏感菌株，因頭孢西丁篩選陽(yáng)性，AES將4株苯唑西林敏感菌株修正為耐藥，與參考方法比較修正前CA為97.00%，出現(xiàn)了1.00%VME和2.00%ME。AES修正后雖然CA下降為95.00%，ME也上升至5.00%，但避免了VME的出現(xiàn)。被AES修正為耐藥的4株苯唑西林敏感菌株，經(jīng)PCR證實(shí)均攜帶mecA基因，為MRSA菌株。中國(guó)定制卡檢出73株克林霉素敏感菌株，因紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性，AES將28株克林霉素敏感株修正為耐藥，修正前克林霉素CA為92.00%，VME為1.00%、ME為7.00%；AES修正后雖然避免了VME，但CA下降至66.00%，ME也升至34.00%，遠(yuǎn)超出了VME+ME+MIE＜10.00%的可接受范圍。被AES修正的28株菌株經(jīng)D試驗(yàn)證實(shí)，26株為D試驗(yàn)陽(yáng)性，即AES存在7.14%（2/28）的錯(cuò)誤修正率，見表1。

3 討論

Vitek2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌藥敏儀自動(dòng)化流程操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)觀察，方便快捷。既往研究表明Vitek2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌藥敏儀在測(cè)定臨床常用抗菌藥物的體外藥敏、常見耐藥表型[5]和AES修正系統(tǒng)[6]具有較好的可靠性。中國(guó)定制卡對(duì)金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果、耐藥表型鑒定和AES修正能力目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)定制卡對(duì)金黃色葡萄球菌體外藥敏的CA為95.38%，略低于田月如等[7]報(bào)道的中國(guó)定制卡，略高于喬寧等[8]報(bào)道的非定制卡，其中萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷與參考方法完全一致（CA均為100.00%，Kappa均為1.00，均P＜0.05），由于萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷、達(dá)托霉素對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的抗菌作用，據(jù)CH‐NET網(wǎng)（http://www.chinets.com/Chinet）顯示，截至2022年上半年止，我國(guó)未檢測(cè)出對(duì)萬(wàn)古霉素、替考拉寧、替加環(huán)素、利奈唑烷耐藥的金黃色葡萄球菌，所以不能排除因無(wú)耐藥菌株而導(dǎo)致的高一致性。復(fù)方新諾明、利福平、左氧氟沙星、紅霉素的CA均＞90.00%，但均出現(xiàn)了不同程度的ME，紅霉素甚至出現(xiàn)了1.00%的VME，這可能會(huì)誤導(dǎo)臨床醫(yī)師錯(cuò)誤選擇抗菌藥物而導(dǎo)致治療失敗。紅霉素、左氧氟沙星、利福平分別出現(xiàn)了2.00%、4.00%、1.00%的MIE，提示在中介范圍內(nèi)的抗菌藥物應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

MRSA的耐藥機(jī)制主要是由mecA基因編碼與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力低的PBP2a[9]。mecC基因與mecA基因在DNA水平上約有70%相似性，在氨基酸水平上有63%同源性[10]。mecC基因主要與動(dòng)物有關(guān)，在人類中的患病率極低[11]，目前也德國(guó)、英國(guó)、丹麥、捷克檢出[4，9-10]，國(guó)內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道，本研究也未檢出mecC基因。中國(guó)定制卡篩選的MRSA表型與PCR方法一致性非常好（Kappa=0.95，P＜0.05），CA為98.00%，略高于魏丹丹等[12]報(bào)道的非中國(guó)定制卡。中國(guó)定制卡篩選的MRSA菌株均檢出mecA基因，2株mecA基因在MSSA菌株中檢出，表明定制卡篩選MRSA準(zhǔn)確性高，但還是會(huì)有2%（2/100）的漏檢，應(yīng)引起關(guān)注。

苯唑西林不一致的結(jié)果中，1例菌株肉湯稀釋法判讀為耐藥，而中國(guó)定制卡在AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對(duì)相對(duì)耐藥；5株菌株肉湯稀釋法判讀為敏感而中國(guó)定制卡判讀為耐藥，其中3株AES修正為相對(duì)耐藥，即苯唑西林在AES修正前出現(xiàn)了1.00%的VME，修正后出現(xiàn)了5.00%的ME，同時(shí)修正后的CA值略低于修正前，但在AES修正為相對(duì)耐藥的4株苯唑西林敏感菌株中均檢出mecA基因，即與AES修正相符。多數(shù)情況下攜帶mecA基因或產(chǎn)生PBP2a的金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林耐藥，中國(guó)定制卡檢出6株，肉湯稀釋法檢出7株苯唑西林敏感mecA基因陽(yáng)性菌株（OS-MRSA），其中中國(guó)定制卡中4株苯唑西林敏感菌株AES將其修正為耐藥，即中國(guó)定制卡檢出2株、肉湯稀釋法檢出7株OS-MRSA菌株。有研究認(rèn)為OSMRSA菌株的出現(xiàn)可能與PBP2a蛋白的低表達(dá)[13]、me‐cA基因的不穩(wěn)定[14]、青霉素結(jié)合蛋白4（PBP4）和Fem酶活性以及blaR1基因[15]的缺乏有關(guān)，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。提示當(dāng)存在OS-MRSA菌株時(shí)，中國(guó)定制卡AES修正結(jié)果的可靠性較高，可適當(dāng)避免上述原因造成臨床治療失敗。

克林霉素具有優(yōu)越的藥代動(dòng)力學(xué)，能口服、經(jīng)濟(jì)、有效穿透組織的能力、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性菌引起的感染，尤其可作為青霉素和頭孢菌素過(guò)敏患者的首選藥物。紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性表現(xiàn)為紅霉素耐藥而克林霉素敏感，但在實(shí)際治療中克林霉素的治療是無(wú)效的，故紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)結(jié)果可為臨床規(guī)范使用抗菌藥物提供指導(dǎo)。本研究中國(guó)定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)與D試驗(yàn)一致性非常好（Kappa=0.93，P＜0.01，CA=97.00%），與報(bào)道一致[16]。中國(guó)定制卡檢出紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性而D試驗(yàn)陰性菌株2株，中國(guó)定制卡檢出紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陰性而D試驗(yàn)陽(yáng)性菌株1例，其中國(guó)定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥陽(yáng)性率（93.33%）低于D試驗(yàn)（100.00%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均高于相關(guān)報(bào)道[17]，這可能與各地區(qū)用藥情況和耐藥基因差異有關(guān)。提示中國(guó)定制卡紅霉素誘導(dǎo)克林霉耐藥的準(zhǔn)確性非常高，但應(yīng)注意假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生。

克林霉素不一致的結(jié)果中，1株肉湯稀釋法判讀為耐藥，中國(guó)定制卡在AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對(duì)相對(duì)耐藥；27株肉湯稀釋法判讀為敏感，中國(guó)定制卡AES修正前判讀為敏感，修正后判讀對(duì)相對(duì)耐藥；修正前出現(xiàn)了1.00%的VME，修正后雖然出現(xiàn)了很高的ME（34.00%），一致性也較差（Kappa=0.36），但可以避免誘導(dǎo)性耐藥而錯(cuò)誤的選擇無(wú)效抗菌藥物，同時(shí)應(yīng)注意AES對(duì)克林霉素存在的錯(cuò)誤修正率（7.14%）。因本研究未對(duì)erm基因進(jìn)行檢測(cè)，故不能排除中國(guó)定制卡對(duì)紅霉素誘導(dǎo)克林霉耐藥表型的準(zhǔn)確性、AES錯(cuò)誤修正率存在一定的影響。

綜上所述，Vitek2 Compact AST-P639中國(guó)定制藥敏卡對(duì)金黃色葡萄球菌體外藥敏、MRSA表型、紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥的篩選有高的準(zhǔn)確性，AES對(duì)苯唑西林、克林霉素的修正結(jié)果可以有效避免抗菌藥物的錯(cuò)誤選擇，存在很好的可靠性，且實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，是微生物日常工作中理想的檢測(cè)工具。但由于本研究納入的菌株數(shù)量較少，只對(duì)部分抗菌藥物進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果存在一定的局限性，為使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，有待增加菌株和抗菌藥物以作進(jìn)一步研究。