陳鑫，葉小漢，曹艷紅，郭依寧，莊皓文，王陵軍，冼紹祥，王婷（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院，廣東 東莞 52327；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 50405）

心血管疾病是全球人類死亡的三大主要原因之一[1]。動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是各種心血管疾病如冠心病、心肌梗死等缺血性心臟病和中風(fēng)的重要原因[2]。在AS 的發(fā)生、發(fā)展中，血管平滑肌細(xì)胞是一種重要的細(xì)胞類型[3]；血管平滑肌細(xì)胞的自噬參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，影響AS 晚期病變中斑塊的不穩(wěn)定性[4]。自噬是細(xì)胞在一定刺激條件下所表現(xiàn)出的一種高度保守的分解代謝過(guò)程，在能量缺失、饑餓等情況下可防止細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞生存并對(duì)相應(yīng)刺激做出一定反應(yīng)[5]。在AS 的進(jìn)程中，自噬可以通過(guò)降解受損的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，特別是極化的線粒體，從而保護(hù)受損的平滑肌細(xì)胞；自噬的激活能夠逆轉(zhuǎn)平滑肌細(xì)胞表型向泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞等細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，改善AS[6]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究[6-8]表明，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬能夠穩(wěn)定斑塊、改善AS 及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)將AS 歸納為“痰濁”“瘀血”等范疇[9]，其病位在脈，主要病理特點(diǎn)為氣血運(yùn)行不暢、停聚脈中形成斑塊?；诖瞬±硖攸c(diǎn)，本課題組葉小漢教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出“軟堅(jiān)散結(jié)”法的自擬方——心脈康，該方主要由鱉甲、三棱、莪術(shù)等藥物組成，具有軟堅(jiān)散結(jié)、益氣通脈的功效。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，心脈康能夠改善患者心絞痛癥狀、降低血脂[10]；減少冠心病患者介入治療后血清中炎癥因子的表達(dá)[11]。

目前，心脈康改善AS 患者臨床癥狀的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究擬探討心脈康對(duì)血管平滑肌細(xì)胞自噬的影響，探究心脈康是否通過(guò)增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬水平、降低血脂、穩(wěn)定斑塊，從而改善AS 的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性ApoE-/-小鼠，72 只，SPF 級(jí)，6 周齡，體質(zhì)量（22±3）g，購(gòu)于北京維通利華公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110011211115012385。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0001。飼養(yǎng)環(huán)境的濕度為50%～70%，溫度為19～23 ℃，自由攝食飲水，晝夜各半。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審批號(hào)：20211209002。

1.2 藥物及試劑心脈康由鱉甲、三棱、莪術(shù)等組成，中藥飲片購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部中藥房，按常規(guī)方法煎煮，水煎液過(guò)濾、濃縮至含生藥1.5 g·mL-1；阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：H20 051408；蛋白快速提取試劑盒，Invent 生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào)：SD001；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：P0010；SurePAGE?預(yù)制膠，金瑞斯生物科技有限公司，批號(hào)：M00656；自噬效應(yīng)蛋白1（Beclin-1）抗體、平滑肌22 alpha 蛋白（Smooth muscle 22 α，SM22α）抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：11306-1-AP、60213-1-lg；微管相關(guān)蛋白l 輕鏈3B（Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha，LC3B）抗體、兔二抗、鼠二抗，美國(guó)CST 公司，批號(hào)分別為：12741、7074S、7076S；總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒，南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所，批號(hào)分別為：A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1。

1.3 主要儀器165-8001 電泳儀、1703935 轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、QuantStudio 5 ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器，美國(guó)Thermo 公司；TCS SPEⅡ激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica 公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥將72 只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、陽(yáng)性藥物（阿托伐他汀鈣片）對(duì)照組及心脈康低、中、高劑量組，每組12 只；空白組小鼠喂養(yǎng)常規(guī)飲食12 周，余下各組喂養(yǎng)高脂飲食12 周。高脂喂養(yǎng)12 周之后測(cè)定小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)資料均證實(shí)高脂喂養(yǎng)12 周后能夠成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[12]。模型建立成功后，進(jìn)行給藥，給藥體積為8 mL·kg-1，每日1 次，連續(xù)6 周。根據(jù)體表面積換算法[小鼠每日灌胃劑量=W×成人每日劑量（g·kg-1），W=7.8]計(jì)算，按照60 kg 成人每日臨床用藥量為230 g，心脈康的小鼠等效劑量是每日相當(dāng)于生藥量30 g·kg-1，故設(shè)置心脈康低、中、高給藥劑量分別為30、60、90 g·kg-1；陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予阿托伐他汀鈣片的劑量為2.6 mg·kg-1；其余組灌胃等量蒸餾水。

1.5 小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 含量測(cè)定末次給藥后，將小鼠禁食不禁水12 h，眼球摘除術(shù)采血，4 ℃靜置12 h 后以500×g離心15 min 取血清，-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。

1.6 主動(dòng)脈根部油紅O 染色稱取小鼠體質(zhì)量后，以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠后脫頸椎處死，迅速剪開(kāi)胸腹暴露心臟與主動(dòng)脈，用冰生理鹽水灌注去除主動(dòng)脈內(nèi)殘余血液后，摘取心臟與主動(dòng)脈。小鼠主動(dòng)脈根部組織脫水，OCT 包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度為7 μm，進(jìn)行油紅O 染色。切片置于室溫15 min，PBS 緩沖液浸洗3 次，60%異丙醇浸洗5 min，油紅O 工作液染色30 min，60%異丙醇極化5～7 s，純水充分漂洗；蘇木素染色液染核，水洗返藍(lán)，用純水漂洗1～2 遍；甘油明膠封片，顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 小鼠血管組織HE 染色和Masson 染色心臟與主動(dòng)脈取材方法同“1.6”項(xiàng)，4%多聚甲醛固定小鼠主動(dòng)脈根部血管組織24 h 后逐步對(duì)組織進(jìn)行脫水、透明處理，石蠟包埋切片，厚度為7 μm。HE 染色：將制備好的切片經(jīng)脫蠟、蘇木精、伊紅染色，染色后置于無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，甘油明膠封片。Masson 染色：切片經(jīng)脫蠟、蘇木精染色、Masson 麗春紅染色、醋酸苯胺藍(lán)復(fù)染后無(wú)水乙醇浸洗，二甲苯透明，甘油明膠封片，鏡下觀察組織病理改變。

1.8 免疫熒光法檢測(cè)小鼠血管組織中LC3B 和SM22α 蛋白的表達(dá)組織切片用PBS 緩沖液浸洗3 遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液浸洗3 遍，0.5%Triton-x-100 透膜10 min，3%BSA 溶液（0.5%Triton-x-100 的溶液配置BSA 溶液）室溫封閉非特異性抗原1 h，去除封閉液將配置好的一抗LC3B（1∶150）和SM22α（1∶200）滴加到樣本，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，除去一抗，PBS 緩沖液浸洗3 遍，配置山羊抗兔與山羊抗鼠熒光二抗（1∶500）滴加至樣本，二抗孵育1 h；PBS 緩沖液浸洗3 遍，加入細(xì)胞核染色液DAPI 孵育5 min；PBS 緩沖液浸洗3 遍晾干，封片，共聚焦顯微鏡觀察各組小鼠血管組織熒光變化。

1.9 Western Blot 法檢測(cè)小鼠血管組織中LC3B、Beclin-1、SM22α 蛋白表達(dá)將小鼠血管組織剪碎，采用Invent 蛋白快速提取試劑盒。每100 mg 組織加入1 mL 的裂解液，研磨棒充分研磨，于4 ℃、600×g離心15 min，取上清。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，-80 ℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，采用快速封閉液封閉15 min 后，TBST 洗3 次。置于抗體盒中，4 ℃孵育過(guò)夜。第2 天，TBST洗3 次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，使用ECL顯色液顯色。

1.10 qRT-PCR 法檢測(cè)各組小鼠血管組織中mRNA水平表達(dá)小鼠血管組織總RNA 提取采用RNA TRIzol 提取法，測(cè)定RNA 濃度。使用Fast King RT反逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Select Master Mix 試劑盒進(jìn)行熒光定量分析，ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：50 ℃， 2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40 個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法以GraphPad Prism 5 軟件用于本研究實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)以及作圖，滿足正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)，選用單因素方差分析（One-way ANOVA），Bonferroni 法進(jìn)行事后檢驗(yàn)；若符合正態(tài)分布，不滿足方差齊性則選用非參數(shù)法分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平的影響見(jiàn)圖1。與空白組比較，模型組血清中TC、TG、LDL-C 水平均升高，HDL-C 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組血清中TC、TG、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 心脈康對(duì)Apoe-/-小鼠血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）水平的影響（±s，n=6）Figure 1 Effects of Xinmaikang on serum levels of TC，TG，HDL-c and LDL-c in Apoe-/- mice（±s，n=6）

2.2 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織病理變化的影響見(jiàn)圖2。小鼠血管組織油紅O 染色結(jié)果顯示，空白組主動(dòng)脈根部無(wú)明顯斑塊；模型組主動(dòng)脈根部油紅染色陽(yáng)性區(qū)域較多，可見(jiàn)明顯動(dòng)脈粥樣斑塊病變；心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組病變斑塊明顯減少。Masson 染色結(jié)果顯示，空白組血管組織內(nèi)膜光滑平整；模型組血管組織內(nèi)膜增厚，膠原纖維減少；心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組膠原纖維含量明顯增多。HE 染色結(jié)果顯示，空白組血管組織內(nèi)平滑肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)異常；模型組血管組織可見(jiàn)大量炎癥浸潤(rùn)、膽固醇結(jié)晶和泡沫細(xì)胞堆積，心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組的表現(xiàn)較模型組明顯減少。

圖2 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織病理變化的影響（油紅O、Masson、HE 染色，×40）Figure 2 Effect of Xinmaikang on pathological changes of vascular tissues in ApoE-/- mice（Oil red O，Masson and HE staining，×40）

2.3 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響圖3 的LC3B 和SM22α 免疫熒光共定位染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組LC3B 和SM22α共定位面積百分比降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組LC3B 和SM22α 共定位面積百分比均增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織LC3B 和SM22α 蛋白的影響（免疫熒光，×40）Figure 3 Effects of Xinmaikang on LC3B and SM22α proteins from vascular tissues in ApoE-/- mice（IF，×40）

圖4 的Western Blot 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組LC3B、Beclin-1、SM22α 蛋白表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組LC3B、Beclin-1 和SM22α 蛋白表達(dá)量均明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織LC3B、Beclin-1 和SM22α 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Figure 4 Effects of Xinmaikang on the protein expressions of LC3B，Beclin-1 and SM22 α from vascular tissues in ApoE-/- mice（x ± s，n=6）

2.4 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織相關(guān)mRNA 表達(dá)影響見(jiàn)圖5。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組LC3B、Beclin-1、SM22α mRNA 表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，心脈康各劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組LC3B、Beclin-1、SM22α mRNA 表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 心脈康對(duì)ApoE-/-小鼠血管組織LC3B、Beclin-1 和SM22α mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Figure 5 Effects of Xinmaikang on the mRNA expressions of LC3B，Beclin-1 and SM22α from vascular tissues in ApoE-/- mice（±s，n=6）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）以動(dòng)脈內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膽固醇沉積為主要特征。炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膽固醇沉積會(huì)加劇內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞遷移，從而使含膽固醇的低密度脂蛋白顆粒能夠進(jìn)入并滯留血管壁逐漸形成斑塊，進(jìn)一步導(dǎo)致血管管腔變窄引起一系列心腦血管疾病[13]。目前臨床上對(duì)AS 的治療多以綜合治療（合理飲食、適當(dāng)體力勞動(dòng)和控制易患因素）、藥物治療（降血脂藥物、擴(kuò)張血管藥物和抗血小板藥物）和手術(shù)治療為主。中醫(yī)藥治療AS 能規(guī)避西藥治療中的藥物副作用以及患者不耐受等情況，對(duì)AS 的治療具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，能夠有效抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移、促進(jìn)自噬[14]，是AS 治療的重要組成部分。中醫(yī)學(xué)上認(rèn)為AS 的病機(jī)多為邪氣伏留于脈絡(luò)，導(dǎo)致脈絡(luò)癥積，阻礙氣血[15]，故多運(yùn)用軟堅(jiān)散結(jié)法治療該病。前期臨床研究[16-19]證實(shí)，具有軟堅(jiān)散結(jié)作用的心脈康能夠降低血脂水平、減輕炎癥反應(yīng)進(jìn)而改善AS。

自噬是細(xì)胞的一種分解代謝過(guò)程，能夠通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器，在機(jī)體代謝中發(fā)揮重要作用[20-22]。斑塊不穩(wěn)定性和破裂的風(fēng)險(xiǎn)與小鼠體內(nèi)自噬水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，平滑肌細(xì)胞的自噬水平降低可能導(dǎo)致膠原合成不足、增加斑塊不穩(wěn)定性和破裂風(fēng)險(xiǎn)[23]。自噬能夠通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞遷移、增殖，減少斑塊的形成，延緩AS 的進(jìn)展[24]。因此本研究探討了在AS 過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞自噬的發(fā)展及變化，并進(jìn)一步探討了心脈康是否通過(guò)增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬從而改善AS。

本研究以高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠成功復(fù)制AS動(dòng)物模型。心脈康干預(yù)后，與模型組比較，心脈康各劑量組小鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平明顯降低，HDL-C 水平明顯升高；小鼠血管組織斑塊面積明顯減少。以上結(jié)果提示心脈康能夠降低血脂、改善AS。

在AS 的發(fā)展中，血管平滑肌細(xì)胞自噬缺陷會(huì)激活細(xì)胞凋亡，增加斑塊的不穩(wěn)定性與破裂的風(fēng)險(xiǎn)。因此，血管平滑肌細(xì)胞適度自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抑制AS 的進(jìn)展有重要意義。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，心脈康干預(yù)后，能明顯上調(diào)LC3B，Beclin-1 和SM22α 蛋白以及mRNA 的表達(dá)，明顯增加LC3B 和SM22α 共定位面積，進(jìn)一步證明了心脈康能通過(guò)增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬改善AS。

綜上所述，心脈康可逆轉(zhuǎn)AS 小鼠的自噬缺陷、降低血脂、穩(wěn)定斑塊，延緩AS 的進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬有關(guān)。這為具有軟堅(jiān)散結(jié)作用的心脈康在臨床上治療AS 以及血脂異常提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但心脈康增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞自噬的上游作用機(jī)制通路還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。