王茜，何憶清，蘇艷紅，余歌星，楊碩（. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 40208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 40208）

卵泡發(fā)育障礙引起的無(wú)排卵性不孕占女方因素不孕的25%～30%，嚴(yán)重影響了婦女的生殖健康[1]。卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育中擔(dān)當(dāng)重要角色，顆粒細(xì)胞的增殖與分化能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育與排卵，而顆粒細(xì)胞的凋亡與退化則會(huì)引起卵泡閉鎖[2]。卵巢顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞形成縫隙連接，能與卵母細(xì)胞進(jìn)行雙向代謝物及信息交換，這對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和卵巢顆粒細(xì)胞增殖都至關(guān)重要，此外，顆粒細(xì)胞還能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支持卵母細(xì)胞生長(zhǎng)成熟[1，3-4]?？姑缋帐瞎芗に兀ˋnti-Müllerian hormone，AMH）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）家族的一員，由生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，是卵巢儲(chǔ)備的標(biāo)志物，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有重要作用[5-6]；Smad4是介導(dǎo)TGF-β 信號(hào)通路的核心蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起樞紐作用[7-8]；TGF-β 信號(hào)通路對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、分化以及卵泡發(fā)育均有重要調(diào)控作用，在女性生殖方面有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵泡發(fā)育異常的主要病機(jī)為腎虛血瘀、肝郁血虛，臨床常用補(bǔ)腎疏肝法，療效顯著[9-12]。補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法是國(guó)家級(jí)名中醫(yī)尤昭玲教授結(jié)合數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)提出的針對(duì)引起卵泡發(fā)育異常的原發(fā)痼疾如多囊卵巢綜合征、卵巢早衰和不孕癥等婦科疑難病癥的經(jīng)驗(yàn)療法，以調(diào)周促孕為目的分期調(diào)治，即月經(jīng)周期第1～6 d 以逍遙散為底方調(diào)經(jīng)療疾，月經(jīng)周期第7～16 d 以經(jīng)驗(yàn)方“三子湯”為底方補(bǔ)腎助卵、調(diào)泡促孕[13-14]。本課題組前期臨床研究[15]表明補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法能改善卵巢局部血運(yùn)、細(xì)胞分子微環(huán)境及相關(guān)受體表達(dá)，調(diào)整卵泡形態(tài)、大小、數(shù)量、長(zhǎng)速，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，提高周期排卵率，最終提高臨床妊娠率，但其作用機(jī)理、靶點(diǎn)有待進(jìn)一步闡明。

原代細(xì)胞可以最大程度地保持細(xì)胞初始特性，本研究以大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞為受試對(duì)象，深入探討補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法組方逍遙散和三子湯分別對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、分泌功能的作用及其相關(guān)性，闡釋其調(diào)控卵泡發(fā)育和恢復(fù)卵巢功能的分子機(jī)制，以期為完善中醫(yī)生殖理論，并為補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法的臨床發(fā)展應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雌性SD 大鼠，6～8 周齡20 只，體質(zhì)量220～250 g；21～25 日齡120 只，體質(zhì)量40～60 g，均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：430727211100876658。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，晝夜交替12 h，溫度22～26 ℃，濕度40%～50%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：LL2021042802。

1.2 藥物及試劑逍遙散湯劑組方：柴胡6 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，生姜3 g，薄荷3 g，炙甘草5 g。三子湯組方：菟絲子10 g、覆盆子10 g、桑葚子10 g、生地黃10 g、熟地黃10 g、北沙參10 g、麥冬10 g、炙甘草5 g。以上飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部中藥房。 注射用垂體促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH），100 IU/支，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20210401。大鼠卵巢顆粒細(xì)胞完全培養(yǎng)基，批號(hào)：CM-R050，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG），批號(hào)：hor-272，購(gòu)自以色列PROSPE 公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)：BS350B）、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)：BL503A），購(gòu)自安徽合肥白鯊生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑混合物，批號(hào)：CW2200S，購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；ECL 高效化學(xué)發(fā)光試劑盒，批號(hào)：GE2301-100，購(gòu)自美國(guó)Genview 公司；戊巴比妥鈉，批號(hào)：20210522，購(gòu)自德國(guó)Merck KGaA 公司；AMH、E2、P ELISA 試劑盒，批號(hào)：20220601，購(gòu)自上海撫生生物科技有限公司；卵泡刺激素受體（FSHR）抗體，批號(hào)：22665-1-AP，購(gòu)自中國(guó)武漢Proteintech 公司；抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體（AMHR2）抗體、 Smad4 抗體， 批號(hào)分別為： ab64762、ab40759，購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；抗苗勒氏管激素（AMH）抗體， 批號(hào)： NBP2- 43670， 購(gòu)自美國(guó)NOVUS 公司；GAPDH 抗體，批號(hào)：AF7021，購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)：E-AB-1003）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)：E-BC-K318-M），購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； 超純總RNA 提取試劑盒， 批號(hào)：5003050，購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒，批號(hào)：E047-01B、E096-01A，購(gòu)自上海近岸科技有限公司；AMH、AMHR2、Smad4、GAPDH 引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus 公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司；Axio Vert.A1 倒置顯微鏡，德國(guó)ZEISS 公司；Heraeus Fresco 17 型超速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Cytation 3 型多功能酶標(biāo)儀、T100 Thermal Cycler qRT- PCR 儀、 Chemi- DoCXRS+化學(xué)發(fā)光成像分析儀，美國(guó)Bio-Tek 公司；Mini-PROTEAN Tetra 型電泳槽、Mini Trans-Blot 型轉(zhuǎn)印槽，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.4 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞提取與培養(yǎng)選取21～25 日齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠（每次4～6 只），適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，每只腹腔注射PMSG 80 IU，48 h 后頸椎脫臼法處死。將處死的大鼠置于75% 的酒精中浸泡3 min，剖開腹腔肉眼可見雙側(cè)卵巢表面大量發(fā)育的卵泡；無(wú)菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，放入預(yù)冷含1% 雙抗的PBS 液中，迅速移至超凈工作臺(tái)；在生物放大鏡下分離卵巢的被膜和脂肪，PBS 清洗兩遍，移入含1% 雙抗的DMEM/F12 培基中。用1 mL 注射器針頭刺破發(fā)育成熟的卵泡，充分釋放卵巢顆粒細(xì)胞。收集釋放出來(lái)的細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液用200 目細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，將顆粒細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)和卵母細(xì)胞分離；收集過(guò)濾后的細(xì)胞懸液到15 mL 離心管中，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑17.8 cm）；棄上清，加入1 mL 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞完全培養(yǎng)基，再加入4 mL 紅細(xì)胞裂解液，輕吹混勻，室溫裂解1～2 min，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑17.8 cm），棄上清；加入5 mL 完全培養(yǎng)基重懸，輕吹混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞鑒定將提取的大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞制成2×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，在12 孔板中先放置好細(xì)胞爬片，取1 mL 即2×104個(gè)細(xì)胞接種于孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至70%融合時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板進(jìn)行大鼠卵巢顆粒細(xì)胞鑒定。棄去原培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min；PBS 緩沖液將固定好的細(xì)胞再清洗3 次，每次5 min；加入5% BSA 緩沖液室溫下封閉30 min，倒掉封閉液，不需要洗滌；使用5% BSA 按照1∶200 配制一抗FSHR，加入一抗，搖床1 h，4 ℃孵育過(guò)夜，棄去一抗，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入相應(yīng)的熒光二抗，避光室溫孵育1 h，棄去二抗，PBS 清洗3 次，每次5 min；使用DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，5 min 后PBS 清洗兩次；用抗熒光衰減封片劑進(jìn)行封片。最后使用倒置熒光顯微鏡，鹵素?zé)艄庠醇ぐl(fā)綠色熒光或紅色熒光，進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 含藥血清制備按上述“1.2”項(xiàng)中劑量分別稱取逍遙散湯劑組方及三子湯組方，將兩方中除薄荷、生姜以外的飲片分別混合并浸泡30 min，煎煮2 次。第1 次加10 倍量水，煎煮30 min，第2 次加8 倍量水，煎煮30 min，在煎煮結(jié)束前5 min 加入薄荷、生姜，合并兩次煎液過(guò)濾，濾液減壓分別濃縮至含生藥濃度為1.5、1.2 g·mL-1。FSH 用生理鹽水配制成10 IU·mL-1溶液。參照國(guó)錦等[16]的方法，20 只SPF 級(jí)SD 雌性大鼠，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、陽(yáng)性藥物（FSH）組、逍遙散組，三子湯組，每組5 只。逍遙散、三子湯均以臨床等效劑量的2 倍進(jìn)行灌胃，給藥劑量分別為12、16 g·kg-1；FSH 組以7.8 IU·kg-1皮下注射給藥（劑量按體表面積法根據(jù)臨床等效劑量換算而得）；同時(shí)，空白組、陽(yáng)性藥物組給予與中藥組等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)4 d。各組大鼠均在末次給藥后1 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，隨后頸椎脫臼處死。全血3 000 r·min-1離心15 min，離心半徑為17.8 cm，取上層血清，于恒溫水浴鍋56 ℃滅活30 min，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后分裝，于-80 ℃保存。

1.7 CCK-8 法篩選各組含藥血清最佳干預(yù)濃度提取大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞，制成2×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，每孔100 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2箱中培養(yǎng)48 h。吸去完全培養(yǎng)基，PBS 清洗1 遍，每孔分別加入100 μL 含有5%、10%、15%、20%含藥血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h 后取出96 孔板；吸去舊培養(yǎng)液，PBS 清洗1 遍，將DMEM/F12 培養(yǎng)基與CCK-8 反應(yīng)溶液以9∶1 配制，每孔加入100 μL 在37 ℃、5% CO2箱中繼續(xù)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度（OD），判斷各濃度下細(xì)胞的增殖活性，以此選擇適當(dāng)濃度的含藥血清。若20%為最佳濃度則繼續(xù)設(shè)置含有5%、10%、15%、20%、25%、30%含藥血清的濃度，進(jìn)一步篩選。

1.8 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞，以2×104個(gè)·mL-1的濃度接種于96 孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2箱中培養(yǎng)48 h。吸去完全培養(yǎng)基，PBS 清洗1 遍，每孔分別加入200 μL 各組最佳干預(yù)濃度（“1.7”項(xiàng)篩選的結(jié)果）的含藥血清培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24、48、72、96 h 后取出96 孔板；吸去舊培養(yǎng)液，PBS 清洗1 遍，將DMEM/F12 培養(yǎng)基與CCK-8反應(yīng)溶液以9∶1 配制，每孔加入100 μL 在37 ℃、5% CO2箱中繼續(xù)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度（OD），以吸光度值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.9 細(xì)胞分組及相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度至1×106個(gè)·mL-1接種于6 孔板中，并在每個(gè)孔上隨機(jī)標(biāo)記空白組、陽(yáng)性藥物組、逍遙散組、三子湯組，每組3 個(gè)復(fù)孔。觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至70% 融合時(shí)，分別加入2 mL 各組最佳干預(yù)濃度的含藥血清培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組樣本檢測(cè)。

1.10 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AMH、E2、P 的濃度按“1.9”項(xiàng)下方法分組處理細(xì)胞，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后分裝入凍存管，-80 ℃凍存待用。ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AMH、E2、P 的濃度，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.11 Western Blotting 法檢測(cè)各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2 和Smad4 蛋白表達(dá)的影響按“1.9”項(xiàng)下方法分組處理細(xì)胞，吸去六孔板中原培養(yǎng)基，PBS 潤(rùn)洗2～3 次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮單方向?qū)⒘呀庖哼B同細(xì)胞一同刮下后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，提取細(xì)胞總蛋白。按BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行蛋白濃度測(cè)量，然后配制上樣體系。蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，加入5% 牛奶室溫封閉60 min，分別加入GAPDH（1∶8 000）、AMH（1∶4 000）、AMHR2（1∶4 000）和Smad4（1∶4 000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 清洗3 次，加入山羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃孵育60 min，TBST 清洗3 次；采用ECL 高效化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。

1.12 qRT-PCR 法檢測(cè)各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2 和Smad4 mRNA表達(dá)的影響按“1.9”項(xiàng)下方法分組處理細(xì)胞，吸去六孔板中原培養(yǎng)基，PBS 潤(rùn)洗2～3 次，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，然后轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用qRT-PCR 法檢測(cè)各組中各mRNA 的表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算上述關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：ΔΔCt =（樣品Ct 均值-內(nèi)參照Ct 均值）-（對(duì)照樣品Ct 均值-對(duì)照內(nèi)參照Ct 均值），將各組獲得目的基因和對(duì)照基因Ct 值求平均值，采用相對(duì)定量法計(jì)算各組相對(duì)于空白組的2-ΔΔCt值。qRT-PCR 引物信息見表1。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 qRT-PCR primer information

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞的形態(tài)觀察剛提取的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后，顆粒細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)、增殖；培養(yǎng)48 h 后，顆粒細(xì)胞長(zhǎng)至60%，長(zhǎng)出突觸并相互銜接；培養(yǎng)72 h 后，顆粒細(xì)胞長(zhǎng)至80%，呈梭形并聚集性生長(zhǎng)。具體細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)（×40）Figure 1 Morphology of primary rat ovarian granulosa cells（×40）

2.2 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞純度鑒定的結(jié)果見圖2。運(yùn)用FSHR 免疫熒光特異性染色鑒定大鼠卵巢顆粒細(xì)胞純度。FSHR 陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞漿，呈紅色或綠色；DAPI 將細(xì)胞核染成深藍(lán)色。鏡下可見FSHR 的陽(yáng)性率＞95%，由此可知提取的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞純度達(dá)到95%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞鑒定（×40）Figure 2 Identification of primary ovarian granulosa cells in rats（×40）

2.3 各組含藥血清最佳濃度篩選的結(jié)果見圖3。CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果表明，陽(yáng)性藥物組含藥血清濃度在15%、逍遙散組含藥血清濃度在10%、三子湯組含藥血清濃度在20% 時(shí)OD 值最大，促進(jìn)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖的效果最佳（P＜0.01，P＜0.05）。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中空白組用20% 空白血清干預(yù)；陽(yáng)性藥物組用15% FSH 含藥血清+5% 空白血清干預(yù)；逍遙散組用10% 逍遙散含藥血清+10% 空白血清干預(yù)；三子湯組用20% 的三子湯含藥血清干預(yù)。

圖3 各組含藥血清最佳濃度篩選（±s，n=3）Figure 3 Screening of the optimal concentration of drug-containing serum in each group（±s，n=3）

2.4 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)影響選用“2.3”項(xiàng)下篩選的各組含藥血清最佳濃度干預(yù)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞，CCK-8 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)96 h 細(xì)胞增殖曲線變化來(lái)觀察細(xì)胞增殖過(guò)程，見圖4。24 h 各組細(xì)胞增殖慢，各組間增殖無(wú)差異（P＞0.05）。48 h 各組含藥血清開始啟動(dòng)細(xì)胞增殖，各組間增殖出現(xiàn)差異，逍遙散組細(xì)胞增殖活性開始高于空白組（P＜0.05）；三子湯組細(xì)胞增殖活性開始高于其他3 組（P＜0.01）；陽(yáng)性藥物組細(xì)胞增殖活性與空白組、逍遙散組暫無(wú)差異（P＞0.05）。72 h 各含藥血清組細(xì)胞增殖活性均高于空白組（P＜0.01）；三子湯組細(xì)胞增殖活性高于逍遙散組與陽(yáng)性藥物組（P＜0.01）；逍遙散組與陽(yáng)性藥物組細(xì)胞增殖活性相當(dāng)（P＞0.05）。96 h 各含藥血清組細(xì)胞增殖活性明顯高于空白組（P＜0.01）；逍遙散組細(xì)胞增殖活性高于陽(yáng)性藥物組（P＜0.05）；三子湯組細(xì)胞增殖活性明顯高于陽(yáng)性藥物組與逍遙散組（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，三子湯組促進(jìn)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞增殖作用明顯優(yōu)于其他組，逍遙散組次之；各組顆粒細(xì)胞增殖與含藥血清干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)，干預(yù)48 h 啟動(dòng)細(xì)胞增殖活性，96 h 細(xì)胞增殖達(dá)到高峰。因此選擇含藥血清干預(yù)48 h 即顆粒細(xì)胞增殖啟動(dòng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)開展后續(xù)試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

圖4 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)影響（±s，n=3）Figure 4 Dynamic effect of drug-containing serum of each group on proliferation of primary ovarian granulosa cells in rats（x ± s，n=3）

2.5 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液上清AMH、E2、P 濃度的影響見表2。大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞長(zhǎng)至70% 融合時(shí)，加入各組最佳干預(yù)濃度的含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)48 h，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行檢測(cè)。與空白組比，陽(yáng)性藥物組、逍遙散組、三子湯組卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液上清中AMH、E2、P 濃度均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；逍遙散組、三子湯組與陽(yáng)性藥物組AMH、E2濃度兩兩比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；逍遙散組P濃度與陽(yáng)性藥物組、三子湯組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、E2、P濃度的影響（±s，n=3）Table 2 Effects of the drug containing serum of each group on AMH， E2 and P concentrations of primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

表2 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、E2、P濃度的影響（±s，n=3）Table 2 Effects of the drug containing serum of each group on AMH， E2 and P concentrations of primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥物組比較，#P＜0.05；與逍遙散組比較，△P＜0.05

組別空白組陽(yáng)性藥物組逍遙散組三子湯組培養(yǎng)液上清中AMH、E2、P 的濃度AMH/（pg·mL-1）3 174.48±97.72 4 020.48±246.13*4 095.99±284.67*4 009.26±148.88*P/（ng·mL-1）6.29±0.19 7.84±0.27*9.69±0.60**#8.18±0.55*△E2/（pmol·L-1）27.06±1.83 39.27±3.45*44.30±5.48**42.70±2.50*

2.6 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 蛋白表達(dá)的影響大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合時(shí)，加入各組最佳干預(yù)濃度的含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。與空白組比較，陽(yáng)性藥物組、逍遙散組、三子湯組卵巢顆粒細(xì)胞中AMH、AMHR2、Smad4 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；三子湯組AMH、Smad4 蛋白表達(dá)水平較陽(yáng)性藥物組、逍遙散組升高，但組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性藥物組AMHR2 蛋白表達(dá)較逍遙散、三子湯組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5 和表3。

圖5 各組大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4蛋白的表達(dá)Figure 5 Effects of the drug-containing serum of each group on the protein expressions of AMH，AMHR2 and Smad4 of primary ovarian granulosa cells in rats

表3 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 3 Effects of drug-containing serum of each group on the protein expressions of AMH，AMHR2 and Smad4 of primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

表3 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 3 Effects of drug-containing serum of each group on the protein expressions of AMH，AMHR2 and Smad4 of primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥物組比較，##P＜0.01

組別空白組陽(yáng)性藥物組逍遙散組三子湯組蛋白相對(duì)表達(dá)量Smad4 0.54 ± 0.04 1.02 ± 0.07*0.98 ± 0.08*1.27 ± 0.20**AMH 0.50 ± 0.05 0.85 ± 0.09*0.94 ± 0.07**1.04 ± 0.11**AMHR2 0.50 ± 0.04 1.24 ± 0.07**0.86 ± 0.03**##0.88 ± 0.04**##

2.7 各組含藥血清對(duì)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA 表達(dá)的影響見表4。大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞長(zhǎng)至70% 融合時(shí)，加入各組最佳干預(yù)濃度的含藥血清培養(yǎng)基干預(yù)48 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行mRNA 表達(dá)檢測(cè)。與空白組比較，陽(yáng)性藥物組、逍遙散組、三子湯組卵巢顆粒細(xì)胞中AMH、AMHR2、Smad4 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；三子湯組AMH、AMHR2 mRNA 表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性藥物組及逍遙散組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；逍遙散組與陽(yáng)性藥物組比較AMH、AMHR2 mRNA 表達(dá)水平?jīng)]有差異性（P＞0.05）；逍遙散組、三子湯組與陽(yáng)性藥物組間，Smad4 mRNA 表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 4 Effects of drug-containing serum of each group on the mRNA expressions of AMH，AMHR2 and Smad4 in primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

表4 各組含藥血清對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 4 Effects of drug-containing serum of each group on the mRNA expressions of AMH，AMHR2 and Smad4 in primary ovarian granulosa cells in rats（±s，n=3）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥物組比較，##P＜0.01；與逍遙散組比較，△△P＜0.01

組別空白組陽(yáng)性藥物組逍遙散組三子湯組mRNA 相對(duì)表達(dá)量Smad4 0.89 ± 0.04 1.96 ± 0.38*1.91 ± 0.12*2.48 ± 0.44**AMH 0.82 ± 0.08 2.03 ± 0.05**2.23 ± 0.15**3.35 ± 0.06**##△△AMHR2 0.80 ± 0.02 1.95 ± 0.32*1.87 ± 0.19*3.57 ± 0.4**##△△

3 討論

卵泡是卵巢的功能單位，卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡外層最豐富的細(xì)胞，是卵泡內(nèi)主要的功能細(xì)胞之一，卵泡發(fā)育和閉鎖受到復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格調(diào)控，顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過(guò)程中有重要作用[17]。顆粒細(xì)胞的增殖與分化，可以促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，顆粒細(xì)胞可通過(guò)旁分泌/自分泌作用，為卵母細(xì)胞成熟創(chuàng)造有利的微環(huán)境，幫助卵母細(xì)胞攝取小分子代謝底物，同時(shí)參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟分裂[18-21]。顆粒細(xì)胞的凋亡和退化是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要原因，卵母細(xì)胞退化可發(fā)生在卵泡閉鎖的任何階段[22]。卵母細(xì)胞是女性生殖的重要組成部分，其生長(zhǎng)發(fā)育也與顆粒細(xì)胞密切相關(guān)[23]。體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，保留顆粒細(xì)胞能促進(jìn)更多的卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，且生長(zhǎng)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)顆粒細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞[24]，此結(jié)果表明卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)需要特異性地與顆粒細(xì)胞接觸。

許多研究[25-28]表明，TGF-β 超家族成員在早期卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，同時(shí)TGF-β 超家族成員引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。AMH 是一種由小竇卵泡顆粒細(xì)胞分泌的二聚體糖蛋白，是TGF-β 超家族的成員之一[29-30]，AMH 抑制竇狀卵泡的發(fā)育，在卵泡成熟和發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用[31]。AMH 在卵巢中起到平衡生長(zhǎng)卵泡過(guò)度募集的作用，防止卵泡儲(chǔ)備過(guò)早耗盡，調(diào)控卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)優(yōu)勢(shì)卵泡成熟并排出，通過(guò)自/旁分泌調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖分化[32]，是評(píng)估卵巢反應(yīng)性和儲(chǔ)備功能的標(biāo)志[33]。有實(shí)驗(yàn)研究[34]表明沉默體外培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的AMH 基因后，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的增殖降低，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞周期阻滯在G1 期。AMHR2 是一種跨膜糖蛋白，是AMH 的特異性受體，主要分布于細(xì)胞膜，在卵巢中主要分布于顆粒細(xì)胞表面，AMH 調(diào)控卵泡發(fā)育與成熟主要通過(guò)與其受體結(jié)合而發(fā)揮作用[35-36]。TGF-β/Smad 通路是調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路，Smad4 是該信號(hào)通路的核心下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是超家族信號(hào)由胞質(zhì)傳遞至胞核的必需因子。Smad4和Smad4 依賴性TGF-β 信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)與卵泡發(fā)育有關(guān)，尤其與卵泡閉鎖關(guān)系密切[37-38]， Smad4 減少會(huì)降低顆粒細(xì)胞的增殖潛能并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致濾泡萎縮[39-40]。實(shí)驗(yàn)研究[41]表明沉默顆粒細(xì)胞的Smad4 可以明顯抑制顆粒細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，Smad4 的正常表達(dá)是顆粒細(xì)胞順利通過(guò)G1/S 檢驗(yàn)點(diǎn)的必要條件，Smad4 表達(dá)下降，將導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的多種周期基因不能正常表達(dá)，從而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制顆粒細(xì)胞增殖。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)“卵泡發(fā)育異?！钡牟∶涊d，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)月經(jīng)后期、月經(jīng)量少、閉經(jīng)、不孕等范疇。腎為先天之本，元?dú)庵?，既藏先天之精，又藏后天之精，為生殖發(fā)育之源，腎之精氣陰陽(yáng)是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的基本物質(zhì)與動(dòng)力。肝藏血，主疏泄，是調(diào)節(jié)女性生殖的主要樞紐。女子以血為本，卵泡發(fā)育成熟也離不開肝血的濡養(yǎng)，腎精能生血，血能養(yǎng)精，精血同源互化，共同促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟。逍遙散出自宋《太平惠民和劑局方》，是臨床治療月經(jīng)病、不孕癥等婦科疾病的常用方，被葉天士稱贊為“女科圣藥”，方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、生姜、薄荷、甘草組成，諸藥合用，可使肝郁得疏，血虛得養(yǎng)，脾弱得復(fù)，氣血兼顧，肝脾同調(diào)，以達(dá)肝經(jīng)、沖任氣血調(diào)暢之功。三子湯為全國(guó)名中醫(yī)尤昭玲教授的自擬經(jīng)驗(yàn)方，方由菟絲子、覆盆子、桑葚子、生地黃、熟地黃、北沙參、麥冬、炙甘草等組成，全方相合，腎肝脾同補(bǔ)，護(hù)卵養(yǎng)泡以助孕。夏冰等[42]實(shí)驗(yàn)研究表明補(bǔ)腎調(diào)沖方含藥血清能促使顆粒細(xì)胞由G0/G1 期向S 期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)甾體激素的分泌功能。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[12]表明補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸通過(guò)影響促排卵小鼠排卵前卵巢卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9、BMP-15 mRNA 及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖、卵丘擴(kuò)散、卵母細(xì)胞成熟，進(jìn)而誘發(fā)排卵；范麗潔[43]用逍遙丸和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)逍遙丸可通過(guò)上調(diào)GDF-9Ⅱ型受體蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)控卵泡發(fā)育，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過(guò)調(diào)控SmadsⅠ型受體蛋白表達(dá)影響下游信號(hào)分子來(lái)調(diào)控卵泡發(fā)育。上述大量研究從動(dòng)物、顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞不同層面，不同分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，不同實(shí)驗(yàn)方法多方面驗(yàn)證了補(bǔ)腎疏肝可以促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟。本研究以大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞為載體，深入探討補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法組方促進(jìn)卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖、甾體激素分泌以及與AMH、AMHR2、Smad4 之間可能的關(guān)系，進(jìn)一步闡釋其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)初步篩選了補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法組方逍遙散、三子湯含藥血清的最佳干預(yù)濃度、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖啟動(dòng)時(shí)間，初步證實(shí)逍遙散、三子湯含藥血清均能促進(jìn)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞增殖，作用明顯優(yōu)于陽(yáng)性藥物（FSH）組，其中三子湯組作用最佳，逍遙散次之，并與干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)性。ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明逍遙散、三子湯均能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)AMH、E2、P 的合成與分泌，其中促進(jìn)AMH 和E2合成與分泌作用與陽(yáng)性藥物效果相當(dāng)。Western Blot 及PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，逍遙散、三子湯均可上調(diào)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞AMH、AMHR2、Smad4 蛋白及mRNA 表達(dá)，其中三子湯組AMH、AMHR2 mRNA表達(dá)水平明顯高于陽(yáng)性藥物（FSH）組與逍遙散組；除陽(yáng)性對(duì)照組AMHR2 蛋白表達(dá)明顯外，其余各組作用與陽(yáng)性藥物組相當(dāng)。

綜上所述，補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法組方逍遙散、三子湯能促進(jìn)大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞增殖并與干預(yù)時(shí)間呈正相關(guān)性，促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌甾體激素和AMH，并可能通過(guò)上調(diào)AMH、AMHR2、Smad4 蛋白及mRNA 表達(dá)，促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟。此為項(xiàng)目組進(jìn)一步開展補(bǔ)腎調(diào)泡周期療法對(duì)“卵泡發(fā)育異?！闭{(diào)控機(jī)制及量效關(guān)系研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。