周晶，吳達(dá)瑩，楊清，肖喜，張珍珍，張選奮（. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院整形外科，甘肅 蘭州 730030；.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

糖尿病創(chuàng)面是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，其以創(chuàng)面內(nèi)高血糖為主要特征，伴有微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)失調(diào)及氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞等[1]特點(diǎn)，在愈合過(guò)程中難以建立起適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，最終造成難愈結(jié)局。中醫(yī)將糖尿病創(chuàng)面歸于“瘡瘍”“潰瘍”范疇，病機(jī)主歸為“邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p”等，久之則現(xiàn)氣血不足，腐肉不消，新肉難生[2]。目前，針對(duì)糖尿病創(chuàng)面的傳統(tǒng)治療方法有生長(zhǎng)因子制劑[3]、高壓氧[4]、光生物調(diào)節(jié)[5]及生物工程皮膚替代物[6]等，盡管取得部分療效，但多存在治療不便利和費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，難以在臨床上推廣。中藥治療糖尿病創(chuàng)面已被證實(shí)具有療效確切、副反應(yīng)少及價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)廣泛受到關(guān)注[7]。

葛根素是中草藥類(lèi)植物葛根的異黃酮類(lèi)活性成分，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[8-9]證實(shí)其具有降低血糖、改善循環(huán)、抗炎及抗氧化等作用，且安全性良好，可改善糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病心肌損傷缺血等多類(lèi)糖尿病并發(fā)癥，但其對(duì)糖尿病創(chuàng)面的作用效果尚未明確。葛根素水凝膠[10]是一種無(wú)需任何化學(xué)修飾的自組裝天然水凝膠，制備流程簡(jiǎn)易，且成分單一，使用方便[11]。

本研究擬探索葛根素水凝膠在促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面血管形成及愈合中的作用，以期為葛根素水凝膠應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面的治療提供初步的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，7 周齡，體質(zhì)量（190±10）g，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（甘）2020-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0002491，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，溫度22～26 ℃，濕度45%～55%，可模擬晝夜光線。本研究已通過(guò)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查，批件編號(hào)：D2022-001。

1.2 藥物及試劑葛根素購(gòu)自西安欣祿生物科技有限公司，純度≥98%，分子量：416.38，CAS：3681-99-0；PBS、1%鏈脲佐菌素、蘇木素-伊紅染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)依次為：P1032、IS0250、G1120；Weiger 鐵蘇木素染液、麗春紅酸性品紅染液，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)依次為：GL0438、RFT056；BCA 試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：CW0014；兔源性CD31 多克隆抗體、兔源性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 等，購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司，批號(hào)依次為：AF6191、AF5131、S0002。

1.3 儀器GA-3 型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；PB303-S 型精密電子天平，上海Mettler toledo公司；Leica RM2235 型切片機(jī)，德國(guó)Leica 公司；DHG-9140A 型烤箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；MM800 型光學(xué)顯微鏡， 日本 Olympus 公司；PowerPac Basic 型電泳儀，美國(guó)Bio-rad 公司；WD-9405B 型脫色搖床，北京六一儀器廠；Gbox chemi XX9 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，英國(guó)Syngene 公司。

1.4 藥物制備葛根素水凝膠以葛根素為藥理活性成分，以磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）為載體制成。預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)葛根素水凝膠最低成膠濃度為1%，6%[10]及更高濃度的葛根素水凝膠硬度明顯增加。為避免過(guò)硬水凝膠對(duì)創(chuàng)面造成機(jī)械損傷，故制備1%、2%及4%葛根素水凝膠。以1%葛根素水凝膠制備流程為例：電子秤精確稱(chēng)取葛根素粉末10 mg 置于1 mL PBS 中，酒精燈加熱至100 ℃，直至葛根素粉末完全溶解呈清亮透明狀態(tài)，室溫下冷卻5～10 min 即可形成“果凍樣”水凝膠。2%和4%葛根素水凝膠則分別稱(chēng)取葛根素粉末20、40 mg，同法制備。

1.5 模型復(fù)制、分組及給藥方法將45 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，再給予高糖、高脂飲食4 周，然后腹腔一次性注射40 mg·kg-1鏈脲佐菌素，3d 后若空腹血糖值≥16.7 mmol·L-1，并伴多飲、多食及毛發(fā)松散枯黃等癥狀視為糖尿病大鼠造模成功[12]。將造模成功的36 只大鼠隨機(jī)分為4 組，依次標(biāo)記為對(duì)照組、1%葛根素組、2%葛根素組和4%葛根素組。第0 天時(shí)進(jìn)行皮膚創(chuàng)面制作，首先以直徑2.0 cm 的圓形創(chuàng)面模具進(jìn)行標(biāo)記，再按標(biāo)記痕跡以組織剪逐層剪除全層皮膚，無(wú)菌紗布?jí)浩戎寡?。?duì)照組創(chuàng)面以PBS 濕敷處理，各葛根素組創(chuàng)面以無(wú)菌棉簽涂抹對(duì)應(yīng)濃度葛根素水凝膠，涂抹范圍至少超出創(chuàng)緣2.0 mm，用無(wú)菌紗布覆蓋后妥善固定。

1.6 創(chuàng)面愈合觀察和標(biāo)本切取分別于給藥的第3、7 和14 天進(jìn)行拍照記錄。使用Image pro plus 6.0 軟件做創(chuàng)面面積測(cè)量，取同一時(shí)刻點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面面積求平均值。按公式：創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-實(shí)際創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積× 100%，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。拍照后，用齒鑷及手術(shù)刀剔除創(chuàng)面痂結(jié)，充分暴露創(chuàng)面，于創(chuàng)緣外2.0 mm 處完整切除創(chuàng)面組織，生理鹽水沖洗血漬。將取下的創(chuàng)面組織的1/4 用液氮保存，其余部分以4%多聚甲醛溶液固定。

1.7 HE 及Masson 染色取4%多聚甲醛溶液中固定的創(chuàng)面組織標(biāo)本，依次經(jīng)梯度乙醇溶液脫水和二甲苯透明，石蠟包埋后制作4 μm 厚切片。染色前在60 ℃烤箱中烘烤30 min 后做組織切片的脫蠟及水化處理。HE 染色時(shí)，使用蘇木素染液浸染5 min，流水沖洗后用1%鹽酸酒精分化5 s，返藍(lán)；1%伊紅染液染90 s，梯度酒精脫水及二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。Masson 染色時(shí)，取脫蠟并水化后切片置于Bouin 氏液糟中常溫過(guò)夜固定8 h，流水沖洗后以Weiger 鐵蘇木素試劑滴染組織10 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化后返藍(lán)；麗春紅酸性品紅液滴染組織5 min，蒸餾水沖洗后浸入1%磷鉬酸水溶液浸泡5 min，苯胺藍(lán)液染色，1%冰醋酸浸泡1 min 后進(jìn)行脫水與透明化處理，中性樹(shù)膠封片。200 倍顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織毛細(xì)血管分布、纖維化等組織學(xué)變化，拍照后使用Image pro plus 6.0 軟件測(cè)量膠原纖維面積。

1.8 VEGF 免疫組織化學(xué)染色取石蠟切片按“1.7”項(xiàng)下方法做脫蠟及水化處理后，將切片置于高壓鍋中行檸檬酸抗原修復(fù)5 min，5% BSA 避光封閉1 h，按1∶200 濃度滴加兔源性VEGF 多克隆抗體（一抗）后4 ℃過(guò)夜。再按1∶500 濃度加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（二抗）后孵育50 min，DAB 顯色后以蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核5 min，脫水及透明化處理，中性樹(shù)膠封片。400 倍顯微鏡下隨機(jī)取3 個(gè)不重疊視野進(jìn)行拍照，VEGF 強(qiáng)陽(yáng)性在視野下表現(xiàn)為棕褐色團(tuán)塊，Image pro plus 6.0 軟件測(cè)量VEGF 的積分光密度（Integrated option density，IOD）。

1.9 微血管密度（Microvessel density，MVD）測(cè)量進(jìn)行CD31 免疫組織化學(xué)染色，一抗采用1∶1 000 濃度的兔源性CD31 多克隆抗體，二抗使用1∶500 濃度的HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體，余步驟同“1.8”項(xiàng)下。400 倍視野下隨機(jī)取3 個(gè)不重疊視野拍照，視野下棕褐色內(nèi)皮細(xì)胞圍成的管腔且與周?chē)忻鞔_界限則視為一條微毛細(xì)血管，以Image pro plus 6.0 軟件計(jì)數(shù)。

1.10 Western Blot 法檢測(cè)VEGF 蛋白表達(dá)取液氮中保存的創(chuàng)面組織標(biāo)本，滴加裂解液（RIPA∶PSMF=100∶1）后冰上研磨、裂解，4 ℃條件下以12 000 r· min-1（離心半徑8 cm）離心10 min 后使用移液槍吸取上清蛋白液至干燥EP 管內(nèi)，BCA 法測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算上樣量。電泳轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉搖床封閉1 h，按1∶1 000 濃度滴加兔源性VEGF 多克隆抗體后4 ℃過(guò)夜。洗膜后加入按1∶10 000 濃度稀釋的HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體，室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后滴加發(fā)光液顯色，使用Image pro plus 6.0 軟件計(jì)算灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間整體比較用F檢驗(yàn)，內(nèi)部各組間事后比較采用LSD 法。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚創(chuàng)面愈合情況如圖1 和表1 所示，隨著時(shí)間推移，各組創(chuàng)面均逐漸縮小。與對(duì)照組比較，各葛根素組創(chuàng)面愈合趨勢(shì)增加，其中以4%葛根素組愈合率最優(yōu)（P＜0.01）。

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率（±s，%；n=9）Table 1 Skin wound healing rate of rats in each group after the treatment of puerarin hydrogel（±s，%；n=9）

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率（±s，%；n=9）Table 1 Skin wound healing rate of rats in each group after the treatment of puerarin hydrogel（±s，%；n=9）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與1%葛根素組比較，##P＜0.01；與2%葛根素組比較，△△P＜0.01

第14 天65.12±2.10 67.90±1.44 73.04±1.70**##80.69±1.28**##△△51.057＜0.01分組對(duì)照組1%葛根素組2%葛根素組4%葛根素組F 值P 值第3 天9.75±2.80 10.83±3.60 12.45±2.93 16.23±2.54**##△△8.108＜0.01第7 天25.95±3.24 48.74±2.86**50.88±3.46**64.05±3.21**##△△154.782＜0.01

圖1 葛根素水凝膠治療后大鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況Figure 1 Skin wound healing of rats in each group after the treatment of puerarin hydrogel

2.2 創(chuàng)面組織學(xué)變化如圖2 所示，HE 及Masson 染色結(jié)果顯示，第7 天時(shí)，對(duì)照組血管形成困難，膠原纖維較稀疏，排列紊亂；各葛根素組表現(xiàn)為不同程度的薄壁毛細(xì)血管增生及膠原分布，其中以4%葛根素組肉芽形成數(shù)量最多，膠原纖維最豐富。第14 天時(shí)，對(duì)照組形成少量薄壁毛細(xì)血管，管腔不規(guī)則，膠原較前稍致密，排列仍欠規(guī)則；各葛根素組毛細(xì)血管數(shù)量增多，并出現(xiàn)管腔狹窄及管壁增厚等愈合后期改變，膠原纖維更加豐富與致密，排列基本趨向規(guī)則，以4%葛根素組最為明顯。

表2 為各組大鼠創(chuàng)面在不同時(shí)間點(diǎn)膠原纖維相對(duì)面積的比較。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組比較，各葛根素各組膠原纖維相對(duì)面積逐漸增大。其中以4%葛根素效果最佳（P＜0.01）。

表2 葛根素水凝膠對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面組織內(nèi)膠原纖維面積的影響（±s，%；n=3）Table 2 Effect of puerarin hydrogel on the area of collagen fibers of wounded skin in rats（±s，%；n=3）

表2 葛根素水凝膠對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)面組織內(nèi)膠原纖維面積的影響（±s，%；n=3）Table 2 Effect of puerarin hydrogel on the area of collagen fibers of wounded skin in rats（±s，%；n=3）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與1%葛根素組比較，##P＜0.01；與2%葛根素組比較，△△P＜0.01

第14 天30.56±0.86 41.51±2.68**54.83±2.60**##70.84±2.86**##△△159.049＜0.01分組對(duì)照組1%葛根素組2%葛根素組4%葛根素組F 值P 值第7 天20.69±1.52 33.78±1.97**41.68±2.25**##59.09±1.64**##△△222.133＜0.01

2.3 葛根素水凝膠對(duì)創(chuàng)面內(nèi)VEGF IOD 的影響如圖3 所示，第7 天時(shí)，與對(duì)照組創(chuàng)面內(nèi)VEGF IOD（12 184.18±1 008.65）比較，1%、2%和4%葛根素組IOD 依次為（26 156.41±1 066.81）、（40 029.85 ±1 091.36）和（84 130.61±2 409.86）；第14 天時(shí)，與對(duì)照組創(chuàng)面內(nèi)VEGF IOD（21 434.16±2 011.40）比較，1%、2%和4%葛根素組IOD 依次為（54 734.60±3 454.35）、（80 965.60±3 814.17）和（131 271.98±4 244.21）。兩時(shí)刻點(diǎn)葛根素組IOD 均高于相應(yīng)的對(duì)照組（P＜0.05），4%葛根素組均高于同一時(shí)刻點(diǎn)的其他濃度葛根素組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高濃度葛根素水凝膠可能對(duì)VEGF 的促分泌作用更強(qiáng)。

圖3 葛根素水凝膠對(duì)大鼠創(chuàng)面內(nèi)VEGF 積分光密度（IOD）的影響（×400；±s，n=3）Figure 3 Effect of puerarin hydrogel on integrated optical density（IOD）of VEGF in wounded skin from each group of rats（×400；±s，n=3）

2.4 葛根素水凝膠對(duì)創(chuàng)面MVD 的影響如圖4 所示，第7 天時(shí)，與對(duì)照組創(chuàng)面內(nèi)MVD[（15.23±0.60）根·mm-2]比較，1%、2%和4%葛根素組MVD 依次為（27.07±2.66）、（41.01±2.31）和（73.52±2.47）根·mm-2；第14 天時(shí)，與對(duì)照組創(chuàng)面內(nèi)MVD[（34.06±1.36）根·mm-2]比較，1%、2%及4%葛根素組MVD 依次為（44.90±5.40）、（72.58±2.10）和（96.62±6.60）根·mm-2，兩時(shí)刻點(diǎn)各葛根素組MVD 相較于相應(yīng)對(duì)照組均明顯增加（P＜0.05），其中4%葛根素組MVD 高于同一時(shí)刻點(diǎn)的其他濃度葛根素組（P＜0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，葛根素水凝膠可能對(duì)CD31 具有較強(qiáng)的促分泌效應(yīng)，在促進(jìn)創(chuàng)面微血管形成方面有積極意義。

圖4 葛根素水凝膠對(duì)大鼠創(chuàng)面內(nèi)MVD 的影響（×400；±s，n=3）Figure 4 Effect of puerarin hydrogel on microvascular density（MVD） in wounded skin from each group of rats（×400；±s，n=3）

2.5 Western Blot 法檢測(cè)VEGF 蛋白表達(dá)如圖5所示，第14 天時(shí)，與對(duì)照組比較，1%、2%和4%葛根素組VEGF 蛋白表達(dá)量均增高（P＜0.01）；與其他濃度葛根素組比較，4%葛根素組VEGF 蛋白表達(dá)量最高（P＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 第14 天時(shí)葛根素水凝膠對(duì)大鼠創(chuàng)面內(nèi)VEGF 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 5 Effect of puerarin hydrogel on VEGF protein expression in wounded skin from each group of rats at 14 days（±s，n=3）

3 討論

糖尿病創(chuàng)面是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病率約為20%，通常表現(xiàn)為持續(xù)性的潰瘍、深部感染或壞死，已成為非創(chuàng)傷性截肢的主要原因[13]。中醫(yī)理論認(rèn)為“氣血相生”“養(yǎng)血生氣，活血通絡(luò)”，糖尿病創(chuàng)面內(nèi)氣血不足，自然表現(xiàn)出難愈之象。西醫(yī)觀念同樣強(qiáng)調(diào)修復(fù)血管、維持循環(huán)是創(chuàng)面愈合的根本[1]。因此，創(chuàng)面組織內(nèi)微循環(huán)狀態(tài)是影響糖尿病創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素。

VEGF 是迄今發(fā)現(xiàn)的最具特異性的促血管生成因子，在誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及改善血管內(nèi)皮細(xì)胞間通透性等方面具有重要意義，能夠在增加血管密度的基礎(chǔ)上明顯提升營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物交換效率[14]。CD31 屬于免疫球蛋白超家族的成員，可表達(dá)于各類(lèi)免疫細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，參與血管生成，其經(jīng)常用以反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成情況[15]。在高糖環(huán)境下，受異常炎癥、氧化等[16-17]因素影響，糖尿病創(chuàng)面微循環(huán)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，誘導(dǎo)創(chuàng)面內(nèi)微血管形成的主要催化因子如VEGF、CD31 等表達(dá)減少，同時(shí)伴有血管管壁的動(dòng)脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致管腔狹窄，營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣得不到有效輸送，造成組織修復(fù)的能力下降[1]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[18]證實(shí)，中藥成分葛根素在改善微循環(huán)方面具有重要意義，可有效治療糖尿病及其多種血管性并發(fā)癥（如糖尿病視網(wǎng)膜及心肌病變等）。前期研究[19]發(fā)現(xiàn)，葛根素具有識(shí)別性結(jié)合并激活瞬時(shí)受體電位香草醛4 的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性血管舒張，增加局部血流量。另有證據(jù)[20]表明，葛根素能夠劑量依賴(lài)性地促進(jìn)血清中一氧化氮及前列腺素I2 等多種擴(kuò)血管物質(zhì)的表達(dá)，并具有抑制血管平滑肌遷移及改善血管重塑的作用，加速再內(nèi)皮化過(guò)程。由此可見(jiàn)，葛根素對(duì)循環(huán)的改善作用十分明顯，但其對(duì)糖尿病創(chuàng)面內(nèi)微血管的影響尚不明確。陳敏生等[10]證實(shí)葛根素具有能夠天然自組裝形成水凝膠這一重要特性，故其具有創(chuàng)面應(yīng)用的潛力。本研究使用葛根素水凝膠的對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面進(jìn)行濕敷以研究其創(chuàng)面應(yīng)用時(shí)的功效。創(chuàng)面組織切片HE 和Masson 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，葛根素水凝膠能夠明顯促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織的形成和膠原纖維沉積，表現(xiàn)出更顯著的愈合趨勢(shì)。免疫組織化學(xué)染色和Western Blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葛根素水凝膠可明顯上調(diào)促血管因子VEGF 和CD31 的表達(dá)，增加微血管數(shù)量，表現(xiàn)出明顯的益氣補(bǔ)血、活血通絡(luò)之功效。而葛根素水凝膠的優(yōu)勢(shì)在于其取材簡(jiǎn)單、制作方便，但其是否存在潛在細(xì)胞毒性及遠(yuǎn)期不良反應(yīng)本研究尚未驗(yàn)證。

綜上，葛根素水凝膠可能具有促進(jìn)創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF 和CD31 的表達(dá)的作用而誘導(dǎo)微血管形成，同時(shí)有助于創(chuàng)面組織膠原纖維的沉積，在整體上呈濃度依賴(lài)型，對(duì)促糖尿病創(chuàng)面愈合具有積極意義。