蘇欣欣 李曉陽 鄒丹 楊麗華

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。卵巢癌易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,具有很高的死亡率[1]。胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase, TYMS)是一種參與DNA復(fù)制和修復(fù)的酶[2]。目前有研究報(bào)道,TYMS在乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌中高表達(dá)且與不良臨床結(jié)果相關(guān)[3-6],但未見TYMS在卵巢癌中的研究報(bào)道。本研究以生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ),對(duì)EOC中TYMS的表達(dá)及其相關(guān)基因的生物學(xué)功能、信號(hào)通路進(jìn)行分析。

資料與方法

一、資料

1.Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)[7]。

2.cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)是一個(gè)用于探索分析和可視化多維癌癥基因組學(xué)和臨床數(shù)據(jù)的開放源代碼平臺(tái)[8]。

3.STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/;version 11.0)是一個(gè)可用于預(yù)測(cè)和跟蹤蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)[9]。

4.DAVID軟件(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp; version 6.8)是一個(gè)集成了生物數(shù)據(jù),用于注釋,可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫[10]。GO分析闡明與基因相關(guān)的潛在生物過程(BP),分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)。KEGG整合了大量由高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)生的實(shí)用數(shù)據(jù)庫資源。

5.Sangerbox(http://www.sangerbox.com/tool)工具是一個(gè)免費(fèi)的在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)。

二、方法

1.Oncomine數(shù)據(jù)庫分析TYMS表達(dá)情況:本研究應(yīng)用Oncomine 平臺(tái)分析TYMS在卵巢癌和正常卵巢樣本中的表達(dá)情況,輸入TYMS基因并設(shè)置為“ovarian cancer、mRNA或DNA、Differential Analysis Cancer vs.Normal Analysis”進(jìn)行表達(dá)分析,其閾值為P值<0.05。

2.cBioPortal數(shù)據(jù)庫挖掘TYMS相關(guān)基因:本研究中cBioPortal用于挖掘TYMS在卵巢癌中的相關(guān)基因,選擇用于可視化和分析的研究,并設(shè)置為“Ovarian Serous Cystadenocarcinoma(TCGA, Nature 2011)、TYMS”,點(diǎn)擊“Network”,查看與TYMS基因關(guān)系密切的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,共有39個(gè)基因。

3.STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建TYMS相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò):本研究使用STRING構(gòu)建TYMS及相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),將TYMS及其相關(guān)基因?qū)搿癕ultiple proteins”中,并設(shè)置為“Homo sapiens”,其閾值為交互關(guān)系置信度>0.4,獲取圖表。

4.DAVID軟件探究TYMS及相關(guān)基因生物學(xué)功能和通路:本研究使用DAVID軟件完成GO分析和 KEGG 通路分析。將TYMS及相關(guān)基因?qū)隓AVID中,并設(shè)置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Homo sapiens”,選擇“GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT、KEGG_PATHWAY”進(jìn)行富集分析,其閾值為P值<0.05,FDR<0.5。最后,富集分析結(jié)果通過Sangerbox 工具可視化。

結(jié) 果

一、Oncomine數(shù)據(jù)庫中TYMS在卵巢癌中的表達(dá)

Oncomine 數(shù)據(jù)庫關(guān)于卵巢癌中TYMS基因差異表達(dá)的研究文獻(xiàn)共13項(xiàng),包括1043例標(biāo)本。文章分別發(fā)表于國際Br J Cancer,Cancer Res,Clin Cancer Res,Cancer Sci等雜志,在Oncomine數(shù)據(jù)中對(duì)這13項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),TYMS在卵巢癌中呈現(xiàn)高表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖1。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TYMS在卵巢癌中的表達(dá)

二、TYMS相關(guān)基因識(shí)別與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在cBioPortal數(shù)據(jù)庫中,卵巢癌中與TYMS密切相關(guān)的基因共39個(gè),分別為ATIC、CCNA1、CCNE1、CDC45A、CDC45、CDC6、CDT1、CSNK2A1、CSNK2A2、DHFR、DHFR2、E2F1、E2F3、FBXO5、GART、MTR、MTRR、ORC1、PCNA、POLA1、POLA2、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、POLE、POLE2、POLE3、POLE4、POLG、POLG2、PRIM1、PRIM2、REV3L、RRM2、SLC25A32、TFDP2、TK1、TK2。STRING構(gòu)建包括TYMS基因在內(nèi)的40個(gè)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),圖中可直觀顯示各相關(guān)基因與TYMS的相互作用,見圖2。

圖2 卵巢癌中TYMS相關(guān)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

三、TYMS及相關(guān)基因的功能富集分析

在DAVID中對(duì)TYMS及其相關(guān)基因進(jìn)行GO功能和KEGG途徑富集分析。GO功能注釋顯示了豐富的生物過程,由BP、CC和MF組成。GO分析結(jié)果顯示,TYMS及其相關(guān)基因分別于BP中的細(xì)胞周期G1/S調(diào)控、DNA生物合成、氨基酸生物合成、DNA代謝、輔酶代謝、核苷酸的生物合成等過程有關(guān);與CC中的核染色體、DNA聚合酶復(fù)合物和線粒體等細(xì)胞組分有關(guān);與MF中的DNA結(jié)合、DNA聚合酶活性和核苷酸結(jié)合等分子功能有關(guān)。KEGG途徑富集分析顯示,TYMS及其相關(guān)基因包括嘧啶代謝、DNA復(fù)制、嘌呤代謝等代謝途徑,p53、NF-κB、Wnt、AMPK等信號(hào)通路,膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、急性髓系白血病等惡性腫瘤,以及細(xì)胞周期、葉酸一碳池、鉑耐藥、HTLV-I感染等在內(nèi)的58條KEGG通路,見圖3。

(A-C):GO terms of the top 39 genes positively correlated with TYMS, including biological processes(BP), molecular function(MF), and cellular component(CC);(D):KEGG pathway of the top 39 genes positively correlated with TYMS

四、挖掘TYMS上游調(diào)控基因E2F3

結(jié)合TYMS相關(guān)基因的GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)TYMS基因的主要生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)合成等,其中調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化為排在第一位的細(xì)胞生物學(xué)功能,富集分析提示TFDP2、CCNE1、E1F1、E2F3為G1/S期轉(zhuǎn)化中的上調(diào)基因,見圖4,提示TFDP2、CCNE1、E1F1、E2F3可能為TYMS的上調(diào)基因,值得進(jìn)一步研究。

圖4 細(xì)胞周期通路圖(紅框?yàn)楦患治錾险{(diào)基因)

討 論

TYMS在胸苷單磷酸(deoxy-thymidine monophosphate, dTMP)的生物合成中起關(guān)鍵作用。TYMS是一種74 kda蛋白,它形成一種同型二聚體,利用輔助因子ch2h4-葉酸催化脫氧尿苷一磷酸(deoxy-uridine monophosphate, dUMP)的還原甲基化生成dTMP。dTMP是DNA合成的基本底物。所以,抑制TYMS的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致核苷酸失衡,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11],TYMS高表達(dá)可促進(jìn)癌變[12],導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[13]。

本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),TYMS在EOC癌組織中表達(dá)顯著高于正常卵巢組織中的表達(dá),與其他學(xué)者在其他惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌[3-6]等的研究報(bào)道一致。這一結(jié)果提示,TYMS高蛋白表達(dá)水平與EOC發(fā)生關(guān)系密切,在EOC的發(fā)生中可能扮演癌基因的作用。

為進(jìn)一步探討TYMS在EOC中可能的作用機(jī)理。本研究通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫,獲得了EOC中與TYMS表達(dá)呈正相關(guān)的基因共39個(gè),并在STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建了TYMS相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,本研究發(fā)現(xiàn),TYMS的主要生物學(xué)功能為調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期、DNA生物合成、氨基酸生物合成、DNA代謝等,提示TYMS可能通過調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期、嘧啶代謝、DNA復(fù)制和堿基切除修復(fù)等通路,參與EOC的發(fā)生發(fā)展。

為了探討TYMS在EOC中高表達(dá)的原因,本研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Dp-2(transcription factor dp-2, TFDP2)、細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin e1, CCNE1)、E1F轉(zhuǎn)錄因子1(E1F transcription factor 1, E1F1)、E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F transcription factor 3, E2F3)可能為TYMS的上調(diào)基因。首先,TFDP基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族,與E2F家族蛋白形成的E2F-TFDP轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體是細(xì)胞周期S期進(jìn)展所需基因的主要調(diào)節(jié)因子[14]。TFDP2或TFDP家族的其他成員可能通過與E2F家族成員合作來激活下游基因TYMS、CCNE1。例如,已有研究證實(shí),在肝細(xì)胞癌中TYMS、CCNE1的表達(dá)水平與TFDP1和E2F1密切相關(guān)[15]。其次,CCNE1基因在G1/S過渡期間表達(dá),編碼屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族。研究表明,晚期 SV40 因子(late SV40 factor 3, LSF)是從靜止進(jìn)展到細(xì)胞周期所必需的一種轉(zhuǎn)錄因子,并在G(1)/S周期調(diào)節(jié)TYMS基因的表達(dá),而LSF主要被CCNE家族磷酸化[16]。所以,CCNE1或CCNE家族的其他成員可能通過間接作用調(diào)節(jié)TYMS基因的表達(dá)來產(chǎn)生下游效應(yīng)。最后,轉(zhuǎn)錄因子E2F控制TYMS的表達(dá)[17-18],存在于機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞中,參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理過程。核轉(zhuǎn)錄因子E2F3是一種細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白,也是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的重要因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展[19],與多種致癌、抑癌基因密切相關(guān)。國內(nèi)外多位學(xué)者對(duì)E2F3基因促進(jìn)EOC進(jìn)展的機(jī)制進(jìn)行了研究。例如,Reimer等[20]的研究發(fā)現(xiàn),E2F3在EOC進(jìn)展中受表皮生長(zhǎng)因子影響,在腫瘤細(xì)胞增殖中起著關(guān)鍵作用。He等[21]的研究發(fā)現(xiàn)在 EOC 細(xì)胞周期中,E2F3與極光家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-A蛋白(Aurora family of serine/threonine protein kinases-A,Aurora-A)的啟動(dòng)子結(jié)合,形成E2F3-Aurora-A軸,E2F3異位表達(dá)刺激啟動(dòng)子活性,誘導(dǎo)Aurora-A表達(dá)增加,促進(jìn)癌細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期進(jìn)展。

綜上所述,本研究利用生物信息技術(shù)在公共腫瘤數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行目標(biāo)基因的分析,發(fā)現(xiàn)TYMS基因在EOC中表達(dá)顯著增高,并通過調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期、嘧啶代謝、DNA復(fù)制和堿基切除修復(fù)等通路,參與EOC的發(fā)生發(fā)展。其次,E2F3可能通過與TYMS結(jié)合調(diào)控其表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展,促進(jìn)EOC進(jìn)展。本研究是一項(xiàng)初步研究,在未來需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證TYMS的生物學(xué)功能,揭示TYMS在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制,探索TYMS作為EOC診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及靶向治療的潛在生物標(biāo)志物的研究?jī)r(jià)值。生物信息學(xué)作為一種新興的科學(xué),對(duì)生物醫(yī)學(xué)的研究中尋找關(guān)鍵基因及潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義,省時(shí)、省力,并可減少盲目性。