胡燁 張永莉 杜貴強

女性盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse,POP)是婦女常見疾病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。在50～79歲年齡段婦女中,約 40%有不同程度的盆底器官脫垂癥狀[1]。宮旁韌帶組織是支持盆腔結(jié)構(gòu)的重要部分。子宮位于骨盆腔中央位置,由四對韌帶固定,分別是闊韌帶、圓韌帶、主韌帶、宮骶韌帶,這四對韌帶各發(fā)揮不同的作用。闊韌帶由子宮側(cè)緣向外側(cè)伸展到達骨盆側(cè)壁,使子宮保持在骨盆中央位置,限制子宮向側(cè)方移位。圓韌帶和宮骶韌帶使子宮維持在前傾前屈位置。圓韌帶直接維持子宮前傾位。宮骶韌帶的作用是向后上方牽引子宮頸,有間接維持子宮前傾的作用。主韌帶主要固定宮頸,起自宮頸上部的兩側(cè),向后方附于盆壁上,防止子宮向側(cè)方移位。在女性一生當中, 宮旁韌帶組織要受到重力、妊娠、分娩、咳嗽、排便等各種力的作用, 站立、日?；顒?、體力勞動、舉重練習(xí)時腹壓增大, 當腹壓過大時, 間斷或持續(xù)增大的應(yīng)力作用會損傷宮旁韌帶組織。而宮旁韌帶的損傷是POP發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]。本研究擬檢測機械應(yīng)力對人子宮旁韌帶成纖維細胞增殖及膠原代謝的影響以探討其在 POP發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。

材料與方法

一、樣本來源

選取于2020年2月—2020年5月上海市第一婦嬰保健院醫(yī)院婦科因良性腫瘤行子宮全切手術(shù)的患者5例,患者年齡43～49歲,平均年齡為(45.6±2.5)歲,均無盆底功能障礙疾病,均未絕經(jīng)?；颊呔橥?并簽署知情同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

二、方法

1.原代骶韌帶成纖維細胞培養(yǎng):將新鮮骶韌帶組織切成碎片,I型膠原酶(SCR103,Merck KGaA, Darmstadt, Germany)和胰酶(T4174,Merck KGaA, Darmstadt, Germany)消化后于10%胎牛血清(S181-F500; Biowest, Paris, France)的DMEM 培養(yǎng)基(C11995500BT;Gibco, Waltham, MA, USA)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當細胞融合度達到70%～80% 時進行傳代,本研究使用第 3～5 代生長良好的成纖維細胞。

2.原代成纖維細胞鑒定:原代成纖維細胞在載玻片中培養(yǎng)至50% 融合度,隨后洗滌、固定,用 0.4% Triton X-100 及3% 過氧化氫處理。小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(200 μg/mL)孵育細胞,4℃ 過夜;用 PBS 代替一抗作為陰性對照。二抗孵育。顯微鏡觀察并拍照。

3.細胞應(yīng)力培養(yǎng):原代成纖維細胞以每孔5×104細胞/培養(yǎng)孔的密度接種在6孔柔性培養(yǎng)板上(Flexcell公司,McKeesport, PA,USA)。待細胞長至75%～80%融合時,更換無血清培養(yǎng)液同步化細胞12 h。使用Flexercell細胞拉力培養(yǎng)系統(tǒng)(Flexcell 公司,McKeesport, PA,USA)對細胞進行拉伸應(yīng)力培養(yǎng)12 h或24 h。以培養(yǎng)皿底部硅膠膜拉伸應(yīng)變率(%)表示細胞所受力值大小,細胞所受張力隨著拉伸率的增大而增大,將細胞的力值定為0%(對照組)、6%、12% 及18% 表面伸長率,頻率為6 循環(huán)/分鐘,每一循環(huán)包括3秒伸展/3秒放松。每次實驗,每組均設(shè)重復(fù),計算時取均值;相同實驗均重復(fù)4次(均為不同標本取材,即n--4)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

4.細胞增殖檢測:原代成纖維細胞以每孔5×104細胞/培養(yǎng)孔的密度接種在6孔柔性培養(yǎng)板上。待細胞長至75%～80%融合,無血清培養(yǎng)液同步化細胞12 h后加力培養(yǎng)12 h、24 h。在細胞培養(yǎng)滿48 h后加入CCK-8試劑(美國MCE公司),孵育4 h后,酶標儀檢測吸光度值,波長取460 nm。計算細胞增殖率。

5.實時熒光定量PCR(qPCR)檢測MMP-2、TIMP-1、I型膠原蛋白(Collagen I)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)及LOXL1 mRNA的表達:采用 Trizol 法 對 總 RNA進行 提 取,逆轉(zhuǎn)錄過程中嚴格逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟。在熒光定量實時 PCR 儀上對所 得 cDNA 進行反應(yīng)。按照說明使用 Power SYBR GreenPCR MasterMix 試劑盒,內(nèi)參照為 β-actin。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性15 min, 95℃ 變性10 s,60℃退火和延伸20 s,7℃ 25 s,共35 個循環(huán)。7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù),2-ΔΔCT法計算MMP-2、TIMP-1、Collagen I、CollagenⅢ及LOXL1 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列

6.觀察內(nèi)容:(1)鑒定成纖維細胞;(2)觀察不同(6%、12%及18%)拉伸應(yīng)力下作用12 h 及24 h對成纖維細胞的增殖能力的影響及對MMP-2、TIMP-1、Collagen I、Collagen Ⅲ和LOXL1 mRNA的表達的影響。

7.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,兩組比較采用t檢驗,兩組以上比較采用方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、成纖維細胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察宮骶韌帶成纖維細胞。細胞多呈梭形,邊界清楚,細胞體較大,細胞質(zhì)透明(圖1)。成纖維細胞的Vim免疫組化染色。核周的胞質(zhì)呈棕黃色陽性染色。

圖1 倒置顯微鏡下宮骶韌帶成纖維細胞和成纖維細胞的Vim免疫組化

二、拉伸應(yīng)力對成纖維細胞的增殖能力的影響

結(jié)果提示,6%的拉伸應(yīng)力作用12 h對成纖維細胞的增殖能力有增強的趨勢,但差異無顯著性(P>0.05), 12%及18%的拉伸應(yīng)力培養(yǎng)12 h對成纖維細胞的增殖能力有明顯抑制作用(P<0.05),但兩組間無明顯差異(P>0.05)。6%、12%及18%的拉伸應(yīng)力作用24 h均對細胞的增殖能力有明顯抑制作用(P<0.05),且12%及18%應(yīng)力較6%應(yīng)力抑制作用更大(P<0.05),但12%與18%應(yīng)力間無明顯差異(P>0.05)。此外,隨著作用時間延長(24 h vs 12 h),6%、12%及18% 的應(yīng)力對細胞的增殖作用抑制更明顯(P<0.01)。見圖2。

Control group(0% stress);a vs Control group,P<0.05;b vs 6% group,P<0.001

三、拉伸應(yīng)力對成纖維細胞的MMP-2、TIMP-1、Collagen I、Collagen Ⅲ及LOXL1 mRNA的表達的影響

將成纖維細胞分別在6%、12%及18%的拉伸應(yīng)力下培養(yǎng)12 h及24 h,發(fā)現(xiàn)6%的拉伸應(yīng)力作用12 h及24 h,成纖維細胞MMP-2、TIMP-1、Collagen I、Collagen Ⅲ及LOXL1 mRNA表達較對照組有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05); 12%及18%的拉伸應(yīng)力作用下,成纖維細胞MMP-2、TIMP-1、Collagen I、Collagen Ⅲ 及LOXL1 mRNA 的表達均較對照組明顯降低(P<0.05);且隨著應(yīng)力增加(12% vs 18%)表達都有進一步下降的趨勢,其中LOXL1 mRNA 的表達有進一步的顯著性下降(P<0.05)。見圖3、圖4。

C:Control group(0% stress).a vs Control group,P<0.05 ;b vs 12% group,P<0.05

C:Control group(0% stress).a vs Control group,P<0.05 ;b vs 12% group,P<0.05

進一步分析發(fā)現(xiàn)隨著應(yīng)力作用時間延長(24 h vs.12 h),MMP-2、TIMP-1、Collagen I mRNA的表達明顯下降(P<0.05),而Collagen Ⅲ及LOXL1 mRNA 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖5、圖6。

C:Control group(0% stress).a vs Control group,P<0.05 ;b vs 12h group,P<0.05

C:Control group(0% stress).a vs Control group,P<0.05 ;b vs 12 h group,P<0.05

此外,各基因中,TIMP-1、Collagen I及LOXL1 mRNA 表達下降相對更大,相較對照組下降的最大幅度分別達到 43.6%、40.1%及47.9%;而Collagen Ⅲ及MMP-2下降最大幅度相對較小,分別為21.1%及24.8%。

討 論

妊娠、分娩、長期咳嗽、長期便秘、長期負重等是導(dǎo)致POP發(fā)生的重要原因[1]。這些情況下,腹腔內(nèi)會產(chǎn)生過大的壓力作用于包括宮旁韌帶在內(nèi)的盆底的支持結(jié)構(gòu)。本研究通過對宮旁韌帶成纖維細胞的在應(yīng)力下的培養(yǎng)模擬了女性盆底的宮旁韌帶組織在受到來自腹腔的壓力時,其成纖維細胞所處的應(yīng)力環(huán)境,主要研究了此情況下成纖維細胞膠原蛋白代謝的變化。

膠原蛋白的代謝異常與POP的發(fā)生密切相關(guān)。在盆底支持組織中起主要作用的是子宮主韌帶、子宮骶韌帶、肛提肌以及陰道壁結(jié)構(gòu)等。研究發(fā)現(xiàn),POP患者的盆底組織的力學(xué)性能明顯下降[2-3]。組織的力學(xué)特性歸根結(jié)底是由蛋白質(zhì)的力學(xué)特性決定的。盆底支持結(jié)構(gòu)的主要成分是平滑肌和結(jié)締組織,而結(jié)締組織的主要蛋白質(zhì)成分之一為膠原,占機體蛋白的25%左右。盆底筋膜主要由I型和Ⅲ型膠原構(gòu)成,I型膠原與支持作用有關(guān),硬度大、直徑粗,占膠原蛋白總量的80%～90%%,Ⅲ型膠原與組織的彈性有關(guān),彈性大,直徑較細[1-2]。盆底功能障礙的患者,其盆底組織中膠原的含量明顯減少[4-6],膠原蛋白之間的交聯(lián)明顯降低[7]。

成纖維細胞是膠原代謝的主要調(diào)控細胞。成纖維細胞能夠?qū)⒍喾N生長因子、多種激素、細胞素、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)合成并分泌出來, 對膠原的合成與分解平衡進行調(diào)控, 在細胞新陳代謝和組織重塑中發(fā)揮著極為重要的作用[8]。在皮膚、骨與軟骨組織、口腔醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,細胞的力學(xué)特性研究較多。如研究發(fā)現(xiàn)[9],在皮膚組織的成纖維細胞中,細胞拉伸應(yīng)力使細胞產(chǎn)生的I型膠原蛋白減少而產(chǎn)生的纖連蛋白增加。牙周韌帶成纖維細胞中,拉伸應(yīng)力使細胞的MMP-1、MMP-2、TIMP1、TIMP2的RNA表達水平上調(diào)[10]。在膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶及側(cè)副韌帶的成纖維細胞中,拉伸應(yīng)力可以增加細胞MMP-2的表達[11]。

盆底領(lǐng)域相關(guān)細胞生物力學(xué)的研究相對起步較晚。國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)于POP患者的陰道壁成纖維細胞施加應(yīng)力,隨著應(yīng)力的增加, Collagen I、Collagen Ⅲ、PH4及MMP-2 mRNA的水平均有下降的趨勢[12]。骶韌帶的成纖維細胞在適當?shù)膽?yīng)力作用下可以促進盆底膠原的合成,應(yīng)力過大或過小均不利于膠原的合成[13]。有研究發(fā)現(xiàn),對宮旁韌帶的成纖維細胞施加過度的應(yīng)力可以誘發(fā)細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,加速細胞的凋亡[14]。陰道壁成纖維細胞加載周期性機械力后其細胞凋亡率和 actin 細胞骨架破壞程度增加[15]。

本研究提取了無盆腔臟器脫垂相關(guān)疾病且未絕經(jīng)的女性的宮骶韌帶成纖維細胞,施加應(yīng)力后發(fā)現(xiàn),較小的拉伸應(yīng)力作用時間較短的情況下,成纖維細胞表現(xiàn)出增殖能力增加的趨勢,但是這種差異無顯著性。但較大的拉伸應(yīng)力可以抑制使成纖維細胞的增殖能力;且在一定范圍內(nèi)隨著應(yīng)力增加(6%～12%)及作用時間延長(12～24 h)其抑制作用增加。

此外,本研究檢測了應(yīng)力作用下,成纖維細胞膠原代謝相關(guān)基因表達的變化。其中CollagenⅠ及CollagenⅢ 為成纖維細胞合成的膠原成分,MMP-2促進膠原的分解代謝,TIMP2則可以抑制MMP-2的活性,而LOXL1是盆底膠原纖維通過共價交聯(lián)取得穩(wěn)定性和發(fā)育成熟的關(guān)鍵酶之一。較小的拉伸應(yīng)力,似乎有促進成纖維細胞膠原基因表達的趨勢,但本研究中差異無統(tǒng)計學(xué)意義,仍需進一步實驗驗證。而較大的拉伸應(yīng)力則導(dǎo)致膠原相關(guān)基因mRNA的表達下降。CollagenⅠ及CollagenⅢ的mRNA表達下降,提示成纖維細胞的膠原合成能力下降。同時值得注意的是,雖然MMP-2的表達下降可能導(dǎo)致膠原的分解代謝減弱,但TIMP2的mRNA表達同時下降,且下降的程度更大。同時MMP-2 mRNA的下降具有相對的滯后性。這種變化提示可能膠原的分解代謝受到應(yīng)力作用影響的程度更小。此外,LOXL1 mRNA表達下降,提示成纖維細胞膠原的穩(wěn)定性變得更加脆弱。

本研究結(jié)果可以推測,在較大的應(yīng)力作用下,子宮旁韌帶的成纖維細胞的增殖能力、膠原生成及穩(wěn)定成熟的能力受到減弱,成纖維細胞的膠原代謝平衡可能被打破,從而導(dǎo)致盆底的結(jié)締組織的力學(xué)特性下降。而這一機制可能參與了盆腔臟器脫垂發(fā)生發(fā)展的過程。本研究僅為對骶韌帶來源的成纖維細胞應(yīng)力下的細胞特性的初步研究,更深入的研究仍有待進行。