潘樹礦 王育新 孫雨桐 胡夢甜 丁鳳 夏成萬

近年來,基于吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)的近紅外熒光成像(near infrared fluorescence,NIF)技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛[1-4]。在腫瘤外科領(lǐng)域,該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤邊界標識,殘余腫瘤組織檢測及前哨淋巴結(jié)定位中[5-6]。目前,Nishio等[7]發(fā)現(xiàn)基于panitumumab-IRDye800CW的NIF技術(shù)可用于篩選高轉(zhuǎn)移風險的區(qū)域淋巴結(jié),提示利用NIF技術(shù)術(shù)中定位轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)具有可行性。本研究擬探討基于ICG的NIF成像聯(lián)合光學定量方法定位口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的可行性,從而為該技術(shù)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ICG注射及NIF成像設(shè)備

ICG(丹東醫(yī)創(chuàng)制藥有限公司);熒光成像設(shè)備為手持NIF探測儀(MaYa 2000 Pro,Ocean Optics,Dunedin,Florida,USA)的NIF成像設(shè)備(Real-IGS,南京諾源醫(yī)療器械有限公司)。該設(shè)備激發(fā)光譜為785 nm,接受830 nm ICG發(fā)射光,顯示屏可同時顯示白光圖像、融合圖像、熒光圖像和熱圖4 個窗口。

1.2 臨床試驗

1.2.1 納入與排除標準 本研究經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(批號:2017NL-001),所有患者均已簽署知情同意書,所有患者的具體治療方案均經(jīng)過多學科綜合討論后制訂。納入標準為:(1)經(jīng)病理活檢明確診斷為OSCC;(2)影像學檢查患者TNM分期為cT1-4N0M0,其中TNM分期標準采用AJCC第7版標準。排除標準為:(1)曾接受頭頸部放化療;(2)對ICG、碘制劑過敏;(3)孕婦或待孕患者;(4)嚴重肝腎功能障礙。

1.2.2 ICG注射和NIF成像 手術(shù)前12 h,按照0.75 mg/kg的配比,將ICG充分溶于30 mL滅菌注射用水中,利用靜脈泵30 min緩慢注射入肘靜脈中。術(shù)中患者經(jīng)過常規(guī)麻醉和鋪巾后,翻開頸闊肌和胸鎖乳突肌,暴露出頸部淋巴組織,使用NIF成像設(shè)備對頸部淋巴組織區(qū)域進行實時NIF成像,使用手持NIF探測儀對熒光顯影淋巴結(jié)進行熒光強度定量檢測送其至病理科行快速病理檢查,隨后按既定手術(shù)方案行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)和原發(fā)灶切除,分選淋巴結(jié),定量檢測熒光強度后送至病理科行常規(guī)病理檢查。記錄所有淋巴結(jié)的位置、熒光強度和轉(zhuǎn)移狀態(tài)。

1.2.3 病理學檢查 對于術(shù)中快速冰凍切片檢查,淋巴結(jié)組織首先包埋于OCT包埋劑中,使用冰凍切片機切取10 μm厚切片,按冰凍切片快速染色常規(guī)步驟進行染色。對于常規(guī)病理切片檢查,將所有淋巴結(jié)組織固定于福爾馬林溶液中過夜,隨后按石蠟標本制作常規(guī)流程進行石蠟包埋,切取4 μm厚切片,分別按標準流程行HE染色和CK5/6免疫組化染色,最后在光鏡下由兩位高年資病理科專家判斷淋巴結(jié)是否存在腫瘤細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計軟件(Version 23.0,IBM,USA)和GraphPad Prism軟件(Version 6.0,GraphPad Software,USA)。測量數(shù)據(jù)均表達為平均值±標準差。對于轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的熒光強度使用雙側(cè)t檢驗比較;淋巴結(jié)的熒光強度使用雙側(cè)t檢驗比較;通過受試者操作特征曲線分析(receiver operating characteristic curve,ROC curve)計算靜脈注射ICG鑒別OSCC轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的敏感性和特異性,閾值根據(jù)Youden指數(shù)確定,似然比(likelihood ratio,LR)定義為:LR=敏感性/(1-特異性)。不同患者的淋巴結(jié)ICG熒光信號的個體差異使用one way ANOVA檢驗。P≤0.05認為具有統(tǒng)計學意義,用“*”表示。

2 結(jié) 果

2.1 患者資料

經(jīng)過術(shù)前病理活檢明確診斷為OSCC患者共20 例,平均年齡為64.7 歲(50～77 歲),其中男性患者11 例,女性患者9 例。8 例(40%)患者腫瘤位于舌體,8 例(40%)患者腫瘤位于頰部,2 例(10%)患者腫瘤位于硬腭,1 例(5%)患者腫瘤位于下唇,1 例(5%)患者腫瘤位于口咽;19 例(95%)患者接受了單側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃術(shù),1 例(5%)患者接受了雙側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)。經(jīng)過常規(guī)病理學檢查,有7 例患者(35%)的12 枚淋巴結(jié)被診斷為轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(患者情況具體見表1)。

表1 OSCC患者臨床資料

2.2 基于靜脈注射ICG的NIF成像評估OSCC區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)

為了評估基于靜脈注射ICG的NIF成像評估OSCC區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)的特異度和靈敏度,本研究對頸部淋巴結(jié)進行了在體和離體NIF成像。其中,在體成像中,13 例(65%)患者的27 枚淋巴結(jié)出現(xiàn)了熒光顯影(圖1),經(jīng)過術(shù)中快速病理檢查后,6 例(46.2%)患者的8 枚(29.6%)淋巴結(jié)被診斷為轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。頸部淋巴結(jié)清掃完成后,本研究按照頸部淋巴結(jié)分區(qū)對淋巴結(jié)進行了分選,總共497 枚淋巴結(jié)被分選出來,其中38 枚(7.6%)淋巴結(jié)位于Ⅰa區(qū),77 枚(15.5%)淋巴結(jié)位于Ⅰb區(qū),144 枚(29.0%)淋巴結(jié)位于Ⅱ區(qū),157 枚(31.6%)淋巴結(jié)位于Ⅲ區(qū),81 枚(16.3%)淋巴結(jié)位于Ⅳ區(qū)。經(jīng)過病理學檢查后,有12 枚(2.4%)淋巴結(jié)被診斷為轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),其中8 枚(66.7%)淋巴結(jié)為熒光顯影淋巴結(jié),4 枚(33.3%)淋巴結(jié)術(shù)中無熒光顯影。以單個淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)為統(tǒng)計單位,特異度和靈敏度分別為96.1%和66.7%。陽性預(yù)測率和陰性預(yù)測率分別為29.6%和99.1%,準確率為95.4%;以患者整體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為統(tǒng)計單位,對照病理,基于靜脈注射ICG的NIF成像技術(shù)評估OSCC區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的準確度達到了95%。

圖1 靜脈注射ICG后OSCC患者頸部淋巴結(jié)NIR術(shù)中成像情況

2.3 離體淋巴結(jié)熒光強度定量分析

所有淋巴結(jié)按照頸部淋巴結(jié)分區(qū)分選后,均用手持式NIF檢測儀進行熒光定量測量。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)為96.9±37.7(范圍:37-136),明顯高于非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的平均熒光強度29.5±16.8(范圍:1-108)(P<0.001)(圖2A)。

圖2 靜脈注射ICG后OSCC頸部淋巴結(jié)熒光信號強度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

為評估通過測量離體淋巴結(jié)熒光強度判斷淋巴結(jié)狀態(tài)的可行性,本研究進一步分析了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)與淋巴結(jié)熒光強度之間的關(guān)系。對于接受靜脈注射ICG,以熒光強度為81.5作為區(qū)分轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)診斷界限時,診斷價值最高,靈敏度和特異度分別為75%和98.76%(LR=3.951),陽性預(yù)測率和陰性預(yù)測率分別為60%和99.4%。ROC曲線結(jié)果顯示,靜脈注射ICG,曲線下面積達0.95(95%置信區(qū)間為0.89-0.99),提示靜脈注射ICG,利用熒光強度定量分析判斷淋巴結(jié)狀態(tài)具有很好的可行性(圖2B)。

考慮到患者個體差異對區(qū)域淋巴結(jié)的熒光強度的影響,使用單一的熒光強度閾值來篩選可疑淋巴結(jié)可能不適用于每個患者。針對單個患者,應(yīng)該轉(zhuǎn)化思路,分析經(jīng)過靜脈注射ICG后,準確判斷OSCC患者頸部區(qū)域淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移所需病理檢測的最小淋巴結(jié)數(shù),來提高后續(xù)病理檢測的針對性。因此本研究首先對每個患者所有淋巴結(jié)按照熒光強度進行排序。分析發(fā)現(xiàn),對于接受靜脈注射ICG的患者,只需通過病理檢測熒光強度排名前6的淋巴結(jié)即可準確判斷頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(特異度和靈敏度分別為76.2%和100%)。進一步分析淋巴結(jié)病理檢測數(shù)目對NIF成像判斷OSCC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的影響,結(jié)果顯示對于靜脈注射ICG組,最佳的淋巴結(jié)檢測數(shù)目為6枚,特異度和靈敏度分別為78%和100%(圖3)。

圖3 OSCC 頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的影響

3 討 論

OSCC是頭頸部常見惡性腫瘤之一。根據(jù)Global Cancer Statistics 最新數(shù)據(jù)顯示,全球每年新發(fā)OSCC 354 864 例,死亡177 384 例[8]。國內(nèi)的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,OSCC的每年新發(fā)人數(shù)達到了4.6萬人,死亡人數(shù)達到了2.1 萬人[9]。手術(shù)治療是OSCC患者首選治療方法,但其5年生存率始終徘徊在60%左右。頸部區(qū)域復(fù)發(fā)是導致OSCC治療失敗的重要原因之一。為此,臨床醫(yī)生多行選擇性頸淋巴清掃術(shù)避免區(qū)域復(fù)發(fā)。然而,回顧OSCC患者的術(shù)后病理資料,只有30%的患者存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10-11],這意味著剩余的70%患者接受了不必要的頸淋巴結(jié)清掃術(shù),并帶來了一系列的并發(fā)癥,如頸部皮膚麻木,頸肩綜合癥等[12]。

目前,術(shù)前多應(yīng)用影像學方法評估OSCC患者是否存在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),如 CT、MR 及 PET-CT 等,為術(shù)者評估手術(shù)難度及淋巴結(jié)清掃范圍,但是判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移準確率較低,對于術(shù)中實時淋巴結(jié)清掃指導意義有限[13-14]。術(shù)中確定淋巴結(jié)清掃范圍的方法主要依靠術(shù)者經(jīng)驗、存在主觀性強且準確性低的不足;前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)(sentinel lymph node biopsy,SLNB)是另外一種用于術(shù)中評估淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的方法[15]。目前前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)在乳腺癌、惡性黑色素瘤、頭頸癌等惡性腫瘤得到廣泛應(yīng)用[16-18]。然而傳統(tǒng)的前哨淋巴結(jié)活檢示蹤劑如亞甲藍、核素等在定位前哨淋巴結(jié)仍有其局限性,如低靈敏度/特異度,放射性污染,透過效應(yīng)現(xiàn)象等干擾了其進一步發(fā)展[16,19-23]。此外前哨淋巴結(jié)活檢依然依賴于病理學檢查,在避免微小轉(zhuǎn)移灶的漏診方面依然沒有得到改進[19]。術(shù)中病理是評價淋巴結(jié)病理狀態(tài)的金標準,但受限于病理取材切片,微小轉(zhuǎn)移灶同樣容易被漏診。全樣本連續(xù)性切片是目前避免淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移灶漏診的最有效辦法,但由于該技術(shù)工作量大,價格昂貴,目前尚不具有應(yīng)用于臨床的可能[20]。

近紅外影像手術(shù)導航是近十年來新發(fā)展的前沿技術(shù),也是目前精準醫(yī)療研究熱點之一[21]。該技術(shù)的出現(xiàn)為術(shù)中腫瘤定位、邊緣判定探測提供了一種實時、準確的檢測工具。多位研究者也發(fā)現(xiàn)基于瘤周注射ICG的NIF技術(shù)相比于傳統(tǒng)的亞甲藍、核素等示蹤劑可以提高前哨淋巴結(jié)的檢出率[22-23]。但是考慮到瘤周注射ICG會影響原發(fā)灶解剖結(jié)構(gòu)的識別,干擾原發(fā)灶的切除,且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了通過靜脈注射0.75 mg/kg ICG后12 h可以清晰顯示OSCC原發(fā)灶范圍,指導原發(fā)灶的切除[5],且考慮到靜脈注射ICG后,ICG可能會通過兩種方式蓄積于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中:(1)ICG首先通過EPR效應(yīng)蓄積于OSCC原發(fā)灶中,隨后通過淋巴引流蓄積于轉(zhuǎn)移可能性大的前哨淋巴結(jié);(2)ICG通過EPR效應(yīng)直接蓄積于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的腫瘤組織內(nèi);從而使轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)相較于正常淋巴結(jié)蓄積更多的ICG。因此本研究嘗試觀察了同樣的靜脈ICG給藥方式可否同樣指導術(shù)中篩選OSCC轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。結(jié)果顯示,基于靜脈注射ICG的NIF技術(shù)同樣可以輔助鑒別OSCC區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài),其靈敏度和特異度分別為66.7%和96.1%,準確度達到95.4,結(jié)合術(shù)中快速冰凍切片檢查,有95%(19/20)的OSCC患者區(qū)域淋巴結(jié)狀態(tài)被準確判斷。此外,對于離體的淋巴結(jié),NIF熒光定量檢測分析鑒別的靈敏度和特異度達到了75%和98.76%。這與Digonnet等[24]通過靜脈注射HSA∶ICG?篩選轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的靈敏度和特異度達到了76.5%和76.7%,Nishio等[7]通過靜脈注射Panitumumab-IRDye800CW篩選轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的靈敏度和特異度達到了84.6%和94%相似,提示了基于ICG的NIF成像技術(shù)用于術(shù)中篩選OSCC轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)同樣具有臨床應(yīng)用前景。

綜上所述,基于靜脈注射ICG的NIF成像技術(shù)結(jié)合光學定量分析可以有效的實現(xiàn)術(shù)中初篩OSCC患者可疑的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),并通過術(shù)中快速病理進一步在術(shù)中為頸清范圍的制定提供更準確的依據(jù)。但是目前本研究僅納入患者20 例,其推廣應(yīng)用仍需進一步的大樣本臨床研究驗證,此外由于ICG作為近紅外一區(qū)熒光材料,熒光穿透深度仍有限,尚無法實現(xiàn)對頸部深層區(qū)域淋巴結(jié)的成像,仍有可能造成顯影淋巴結(jié)的漏檢,未來這方面可寄希望于穿透深度更強的近紅外二區(qū)材料。