孟磊 王占宙 路瑤 林玉紅 王法程 盧志山

難治性根尖周炎是牙髓病臨床治療的難點(diǎn),臨床常表現(xiàn)為牙槽骨進(jìn)行性破壞和根尖周炎性肉芽組織形成。眾所周知,糞腸球菌及其產(chǎn)物是難治性根尖周炎的主要致病因素。在根尖周炎的初始階段,炎癥僅限于根尖牙周膜間隙,不伴有骨吸收。然而,長期存在的細(xì)菌挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致骨吸收最終發(fā)展為慢性根尖周炎[1]。

核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,RANKL)/骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)通路被認(rèn)為是骨吸收的中樞調(diào)節(jié)系統(tǒng)[2],在骨重塑調(diào)控中發(fā)揮重要作用。已有研究表明,骨吸收相關(guān)因子RANKL和OPG在大鼠根尖周病變中與牙槽骨吸收高度相關(guān)[3]。根管再治療后的根尖周病變被歸類為存在根內(nèi)感染或可能影響愈合的根外因素的持續(xù)性病變,持續(xù)存在的根尖周病變中RANKL和OPG基因水平較高,且RANKL表達(dá)高于OPG[4]。王琛瑋等[5]研究表明咬合控制與牙周病治療關(guān)系密切,雖然咬合不是牙周炎發(fā)病始動(dòng)因素,但大量臨床證據(jù)提示創(chuàng)傷性咬合力是導(dǎo)致牙周病發(fā)展加重的危險(xiǎn)因素。目前,關(guān)于糞腸球菌和咬合力誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞(humanperiodontal ligament cells,hPDLCs)產(chǎn)生骨吸收效應(yīng)的研究較少,本研究通過體外加壓模擬咀嚼受力狀態(tài)下糞腸球菌上清液誘導(dǎo)的hPDLCs的骨吸收過程,探討壓力及糞腸球菌上清液在難治性根尖周炎形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

I型膠原酶(Sigma,美國);低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清FBS(HyClone公司,美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time) (TaKaRa,日本);人sRANKL、OPG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(R&D Systems,美國);Spectra Max M2酶標(biāo)儀(Molecular Devices,美國);Eppendorf PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司,德國);Rotor Gene 3000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Corbett公司,澳大利亞)。

1.2 糞腸球菌上清液的制備

將糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29212復(fù)蘇24 h后接種于BHI液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至A600=0.5時(shí)停止培養(yǎng)。用5 000×g離心力在4 ℃下離心15 min,并應(yīng)用0.2 μm孔徑濾器過濾獲取糞腸球菌上清液,將該上清液在細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋,最終稀釋度為5%、10%、20%和40%。

1.3 hPDLCs細(xì)胞株的培養(yǎng)

本項(xiàng)研究已通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬煙臺市口腔醫(yī)院倫理委員會的審批(批號:2019-001)。選擇2019 年5～9 月期間在煙臺市口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診就診的11～15 歲患者,征得患者本人及家屬同意的情況下,收集其因正畸需要而拔除的健康前磨牙。無菌手術(shù)刀片刮取牙根中1/3 處的牙周膜,采用酶消化聯(lián)合組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞,取4～6 代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

采用CCK-8法測定不同濃度糞腸球菌上清液對hPDLCs細(xì)胞增殖活性的影響。取第4～6 代對數(shù)生長期的hPDLCs,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液并在計(jì)數(shù)板上調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL。將100 μL的細(xì)胞懸液等份接種到96 孔板中。設(shè)1 個(gè)對照組和4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組,培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后棄去上清液,分別加入濃度為0%、5%、10%、20%、40%的糞腸球菌上清液,每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h時(shí),每孔加入10 μL CCK溶液并孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值,計(jì)算每組均值,比較不同濃度的糞腸球菌上清液對hPDLCs增殖活性的影響。

1.5 壓力狀態(tài)下hPDLCs的形態(tài)觀察

將4～6 代hPDLCs以5×105/mL濃度接種于6 孔板,每孔 2 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng) 24 h貼壁,使用加力附件與圓形蓋玻片放于hPDLCs上,調(diào)節(jié)細(xì)胞的受力分別為0、49、196、392 Pa,然后再置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,倒置顯微鏡下觀察每組細(xì)胞形態(tài)。

1.6 RT-PCR檢測壓力狀態(tài)下hPDLCs RANKL和OPGmRNA的表達(dá)

hPDLCs貼壁培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液PBS沖洗后,加入不含糞腸球菌上清液的培養(yǎng)液1 mL作為對照組,加入含10%糞腸球菌上清液作為誘導(dǎo)組,加載加力裝置,調(diào)節(jié)細(xì)胞的受力分別為0、49、196、392 Pa,每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔,于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,收集細(xì)胞,使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測定RNA質(zhì)量與濃度,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,所有引物設(shè)計(jì)合成均由上海Sangon公司完成(表1)。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR說明書,進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。

表1 內(nèi)參基因和目的基因引物序列

1.7 ELISA檢測hPDLCs RANKL和OPG蛋白的表達(dá)

收集各組細(xì)胞上清液,按照ELISA操作規(guī)程,各組取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液,測定sRANKL和OPG蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。選用單因素方差系統(tǒng)分析后,SNK-q檢驗(yàn)比較各組之間的差異,以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度糞腸球菌上清液對hPDLCs的細(xì)胞增殖活性的影響

CCK-8法測定結(jié)果顯示,培養(yǎng)12 h后,20%和40%的糞腸球菌上清液使hPDLCs增殖速率減慢,與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h后,10%、20%和40%的糞腸球菌上清液均使hPDLCs增殖速率減慢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度的糞腸球菌上清液對hPDLCs增殖水平的影響 與相同時(shí)間點(diǎn)0%組相比,P<0.05)

2.2 壓力狀態(tài)下hPDLCs的形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下細(xì)胞緊密貼附于6 孔板底,生長狀態(tài)良好,hPDLCs細(xì)胞胞體較小,呈長梭形,分布較均勻。施加49 Pa壓力后,hPDLCs無明顯形態(tài)改變,施加196 Pa壓力后,hPDLCs胞體變大,突起增多。施加392 Pa壓力后,hPDLCs胞體明顯變大,呈突起的紡錘形或星形的扁平分布(圖2)。

圖2 hPDLCs受壓后的形態(tài)變化 (倒置顯微鏡,×100)

2.3 RT-PCR檢測各組RANKL和OPG基因表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示,施加壓力大于等于196 Pa時(shí),hPDLCs RANKL mRNA表達(dá)會增多,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);壓力392 Pa或者糞腸球菌上清液+196 Pa壓力,可致hPDLCs OPG mRNA表達(dá)明顯減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組hPDLCs RANKL和OPGmRNA表達(dá)變化 與相同時(shí)間點(diǎn)0 Pa組相比,P<0.05) (RT- PCR)

2.4 ELISA檢測各組sRANKL和OPG蛋白表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示,施加壓力392 Pa或者糞腸球菌上清液+196 Pa壓力,可致hPDLCs RANKL蛋白表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壓力392 Pa或者糞腸球菌上清液+196 Mp壓力,可致hPDLCs OPG蛋白表達(dá)明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

3 討 論

Shearer等[6]研究表明,糞腸球菌上清液具有細(xì)胞毒性,可抑制病毒生長。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的糞腸球菌上清液與hPDLCs共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)糞腸球菌上清液可降低hPDLCs的增殖速率,在培養(yǎng)24 h后,糞腸球菌上清液濃度≥10%對hPDLCs的抑制作用顯著。因此,選用10%的糞腸球菌上清液參與后期的骨吸收相關(guān)研究。

牙周膜作為根尖區(qū)天然免疫系統(tǒng)的第一道防線,其增強(qiáng)的血管密度、干細(xì)胞能力和對炎癥做出反應(yīng)的常駐細(xì)胞使其能夠更有力地抵御生物威脅[7]。牙周膜能承受生理性咀嚼,機(jī)械應(yīng)力對健康牙周組織的生理功能至關(guān)重要,牙周膜通過機(jī)械感覺信號系統(tǒng)和牙齒支持在調(diào)節(jié)骨重建、咬合負(fù)荷分布方面起著重要作用[8]。雖然懸吊式PDL的作用是調(diào)節(jié)對骨的中等負(fù)荷,但PDL自身較高的壓應(yīng)力和應(yīng)變可以啟動(dòng)破骨活性的生物序列,從而影響鄰近骨的變化[9]。

hPDLCs是根尖區(qū)最重要的細(xì)胞之一,是在根尖周局部炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。體外研究表明,在一定的生理應(yīng)激范圍內(nèi),健康hPDLCs能發(fā)生成骨分化[10]。然而,更高的牙齒負(fù)荷和PDL中相關(guān)的應(yīng)力增加會導(dǎo)致局部缺氧和液體流動(dòng),從而引發(fā)無菌性炎癥反應(yīng)[11],誘發(fā)破骨細(xì)胞因子,引起牙周組織和骨組織損傷[12]。本實(shí)驗(yàn)參照Nakajima等[13]的二維重力加載加壓培養(yǎng)模型,選擇49、196和392 Pa作為加載壓力大小。通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)hPDLCs受到196 Pa和392 Pa壓力后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,突起增多,這提示細(xì)胞分泌能力增強(qiáng),可能與細(xì)胞受力后炎癥、骨吸收等各種因子高表達(dá)有關(guān)。

破骨細(xì)胞的形成主要受RANK/RANKL通路激活的控制。RANKL負(fù)責(zé)破骨細(xì)胞的分化、激活和存活,通過增加功能性破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性來促進(jìn)骨吸收[14]。這一過程可以被其可溶性拮抗劑骨保護(hù)素(OPG)所抑制,OPG可通與過RANKL結(jié)合來抵消RANKL的作用,因此,OPG可以阻止破骨細(xì)胞的分化和活化[15]。本研究結(jié)果顯示細(xì)胞在受壓力過大(≥196 Pa),RANKL表達(dá)增加,OPG表達(dá)減小,且在有細(xì)菌上清液存在情況下趨勢更明顯。

RANKL有兩種不同的形式:可溶性RANKL(sRANKL)和膜結(jié)合RANKL(mRANKL)。sRANKL和mRANKL的主要區(qū)別在于,mRANKL是在細(xì)胞膜上以結(jié)合的形式被發(fā)現(xiàn)的,并通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸發(fā)揮作用,而sRANKL從細(xì)胞的細(xì)胞膜上分離出來,在細(xì)胞外環(huán)境中被發(fā)現(xiàn),它通過擴(kuò)散參與破骨細(xì)胞的形成,而不需要細(xì)胞間的溝通[16]。mRANKL和sRANKL都有助于破骨細(xì)胞的形成[17]。有報(bào)道稱sRANKL不像mRANKL那樣在破骨細(xì)胞形成中起主要作用,但它是破骨細(xì)胞成熟和正常功能[18]所必需的。盡管這兩種形式都具有生物活性,但膜結(jié)合蛋白似乎是一種穩(wěn)態(tài)形式,而sRANKL的產(chǎn)生則是病理/非生理?xiàng)l件下的信號[19]。因此,本研究在蛋白表達(dá)著重檢測sRANKL,研究發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)趨勢與mRNA基本一致,在196 Pa壓力組,sRANKL的增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與sRANKL的延時(shí)分泌有一定關(guān)系。本研究采用重物靜壓力加載裝置,此方法在加力大小的控制上較精準(zhǔn)。但在實(shí)際咀嚼過程中,牙周膜所承受的力是不連續(xù)的,并非不可改變。因此本實(shí)驗(yàn)采用的加力裝置存在一定不足。

研究表明過大壓力可顯著增加骨吸收因子的釋放,糞腸球菌上清液可進(jìn)一步加重這種作用。這為難治性根尖周炎治療過程中臨床調(diào)以及愈合期的其他治療(例如正畸、修復(fù)等)提供臨床參考。