潘劍茹，韓亞南，何夏琪，葉小強(qiáng)，何火聰

0 引言

活性氧（reactive oxygen species, ROS）是包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等在內(nèi)氧的還原產(chǎn)物的統(tǒng)稱。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS會損傷胞內(nèi)重要的生物大分子（如蛋白質(zhì)和DNA等），稱為氧化損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是機(jī)體中唯一可以清除O2·-的抗氧化酶，在所有生物中都不可或缺。人體細(xì)胞中定位于線粒體的MnSOD（SOD2）在細(xì)胞中以N端前導(dǎo)肽線粒體靶向序列（mitochondrion targeting sequence, MTS）加成熟SOD2組成的前體蛋白形式合成，MTS將前體蛋白引導(dǎo)進(jìn)線粒體基質(zhì)后被降解，從而生成具有酶活性的成熟SOD2[1]。因此現(xiàn)有的人源SOD2重組蛋白都以成熟SOD2的方式進(jìn)行生產(chǎn)，已知的SOD2結(jié)構(gòu)也均源于成熟SOD2。然而，人們在人脂肪肉瘤細(xì)胞LSA中發(fā)現(xiàn)了一種30 kDa的人源SOD2異構(gòu)體 （LSA-type-Mn-SOD），該類型SOD2以攜帶MTS前導(dǎo)肽的形式存在，并且MTS前導(dǎo)肽具有介導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力[2]。

雖然成熟SOD2早已被證明是一種強(qiáng)大的保護(hù)和治療劑，可用于抗氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如腎損傷[3]以及電離輻射所引起的輻射損傷[4]等，但失去MTS前導(dǎo)肽的SOD2受其分子量限制也失去了跨膜進(jìn)入細(xì)胞的能力，無法清除細(xì)胞內(nèi)的多余自由基。然而，氧化損傷的根源來自細(xì)胞內(nèi)積累的多余自由基。例如化療藥順鉑（DDP），臨床上常用于治療卵巢癌、肝癌和肺癌等惡性腫瘤[5-7]，其會在胞內(nèi)產(chǎn)生大量的O2·-和·OH，這些ROS在殺死腫瘤細(xì)胞的同時也會引起機(jī)體正常細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致化療不良反應(yīng)，如化療性腎損傷[8-9]。

因此，為充分發(fā)揮SOD2的抗氧化性能，本研究前期合成了源于人肝細(xì)胞的SOD2全長基因，得到25 kDa帶有MTS前導(dǎo)肽的全長SOD2重組蛋白（MTS-SOD2），證實其也具有跨膜活性，且在生理條件下具有良好的SOD活力[10]。鑒于MTS前導(dǎo)肽的分子量約2 kDa，其與SOD2的融合是否會影響SOD2的結(jié)構(gòu)與功能呢？為此，本研究擬進(jìn)一步探究前導(dǎo)肽MTS對SOD2結(jié)構(gòu)以及抗DDP誘導(dǎo)的腎損傷能力的影響，并對比MTS-SOD2與臨床使用化療防護(hù)劑阿米福?。ˋMFT）的作用效果，為MTS-SOD2的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及實驗動物

GST-SOD2及GST-MTS-SOD2重組菌株均為本實驗室構(gòu)建并保存。昆明（KM）小鼠（雄性，6周齡，體質(zhì)量約18±1 g）購自福建吳氏實驗動物公司，動物實驗遵守相關(guān)實驗動物福利規(guī)定，動物實驗方案經(jīng)福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為科審2019-SG-165。

1.2 主要試劑

牛凝血酶購自北京博爾西科技有限公司；注射用阿米福?。ㄌ斓剡_(dá)）購自南京綠葉制藥有限公司；DDP購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；BCA蛋白含量測定試劑盒購自美國Thermo公司；SOD、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 MTS-SOD2結(jié)構(gòu)預(yù)測

以PDB數(shù)據(jù)庫中人源成熟SOD2晶體結(jié)構(gòu)5vf9為模板，利用同源建模軟件Modeller 10.1構(gòu)建MTS-SOD2三級結(jié)構(gòu)，通過loop區(qū)優(yōu)化得到最終模型后用SAVES評估預(yù)測結(jié)構(gòu)的質(zhì)量（http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/）。以PyMOL繪制并比較SOD2和MTS-SOD2三維結(jié)構(gòu)。

1.4 SOD2和MTS-SOD2重組蛋白的制備

參照文獻(xiàn)[10]分別制備得到SOD2（簡稱S）與MTS-SOD2（簡稱MS）重組蛋白。以試劑盒分別測定重組蛋白的蛋白含量和SOD活力。最終純化得到SOD2與MTS-SOD2重組蛋白的SOD比活力分別為（1740±60）U/mg和（1980±70）U/mg。

1.5 MTS-SOD2重組蛋白抗DDP誘導(dǎo)的腎損傷效應(yīng)

1.5.1 實驗分組 將KM小鼠隨機(jī)分為7組，每組8只。正常組（Untred）僅注射PBS；另外6組分別為單純DDP損傷組（Ctrl）、SOD2+DDP組（S）、M T S-S O D 2（低、中和高劑量）+DDP組（MS-L、MS-M和MS-H）、陽性對照AMFT+DDP組（AMFT）。實驗分組、給藥劑量及流程，見圖1。

圖1 小鼠實驗設(shè)計圖Figure 1 Schematic of the mice experiment

1.5.2 小鼠腎功能測定 小鼠經(jīng)眼框取血后收集血清，按試劑盒說明書方法檢測血清BUN和Cr水平。

1.5.3 小鼠腎臟指數(shù)分析 小鼠處死后，切除腎臟組織并拍照、稱重，小鼠腎臟指數(shù)（renal index）按以下公式計算：Renal index（%）=（腎臟質(zhì)量/小鼠處死前體質(zhì)量）×100%。

1.5.4 小鼠腎臟抗氧化指標(biāo)測定 取適量腎臟組織按照9倍質(zhì)量比加入0.9%氯化鈉溶液，勻漿，離心取上清液，試劑盒法分別檢測腎臟MDA水平、GSH-Px活力、CAT活力、SOD活力及T-AOC。

1.5.5 小鼠腎臟組織病理分析 取腎臟組織制成石蠟切片，并用蘇木精和曙紅（HE）染色，然后使用正置顯微鏡（×200）進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 前導(dǎo)肽MTS對SOD2結(jié)構(gòu)的影響

MTS-SOD2單體的預(yù)測結(jié)構(gòu)見圖2A，包含兩個結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域由2個長的反平行螺旋所占據(jù)，C端結(jié)構(gòu)域是一個α+β桶結(jié)構(gòu)，其中還包含有一個三鏈折疊，前導(dǎo)肽MTS以無規(guī)卷曲的方式位于N末端。SAVES軟件分析結(jié)果顯示該預(yù)測模型的結(jié)構(gòu)較為合理。由圖2B可知，預(yù)測所得的MTSSOD2整體結(jié)構(gòu)與成熟SOD2的結(jié)構(gòu)十分相似，二者的C端結(jié)構(gòu)域基本重合，但N端結(jié)構(gòu)域中的兩個α-螺旋則產(chǎn)生了較大的偏移。在成熟SOD2單體的活性部位，Mn原子都具有4個配位殘基，其中3個His和1個Asp，MTS-SOD2活性中心的4個配位殘基與成熟SOD2相比都發(fā)生了一定程度的偏轉(zhuǎn)，見圖2C。

圖2 MTS-SOD2單體三級結(jié)構(gòu)模擬圖Figure 2 Simulated 3D structure of MTS-SOD2 monomer

2.2 MTS-SOD2重組蛋白抗DDP誘導(dǎo)的腎損傷效應(yīng)

2.2.1 對損傷鼠腎功能的影響 BUN和Cr是腎功能的重要指標(biāo)，可直接體現(xiàn)腎臟中腎小球的濾過功能。由圖3可知，DDP損傷使小鼠BUN和Cr水平分別提高了2.1倍和1.1倍（P＜0.0001）。與Ctrl組相比，AMFT組損傷鼠的BUN和Cr水平均顯著降低（P＜0.0001），預(yù)給予SOD2（S組）對損傷鼠的Cr和BUN水平均無保護(hù)作用，三種劑量的MTS-SOD2均可顯著降低損傷鼠BUN水平（P＜0.001），但僅MS-M組可同時顯著下降損傷鼠的Cr水平（P＜0.01）。

圖3 MTS-SOD2對DDP損傷鼠BUN(A)及Cr水平(B)的影響Figure 3 Effect of MTS-SOD2 on BUN(A) and Cr level(B)in DDP-injured mice

2.2.2 損傷鼠腎臟指數(shù)、表觀及病理分析 結(jié)果表明，DDP不會對各組小鼠的腎臟大小產(chǎn)生顯著影響，見圖4A，但腎臟的表觀色澤和組織結(jié)構(gòu)有改變。DDP使損傷鼠（Ctrl組）腎臟顏色由紅轉(zhuǎn)白，組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤（圖中白色箭頭標(biāo)示），腎間質(zhì)水腫，以及腎小管上皮細(xì)胞脫落。與Ctrl組相比，S組小鼠腎臟表觀及組織結(jié)構(gòu)均無改善，AMFT組和MS蛋白組損傷鼠的腎臟顏色和組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)，其中以MS-M組效果最佳，該組損傷鼠腎臟色澤基本恢復(fù)至正常鼠水平，見圖4B。

圖4 MTS-SOD2對DDP損傷小鼠的腎臟指數(shù)(A)和腎臟表觀及病理(B)的影響Figure 4 Effect of MTS-SOD2 recombinant protein on kidney index(A), appearance, and pathology changes(B) in DDPinjured mice

2.2.3 對損傷鼠腎臟抗氧化體系的影響 臟器組織抗氧化體系平衡的變化可反映該臟器組織因氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的氧化損傷程度。其中MDA水平反映了機(jī)體組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，是組織細(xì)胞內(nèi)ROS水平的間接指標(biāo)，T-AOC活力則可反映組織細(xì)胞整體的抗氧化能力。由圖5可知，與Untred組相比，DDP損傷使Ctrl組小鼠腎臟MDA水平顯著上升（P＜0.01），T-AOC、SOD和GSHPx水平顯著下降（P＜0.01），而CAT水平則無顯著變化（P＞0.05）。與Ctrl組相比，S組損傷鼠腎臟的各個抗氧化指標(biāo)均無改善，AMFT組和MS組損傷鼠腎臟的抗氧化指標(biāo)則有不同程度的改善。MS組中MS-M組的作用效果最好，該組別與AMFT組的損傷鼠腎臟MDA水平較Ctrl組均顯著降低（P＜0.05），T-AOC水平均顯著提高（P＜0.0001，P＜0.01），GSH-PX活力均有所增加，但都無顯著性。但與Ctrl組相比，則僅有MS-M組和MS-H組損傷鼠腎臟的SOD活力顯著升高（P＜0.05）。

圖5 MTS-SOD2對DDP損傷小鼠腎臟MDA水平(A)、T-AOC(B)、SOD活力(C)、GSH-PX活力(D)和CAT活力(E)的影響Figure 5 Effect of MTS-SOD2 pretreatment on MDA level (A), T-AOC(B), SOD activity(C), GSH-PX activity(D), and CAT activity(E) of kidney in DDP-injured mice

3 討論

DDP是使用最廣泛和最有效的化療藥物之一，但其同時還會導(dǎo)致ROS依賴性腎小管損傷和腎凋亡[11]，而O2·-是導(dǎo)致?lián)p傷的關(guān)鍵ROS[9]。

既然DDP所致腎損傷根源于ROS所致的氧化損傷，那可清除ROS的物質(zhì)就可預(yù)防DDP所致氧化損傷。小分子抗氧化劑是通過中和ROS來產(chǎn)生抗氧化效應(yīng)，小分子抗氧化劑如維生素C和維生素E已被證明可以改善由DDP誘導(dǎo)的健康大鼠和小鼠的腎毒性和氧化損傷，但研究同時表明使用維生素降低DDP損傷的作用是劑量依賴性的[12-13]。大劑量使用維生素C會引起人體消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的不良反應(yīng)[14]。而大量服用維生素E可能導(dǎo)致生殖功能障礙、肌酸尿、胃腸道不適、疲倦乏力、下肢水腫等不良反應(yīng)[15]。

AMFT是FDA唯一批準(zhǔn)用于預(yù)防DDP誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌和晚期卵巢癌患者腎毒性的藥物[16-17]。它是一種有機(jī)硫化磷化合物，是小分子抗氧化劑的代表，可直接與烷化劑、鉑類化療藥物等的活化代謝產(chǎn)物結(jié)合，從而降低化療藥物毒性的作用，但是多年的臨床研究發(fā)現(xiàn)AMFT會引起患者的口干、頭暈、惡心和嘔吐等不良反應(yīng)，使其在臨床的使用受限[18]。

與小分子抗氧化劑相比，抗氧化酶則是作為生物催化劑清除ROS，自身不參與反應(yīng)，因此其清除ROS的能力具有高效性，使用劑量遠(yuǎn)小于小分子抗氧化劑，這也使其具有更好的使用安全性。然而，與小分子抗氧化劑相比，天然抗氧化酶無法進(jìn)入細(xì)胞，清除胞內(nèi)多余的ROS致使其在抗機(jī)體氧化損傷中的應(yīng)用受限。

在眾多的抗氧化酶中，SOD是唯一一類可以清除O2·-的天然酶，由于線粒體是O2·-的發(fā)源地，因此位處線粒體的SOD2最為重要。在前期研究中，我們通過基因重組得到具有SOD2活力的可跨膜MTS-SOD2重組蛋白[10]。本研究首先通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)MTS-SOD2的整體三級結(jié)構(gòu)與成熟SOD2的十分相似，但MTS會對SOD2的部分二級結(jié)構(gòu)造成影響，進(jìn)而使SOD2活性中心與Mn原子配位的關(guān)鍵殘基發(fā)生偏轉(zhuǎn)。由于MTS-SOD2具有高于成熟SOD2的比活力，可推測MTS前導(dǎo)肽所帶來的結(jié)構(gòu)變化對SOD2的活性具有積極的促進(jìn)作用。未來將進(jìn)一步測定MTS-SOD2晶體結(jié)構(gòu)，深入分析MTS前導(dǎo)肽提高SOD2蛋白SOD活性的原因。

此外，本研究結(jié)果證實了能進(jìn)入細(xì)胞是抗氧化酶可充分發(fā)揮其抗D D P 誘導(dǎo)的氧化損傷作用的關(guān)鍵。在使用D D P 之前預(yù)給予中劑量（0.84 mg/kg）可跨膜的MTS-SOD2可以顯著降低損傷鼠腎臟組織MDA水平，顯著提高損傷鼠腎臟組織SOD的活力，從而顯著提高T-AOC活力，進(jìn)而改善腎臟組織病理變化，恢復(fù)損傷鼠腎功能。預(yù)給予0.84 mg/kg MTS-SOD2的整體保護(hù)效果與200 mg/kg的AMFT相當(dāng)甚至優(yōu)于后者。然而，預(yù)給予同樣劑量無MTS前導(dǎo)肽的SOD2卻基本無效。由于酶的活性都具有高度的專一性，本研究結(jié)果也證實了DDP誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS中最為重要的是O2·-。

由于多數(shù)化療藥以及放射治療都是通過誘導(dǎo)生成ROS導(dǎo)致正常細(xì)胞的氧化損傷而形成放化療不良反應(yīng)，相較于需要大劑量使用的小分子抗氧化劑，具有高度專一性和高效的MTS-SOD2無疑更具有成為新型放化療防護(hù)劑的潛力。未來將進(jìn)一步探究MTS-SOD2蛋白抗DDP損傷的分子機(jī)制及使用安全性。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。