陳嘉興，許霞青，張旗

0 引言

食管癌（esophageal cancer, EC）是常見的惡性消化道腫瘤，據(jù)2020年統(tǒng)計，其發(fā)病率和死亡率分別位于全球腫瘤病例的第7位和第6位[1]。在我國，食管癌的主要病理分型是食管鱗狀細(xì)胞癌，目前臨床上治療食管癌的主要手段是手術(shù)切除。對于早期食管鱗狀細(xì)胞癌，主要通過內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)（endoscopic mucosal resection, EMR）或內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection,ESD）進(jìn)行治療[2]。傳統(tǒng)化療也是臨床上治療食管鱗狀細(xì)胞癌常用方法，常用的化療藥物有順鉑、5-Fu、多西他賽、奈達(dá)鉑等[3-5]。此外，新輔助化療、放療以及基于PD-1/PD-L1的免疫療法也被用于食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）的治療[6]，但對于晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者，原發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的頻率約為60%[7]，且患者的5年生存率＜30%[8]。因此，探索低濃度且具有高抑癌作用、高特異性的化合物對食管鱗狀細(xì)胞癌的治療有著重要意義。

小分子抑制劑CIL56又稱CA3，結(jié)構(gòu)見圖1A。Song等研究報道小分子抑制劑CA3在體外和體內(nèi)實驗中均能顯著抑制食管腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)食管腺癌細(xì)胞凋亡[9]。本課題組通過前期篩選發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CIL56能夠顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞的增殖（該研究目前還未發(fā)表）?；诖耍狙芯恳允彻荀[狀細(xì)胞癌TE-1、KYSE-140、KYSE-150細(xì)胞為研究對象，探討CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖抑制作用及相關(guān)作用機(jī)制，為CIL56在食管鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

圖1 CIL56分子式(A)及CIL56作用72h對食管鱗狀細(xì)胞癌增殖(B)的影響Figure 1 Molecular formula(A) of CIL56 and Effect of CIL56 treatment for 72h on proliferation(B) of esophageal squamous cell carcinoma

圖2 光學(xué)顯微鏡下CIL56作用24h對食管鱗狀細(xì)胞癌增殖作用的影響Figure 2 Effect of CIL56 treatment for 24h on proliferation of esophageal squamous cell carcinoma under an optical microscope

圖3 平板克隆實驗顯示CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌增殖作用的影響Figure 3 Effect of CIL56 on proliferation of esophageal squamous cell carcinoma detected by plate-cloning method

1 材料與方法

1.1 材料

小分子抑制劑CIL56購自陶術(shù)生物公司（貨號T4309）。人食管鱗狀癌細(xì)胞株TE-1、KYSE-140、KYSE-150購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。總谷胱甘肽檢測試劑盒（Total Glutathione Assay Kit）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號S0052）。胎牛血清購自賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司（貨號FSP500-12J269）、RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司 （貨號31800-500 ml）、鐵離子比色法檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司（貨號 E1042）。xCT抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（貨號ab175186）、GPX4抗體購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司（貨號T56959M）、YAP1抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（貨號13584-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗狀癌細(xì)胞株TE-1、KYSE-140、KYSE-150均使用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基，在多功能生物培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度）中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 磺酰羅丹明B比色法（SRB）取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)后平均每孔鋪3 500個細(xì)胞過夜培養(yǎng)（96孔板）。待細(xì)胞培養(yǎng)板取出后，將孔中培養(yǎng)基一并倒掉，每孔加入60～70 μl的10%（w/v）三氯乙酸溶液（4℃預(yù)冷），在4℃冰箱中過夜固定。用去離子水沖洗5～7 次，注意不要沖到細(xì)胞，于37℃恒溫烘干箱中烘干。待完全烘干后，每孔加入50 μl磺酰羅丹明B染液，室溫染色30分鐘。使用1%（v/v）乙酸溶液沖洗，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板倒扣在吸水紙上無色時即可放置37℃恒溫烘干箱中烘干。每孔加入100 μl的0.01 mmol/L Tris-base溶液，于全波長酶標(biāo)儀中振蕩10分鐘，在540 nm處測定吸光度。

1.2.3 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)后平均每孔鋪3 000/6 000個細(xì)胞過夜培養(yǎng)（6孔板）。每孔各加入2 ml含藥培養(yǎng)基，每隔3～4天換一次液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周左右。取出后使用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗細(xì)胞2次，每孔加入1 ml 10%福爾馬林溶液，室溫固定1 h；用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗后，每孔加入1 ml 0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30分鐘后用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗，室溫晾干后拍照記錄。

1.2.4 劃痕愈合實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，計數(shù)后平均每孔鋪適量細(xì)胞過夜培養(yǎng)（24 孔板）。利用直尺作參考，使用200 μl無菌槍頭沿直尺劃痕，使用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗細(xì)胞2次，隨后加入1 ml含藥培養(yǎng)基（2%胎牛血清），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在顯微鏡（10×物鏡）下標(biāo)記出劃痕范圍并拍照。于0、12、24、48 h拍照記錄。

1.2.5 鐵離子濃度檢測 使用0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L的CIL56處理細(xì)胞24 h后（24孔板），用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗細(xì)胞2遍，棄去洗液。每孔加入200 μl細(xì)胞裂解液，室溫振蕩裂解2 h。按照說明書配好標(biāo)準(zhǔn)品與混液A，每個1.5 ml離心管中加入100 μl混液A、100 μl的標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，混勻后于60℃水浴中加熱1 h，冷卻至室溫后瞬離；每孔加入30 μl的鐵離子檢測試劑，混勻后室溫孵育30分鐘；取200 μl用高通量超微量分光光度計在550 nm處測定吸光度；余下細(xì)胞液做BCA蛋白濃度測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算鐵離子濃度。

1.2.6 總谷胱甘肽含量檢測 根據(jù)試劑盒說明書配制試劑和標(biāo)準(zhǔn)品。稱量空管重量，胰酶消化后收集細(xì)胞，1 000 r/min、離心5分鐘。使用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗細(xì)胞沉淀1次，待吸凈PBS后稱重，扣除空管重量并記錄；加入細(xì)胞沉淀三倍體積的蛋白去除劑s溶液（10 mg細(xì)胞沉淀相當(dāng)于10 μl），于液氮和37℃水浴中對樣品進(jìn)行兩次快速凍融；冰上放置5分鐘，4℃微量離心機(jī)、10 000 g離心10分鐘，取上清并按試劑盒操作說明測定細(xì)胞總谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量。樣品5倍稀釋，室溫孵育25分鐘后在412 nm處測定樣品吸光度。

1.2.7 Western blot檢測 細(xì)胞總蛋白提?。菏褂?.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L的CIL56處理細(xì)胞24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用1×PBS（4℃預(yù)冷）清洗細(xì)胞2次，棄去洗液。加入適量的2.5×緩沖液于冰上裂解10分鐘，收集到1.5 ml離心管中瞬離，100℃金屬浴5～10分鐘。室溫冷卻后，瞬離，保存在-80℃低溫冰箱。

使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝膠進(jìn)行電泳分離；恒流轉(zhuǎn)?。?.5%脫脂牛奶（1×TBST配制）室溫封閉2 h；目的蛋白一抗稀釋液（0.5%脫脂牛奶配制）4℃孵育過夜，1×TBST（4℃預(yù)冷）清洗3次、10分鐘/次；室溫孵育相應(yīng)二抗1 h（0.5%脫脂牛奶配制），使用1 ×TBST（4℃預(yù)冷）清洗3次、10分鐘/次；使用ECL超敏發(fā)光液于多功能成像儀中顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

圖像分析使用Image J軟件；實驗數(shù)據(jù)分析用SPSS20.0和GraphPad Prism 8軟件；采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIL56顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖

SRB檢測、光學(xué)顯微鏡觀察和平板克隆方法檢測結(jié)果顯示，CIL56能顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖（均P＜0.05），且呈濃度依賴性，見圖1B,2～3。CIL56對TE-1、KYSE-140、KYSE-150三株細(xì)胞的IC50值分別為0.502、0.534、0.908 μmol/L。

2.2 CIL56抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞遷移

結(jié)合2.1三株細(xì)胞增殖實驗數(shù)據(jù)，選擇殺傷作用最小的濃度進(jìn)行劃痕愈合實驗。結(jié)果顯示0.2 μmol/L的CIL56能夠顯著抑制TE-1、KYSE-150、KYSE-140細(xì)胞的遷移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）且在該濃度作用下對這三株細(xì)胞的增殖無顯著影響，見圖4。

圖4 0.2μmol/L CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌遷移作用的影響Figure 4 Effect of 0.2μmol/L CIL56 on migration of esophageal squamous cell carcinoma

2.3 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌中鐵離子及GSH濃度的影響

給予不同濃度的CIL56作用24 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，在TE-1細(xì)胞中鐵離子的含量在0.4 μmol/L上升了13.29%（P＜0.05），KYSE-140在0.6 μmol/L上升了16.79%（P＜0.01），KYSE-150在0.8 μmol/L上升了33.40%（P＜0.01）。給予不同濃度CIL56作用這三株細(xì)胞12 h，結(jié)果顯示，在TE-1細(xì)胞中隨著CIL56濃度的增加，GSH濃度隨之明顯降低，而在另兩株細(xì)胞中也能降低細(xì)胞內(nèi)GSH濃度（均P＜0.01），見圖5。

圖5 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌中鐵離子及GSH濃度的影響Figure 5 Effect of CIL56 on iron concentration and GSH concentration in esophageal squamous cell carcinoma

2.4 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌中xCT及GPX4蛋白表達(dá)的影響

梯 度 濃 度 的C I L 5 6 作 用2 4 h 后，T E-1、KYSE-150、KYSE-140細(xì)胞中xCT及GPX4蛋白的表達(dá)顯著降低（均P＜0.05），見圖6。

圖6 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌xCT和GPX4蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of CIL56 on xCT and GPX4 protein expression in esophageal squamous cell carcinoma

2.5 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌中YAP1蛋白表達(dá)的影響

濃度梯度的CIL56作用24 h，結(jié)果顯示，CIL56明顯抑制TE-1、KYSE-150、KYSE-140細(xì)胞中YAP1蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），見圖7。

圖7 CIL56對食管鱗狀細(xì)胞癌YAP1蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of CIL56 on YAP1 protein expression in esophageal squamous cell carcinoma

3 討論

目前臨床上食管鱗狀細(xì)胞癌治療方法主要為手術(shù)切除、放療、化療等。雖然這些治療措施在不斷發(fā)展和完善，但是晚期ESCC的患者預(yù)后仍不理想，總體5年生存率低。因此，探索高效、高特異性的小分子化合物對食管癌的治療有著重要意義。我們通過前期篩選發(fā)現(xiàn)小分子化合物CIL56能夠顯著抑制ESCC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)ESCC細(xì)胞死亡。且本研究發(fā)現(xiàn)ESCC細(xì)胞中，給予CIL56能夠下調(diào)GPX4和xCT蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度、降低GSH的水平，這提示CIL56可能誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

鐵死亡是一種鐵離子依賴的非細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡方式，伴隨著膜脂質(zhì)過氧化（lipid peroxidation, LPO）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）產(chǎn)生而引起的特定形式的細(xì)胞死亡[10]。鐵死亡被誘導(dǎo)之后，會引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，比如細(xì)胞體積縮小、線粒體形態(tài)發(fā)生變化，以及GSH耗竭、GPX4表達(dá)降低、ROS產(chǎn)生等[11]。大量研究表明，鐵死亡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)，靶向其信號通路中的關(guān)鍵蛋白或可成為病情緩解的關(guān)鍵。已有研究報道在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中，如肝癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、胰腺癌[15]、胃癌[16]等腫瘤中鐵死亡被抑制。即在這些腫瘤細(xì)胞中，胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)xCT被激活，GSH的代謝和CPX4的活性增加，LOP和鐵離子的代謝被抑制等。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡是腫瘤治療的有效策略。

研究表明，細(xì)胞GSH耗竭或GPX4失活都能誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17-19]。CIL56被報道是鐵死亡誘導(dǎo)劑[20]。本研究發(fā)現(xiàn)CIL56能夠顯著抑制GPX4的表達(dá)、抑制細(xì)胞中GSH的濃度。在細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時，胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)xCT發(fā)揮重要作用[21]。小分子化合物Erastin不可逆轉(zhuǎn)地抑制xCT活性，這是其誘導(dǎo)鐵死亡的重要機(jī)制之一。本研究中小分子化合物CIL56也能夠抑制ESCC中xCT蛋白的表達(dá)，這也可能是其促進(jìn)ESCC發(fā)生鐵死亡的機(jī)制之一。

此外，CIL56作為一種新的YAP1蛋白抑制劑，Morice等報道，在骨肉瘤中，CIL56通過抑制YAP/Tead的轉(zhuǎn)錄活性，減少YAP蛋白的產(chǎn)生進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。另有研究報道發(fā)現(xiàn)低氧能誘導(dǎo)YAP蛋白表達(dá)，抑制其磷酸化，增強YAP轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，而CA3通過抑制YAP轉(zhuǎn)錄活性抑制該過程[22]。此外，Delvaux等在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中，給予YAP抑制劑verteporfin能夠顯著減少GSH的含量和GPX4蛋白水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，且該作用與YAP轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。而在GIST882和GIST48細(xì)胞中，給予CA3亦能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，但CA3并不抑制YAP轉(zhuǎn)錄活性，這提示在該過程中YAP可能不參與CA3誘導(dǎo)的鐵死亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)CIL56能夠抑制YAP蛋白的表達(dá)，這可能是其促進(jìn)ESCC發(fā)生細(xì)胞死亡的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物CIL56能夠顯著抑制ESCC的細(xì)胞增殖及遷移，其可能的作用機(jī)制是抑制ESCC細(xì)胞中xCT蛋白的表達(dá)和GPX4蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度，抑制細(xì)胞中GSH的濃度，同時抑制YAP蛋白的表達(dá)。本研究為小分子CIL56抑制劑在食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明無利益沖突。