陽鎮(zhèn)，李文川，周寧

0 引言

膽囊癌（gallbladder cancer, GBC）是一種極具轉移性的膽道惡性腫瘤，也是全球第五常見的消化道腫瘤[1-2]。近年來，盡管高通量芯片發(fā)現了上千種lncRNAs在膽囊癌樣本中呈差異表達[3]，但僅有少數lncRNAs的功能得到了比較詳細的闡明。胃癌增殖增強轉錄物1（gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1, GHET1）于2014年首次在胃癌研究中被發(fā)現具有促進細胞增殖的作用，隨后證實其在膀胱癌、乳腺癌以及宮頸癌中也發(fā)揮促癌作用[4]。miR-27b在多種腫瘤中低表達并發(fā)揮抑癌因子功能[5]，經相關公共數據庫與生物信息學分析，發(fā)現miR-27b可能受到GHET1的調控。有關GHET1與miR-27b在膽囊癌中的作用報道較少。鑒于此，本研究將明確GHET1對膽囊癌細胞生物學行為的影響及其對miR-27b的調控機制，以期為膽囊癌的診療提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNA提取試劑（Tiangen，北京），miRNA反轉錄試劑盒（Clontech，美國），普通反轉錄與實時熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本），Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，美國），胎牛血清（FBS）（Cell-Box，香港），MTT（Beyotime Biotechnology，上海），Transwell小室和基質膠（Corning，美國），熒光素酶檢測試劑盒（GeneCopoeia，美國），lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen，美國），si-NC載體、si-GHET1載體以及miR-27b抑制物（Bersinbio，廣州），GHET1-wt和GHET1-mut報告載體（Ribobio，廣州）。

1.2 臨床標本

收集2016年1月—2019年12月在湖南省人民醫(yī)院肝膽外科行手術治療的50例膽囊癌患者的癌組織與癌旁組織。其中男21例，女29例，年齡39～77歲（55.18±11.69歲）。所有患者術前均未接受放療、化療或其他抗癌治療。納入標準：原發(fā)性膽囊癌患者，經影像學檢查與病理檢查確診，并具有手術治療指征。排除標準：其他類型膽道腫瘤患者，嚴重心、肝、腎功能衰竭患者，出血性疾病或凝血功能嚴重異常患者，精神障礙疾病患者，伴有其他手術禁忌證患者。收集的組織存入液氮中備用。所有患者均簽署知情同意書。本研究通過湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會審批（倫理號2019009）。

1.3 細胞培養(yǎng)

SGC-996細胞來自中國科學院上海研究所細胞培養(yǎng)庫。采用DMEM培養(yǎng)基和10%FBS培養(yǎng)細胞，并加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素進行抑菌處理。細胞培養(yǎng)箱溫度設定為37℃，含5%CO2和95%空氣。每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，并進行常規(guī)傳代。待細胞狀態(tài)到達對數生長期時，進行體外細胞實驗。

1.4 實驗分組和細胞轉染

體外細胞實驗分成對照組、GHET1干擾組、miR-27b干擾組以及GHET1+miR-27b干擾組，分別向SGC-996細胞中轉染si-NC載體、si-GHET1載體、miR-27b抑制物以及si-GHET1載體+miR-27b抑制物。將SGC-996細胞均勻接種至6孔板，使每孔細胞數量約為5×106個。上述各組細胞培養(yǎng)24 h后，采用lipofectamine 2000轉染試劑分別瞬時轉染2.5 μg si-NC載體、2.5 μg si-GHET1載體、200 nmol miR-27b抑制物、2.5 μg si-GHET1載體+200 nmol miR-27b抑制物。24 h后1 200 r/min離心5 min，收集各組細胞，檢測轉染效率。

1.5 實時熒光定量PCR

采用RNA提取試劑提取組織與細胞中的總RNA。分別采用miRNA反轉錄與普通反轉錄試劑盒合成針對miR-27b和GHET1的cDNA。隨后以各自cDNA作為模版進行實時熒光定量PCR。擴增條件設為：95℃ 10 min，之后95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s、共40個循環(huán)，隨后72℃ 5 min，最后4℃ 20 min。miR-27b引物：5’-TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC-3’（正向），5’-CGCAGGGTCCG A G G TATTC-3’（反向）。G H E T1 引物：5’-CTTGAGCCTCAGTTTCTCCATC-3’（正向），5’-CTTGCTAATTTGAGTTCCTCGT-3’（反向）。采用2-ΔΔCt法，分別以U6和GAPDH為內參基因計算miR-27b和GHET1相對表達水平。

1.6 MTT法檢測細胞增殖

將1.4方法中的細胞均勻接種至96孔板，使每孔細胞數量約為3×103個。在0、12、24和48 h時間點向對應孔中加入13 μl MTT（濃度：5 mg/ml）。培養(yǎng)4 h后，再向對應孔中加入150 μl二甲基亞砜。室溫低速搖晃15 min致結晶完全溶解。采用酶標儀測量各孔在450 nm處的吸光度（OD）值，比較各組細胞增殖情況。

1.7 Transwell試驗檢測細胞轉移

利用基質膠均勻覆蓋Transwell上室，并將1.4方法中的細胞均勻接種至上室，細胞數量約為5×105個。下室中添加500 μl DMEM培養(yǎng)基+10%FBS充當引誘劑。48 h后使用無菌棉條輕輕擦掉上室中的細胞，將轉移至下室中細胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min。隨后采用0.1%結晶紫溶液室溫染色10 min，并采用IX71倒置顯微鏡觀察拍照，隨機選擇6處視野計算每個視野下轉移細胞數。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

將1.4方法中的細胞均勻接種至12孔板，使每孔細胞數量約為2.5×106個。48 h后1 200 r/min離心5 min收集細胞，以冷PBS洗滌三次。采用適量結合液將細胞重新懸浮，使其密度為1×106/ml。取1 ml細胞，加入5 μl Annexin V-FITC室溫避光染色30 min。再加入2 μl碘化丙啶（PI）室溫避光染色20 min，采用流式細胞儀比較各組細胞凋亡率。

1.9 熒光素酶報告基因實驗檢測GHET1與miR-27b的結合位點情況

GHET1-wt報告載體（ACUGUGA）中包含miR-27b預測結合位點，而GHET1-mut報告載體中（將ACUGUGA突變成UGACACU）不含miR-27b預測結合位點。將SGC-996細胞均勻接種至24孔板，使每孔細胞數量約為4×105個。培養(yǎng)24 h后，采用Lipofectamine 2000轉染試劑瞬時共轉染50 nmol miR-27b抑制物和0.8 μg GHET1-wt報告載體，0 nmol miR-27b抑制物和0.8 μg GHET1-mut報告載體。48 h后1 200 r/min離心5 min收集細胞，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測各組海腎和螢火蟲的熒光值。以螢火蟲的熒光值為參照，比較各組相對熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS27.0與GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析，每種試驗獨立重復3次。計數資料結果用例（%）表示，以卡方檢驗進行統(tǒng)計比較。計量資料結果采用（x±s）表示，癌與癌旁組織中GHET1與miR-27b的表達比較采用配對t檢驗，其他兩組之間的統(tǒng)計比較采用獨立樣本t檢驗。三組或三組以上之間的統(tǒng)計比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。采用Spearman相關系數檢驗評估GHET1與miR-27b表達之間的相關性。采用Kaplan-Meier曲線評估GHET1表達與膽囊癌患者預后的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GHET1與miR-27b在膽囊癌中的表達及其相關性

實時熒光定量PCR結果顯示，癌組織與癌旁組織中GHET1的相對表達水平分別為0.66±0.19和0.40±0.17，癌組織中GHET1表達較癌旁組織高（P＜0.001），見圖1A。癌組織與癌旁組織中miR-27b的相對表達水平分別為0.023±0.006和0.045±0.013，癌組織中miR-27b表達較癌旁組織低（P＜0.001），見圖1B。GHET1與miR-27b表達呈負相關，相關系數為-0.59（P＜0.001），見圖1C。

圖1 GHET1與miR-27b在膽囊癌中的表達(A, B)及其相關性(C)Figure 1 Expression of GHET1 and miR-27b in gallbladder cancer(A, B) and their correlation(C)

2.2 GHET1表達與膽囊癌患者臨床病理特征以及預后的關系

以癌組織中GHET1表達的中位數值（0.64）為臨界點，將膽囊癌患者分為GHET1低表達組（n=25）與GHET1高表達組（n=25）?？ǚ綑z驗結果顯示，GHET1表達與淋巴結轉移和TNM分期相關（P＜0.05），但與年齡、性別、腫瘤大小、病理類型以及組織學等級不相關（P＞0.05），見表1。與低GHET1表達膽囊癌患者比較，高GHET1表達膽囊癌患者兩年總體生存率較差（P＜0.001），見圖2。

表1 GHET1表達與膽囊癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between GHET1 expression and clinicopathological characteristics of GBC patients

圖2 Kaplan-Meier曲線分析GHET1表達與膽囊癌患者預后的關系Figure 2 Kaplan-Meier curve analysis of relationship between GHET1 expression and prognosis of GBC patients

2.3 細胞轉染效率檢測

實時熒光定量PCR結果顯示，與對照組比較，GHET1干擾組與GHET1+miR-27b干擾組中GHET1表達下降（P=0.012、0.015），表明si-GHET1載體對GHET1表達具有良好的抑制效果。與對照組比較，miR-27b干擾組與GHET1+miR-27b干擾組中miR-27b表達下降（P=0.007、＜0.001），表明miR-27b抑制物對miR-27b表達具有良好的抑制效果，見圖3。

圖3 各組細胞轉染效率檢測Figure 3 Transfection efficiency of cells in each group

2.4 抑制GHET1和miR-27b對SGC-996細胞增殖的影響

結果顯示，與對照組比較，GHET1干擾組12、24以及48 h細胞OD值下降（P=0.034、0.018、0.012），miR-27b干擾組12、24以及48 h細胞OD值升高（P=0.029、0.011、0.025）。與GHET1干擾組比較，GHET1+miR-27b干擾組12、24以及48 h細胞OD值升高（P=0.042、0.015、0.037），見圖4。該結果表明，抑制GHET1降低SGC-996細胞增殖，而抑制miR-27b促進SGC-996細胞增殖，并且抑制miR-27b可以逆轉抑制GHET1對SGC-996細胞增殖的影響。

圖4 抑制GHET1和miR-27b對SGC-996細胞增殖的影響Figure 4 Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on proliferation of SGC-996 cells

2.5 抑制GHET1和miR-27b對SGC-996細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，與對照組比較，GHET1干擾組中細胞凋亡率升高（P=0.019），miR-27b干擾組中細胞凋亡率降低（P=0.046）。與GHET1干擾組比較，GHET1+miR-27b干擾組中細胞凋亡率降低（P=0.015），見圖5。該結果表明，抑制GHET1增加SGC-996細胞凋亡，而抑制miR-27b降低SGC-996細胞凋亡，并且抑制miR-27b可以逆轉抑制GHET1對SGC-996細胞凋亡的影響。

圖5 抑 制G H E T 1 和m i R-2 7 b 對SGC-996細胞凋亡的影響Figure 5 Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on apoptosis of SGC-996 cells

2.6 抑制GHET1和miR-27b對SGC-996細胞轉移的影響

T r a n s w e l l 試驗結果顯示，與對照組比較，G H E T 1 干擾組中細胞轉移數量降低（P=0.033），miR-27b干擾組中細胞轉移數量升高（P=0.027）。與GHET1干擾組比較，GHET1+miR-27b干擾組中細胞轉移數量升高（P=0.031），見圖6。該結果表明，抑制GHET1降低SGC-996細胞轉移，而抑制miR-27b促進SGC-996細胞轉移，并且抑制miR-27b可以逆轉抑制GHET1對SGC-996細胞轉移的影響。

圖6 抑制GHET1和miR-27b對SGC-996細胞轉移的影響 (×400)Figure 6 Effect of inhibition of GHET1 and miR-27b on metastasis of SGC-996 cells (×400)

2.7 GHET1對miR-27b的調控作用

生物信息學分析結果顯示，GHET1中“ACUGUGA”序列與miR-27b中“UGACACU”序列完全互補配對；熒光素酶報告基因試驗結果顯示，與對照組比較，miR-27b干擾組中GHET1-wt報告載體的相對熒光素酶活性增加（P＜0.001），GHET1-mut報告載體的相對熒光素酶活性無明顯改變（P＞0.05）；實時熒光定量PCR結果顯示，對照組和GHET1干擾組中miR-27b的相對表達水平分別為1.0±0.08和2.53±0.29，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖7。該結果表明，GHET1可以海綿吸附miR-27b并抑制其表達。

圖7 GHET1對miR-27b的調控作用Figure 7 Regulation of GHET1 on miR-27b

3 討論

近年來，靶向表觀遺傳因子是治療疾病的一種新思路，尤其在惡性腫瘤中具有較大潛力。越來越多的證據顯示，lncRNAs作為一類表觀遺傳因子在膽囊癌中異常表達并影響腫瘤進展，了解其作用機制將為該病的治療提供新的分子靶點[6-7]。例如，Zhang等[8]報道H19在膽囊癌中表達上調，過表達H19可促進膽囊癌細胞增殖和轉移。Lu等[9]發(fā)現小核宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1, SNHG1）在膽囊癌中呈現高表達，抑制SNHG1可降低膽囊癌細胞增殖和轉移。Gao等[10]通過一系列細胞實驗證實沉默叉頭框蛋白D2相鄰相反鏈RNA 1（FOXD2 adjacent opposite strand RNA 1,FOXD2-AS1）可以使膽囊癌進展受到一定的抑制。此外，TTN反義RNA1（TTN antisense RNA 1,TTN-AS1）被報道在膽囊癌進展過程中發(fā)揮促癌因子作用[11]。GHET1定位于人染色體7q36.1位置，長度為1 903 nt。作為胃癌中研究最多的lncRNA之一，GHET1與細胞增殖、細胞周期、轉移以及多重耐藥密切相關[12-13]。本研究發(fā)現，GHET1促進膽囊癌細胞增殖和轉移并抑制細胞凋亡，有助于進一步完善GHET1在腫瘤中的功能注釋。

本研究首先分析GHET1在50例膽囊癌樣本中的表達，發(fā)現癌組織中該基因的表達高于癌旁組織，與其他腫瘤樣本中的表達基本一致[4]。隨后通過分析GHET1表達與膽囊癌患者預后的關系，發(fā)現高GHET1表達預示不良預后，提示GHET1可能用于監(jiān)測膽囊癌預后，但仍需要大樣本、多中心試驗驗證。此外，還發(fā)現GHET1表達與TNM分期和淋巴結轉移相關。該結果與已發(fā)表的Meta分析結果相符[14]。

GHET1相較其他的lncRNA表現出高穩(wěn)定性和特異性，在腫瘤治療方面顯示出較大的潛力。通過MTT法、流式細胞術以及Transwell試驗，本研究發(fā)現抑制GHET1可降低SGC-996細胞增殖和轉移，并增加細胞凋亡。該結果與Liu等[15]和Han等[16]結果一致，初步揭示GHET1在膽囊癌進展中發(fā)揮促癌因子作用。后續(xù)研究將在其他的膽囊癌細胞株如GBC-SD和NOZ中驗證該結果。

作為一種研究較多的miRNA，miR-27b在多種腫瘤中參與調控細胞生物學行為。例如，Bao等[17]報道m(xù)iR-27b通過激活Hippo信號通路抑制胃癌細胞轉移和上皮-間充質轉化。Li等[18]發(fā)現miR-27b靶向Engrailed同源盒蛋白2（engrailed homeobox 2,EN2）抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲。Miao等[19]發(fā)現miR-27b通過調控Yes相關蛋白1（Yes1 associated transcriptional regulator, YAP1）抑制膠質瘤細胞增殖和遷移并促進細胞凋亡。本研究發(fā)現miR-27b在膽囊癌組織的表達低于癌旁組織，與其他腫瘤中報道的結果一致[5]。隨后一系列體外細胞實驗結果證實，抑制miR-27b促進SGC-996細胞增殖和轉移并抑制細胞凋亡。由此初步表明，miR-27b在膽囊癌進展中發(fā)揮抑癌因子作用。需要注意的是，該結果需在GBC-SD和NOZ細胞株中進一步驗證。

研究表明，lncRNAs主要通過海綿吸附下游miRNAs而發(fā)揮轉錄調節(jié)作用[20]。鑒于GHET1與miR-27b在膽囊癌進展中的作用截然相反，且膽囊癌中GHET1與miR-27b表達呈負相關。另外，生物信息學預測顯示，GHET1中“ACUGUGA“序列可以與miR-27b中“UGACACU”序列特異性結合。基于以上證據，我們推測miR-27b可能受到GHET1直接調控。隨后經熒光素酶報告基因試驗證實，GHET1可以通過海綿吸附方式下調miR-27b表達。為了明確GHET1是否通過靶向miR-27b影響膽囊癌進展，我們在SGC-996細胞中同時抑制GHET1和miR-27b。結果發(fā)現，細胞增殖和轉移較單獨抑制GHET1增加，而細胞凋亡較單獨抑制GHET1降低，表明抑制miR-27b可以逆轉抑制GHET1對SGC-996細胞增殖、轉移以及凋亡的影響。后續(xù)將通過實驗在膽囊癌細胞中上調GHET1的同時上調miR-27b，觀察細胞增殖、轉移以及凋亡的改變。同時在動物模型中驗證GHET1/miR-27b軸對體內膽囊癌生長與轉移的影響。如果體內與體外功能一致，將來研發(fā)靶向GHET1的小分子藥物或許可以起到有效的抗癌作用。

綜上所述，GHET1在膽囊癌中表達上調，GHET1表達與TNM分期和淋巴結轉移相關，高GHET1表達預示不良預后。GHET1靶向miR-27b促進膽囊癌細胞增殖和轉移并抑制細胞凋亡，表明GHET1/miR-27b軸在膽囊癌進展中具有一定的作用。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。